无溶剂、叶酸修饰的纳米针用于靶向递送10-羟基喜树碱

摘要

传统纳米颗粒制备疏水性抗癌药物往往依赖有机溶剂，引发残留毒性担忧。本文展示了一种完全绿色的合成方法，制备叶酸修饰的10-羟基喜树碱（HCPT）纳米针（HFNDs），在消除有机溶剂的同时实现了高药物负载（70.2%）和强大的靶向能力。体外实验显示，HFNDs在HeLa细胞中的细胞摄取优于非靶向的壳聚糖-HCPT纳米针，MTT实验表明在同等HCPT剂量下细胞毒性增强。体内成像证实HFNDs在肿瘤中优先积累，HeLa异种移植瘤治疗研究显示显著的肿瘤抑制且全身毒性极小。这种无溶剂方法为安全、高效的化疗药物递送和成像提供了一个有前景的平台。

背景

过去二十年，研究致力于通过纳米颗粒递送系统克服传统化疗的药代动力学局限，提供长循环、主动靶向和多模态成像能力[1,2]。近期进展凸显了颗粒形状的重要性，高长径比纳米结构表现出增强的细胞内化和肿瘤穿透[10,26]。然而，大多数策略仍依赖有机溶剂溶解疏水性药物，导致残留溶剂担忧，可能在体内积累并构成安全风险[27]。本研究通过完全绿色、无溶剂的方法开发HCPT负载、叶酸修饰的纳米针，填补了这一空白，结合了高药物负载、靶向递送和成像潜力。

方法

材料

所有试剂均为分析纯，开封即用。全程使用去离子水。FA购自Bio Basic Inc.；HCPT（>99%纯度）购自丽珠制药；壳聚糖（Mw=70 kDa，90%脱乙酰）购自浙江奥星；NHS和EDC购自Sigma-Aldrich。

FA-壳聚糖共轭物的合成

FA（10 mg）、壳聚糖（20 mg）、EDC（4 mg）和NHS（4 mg）在2 mL PBS（pH 5.5）中室温搅拌12 h。混合液对pH 10缓冲液透析以除去过量FA，随后离心（5000 rpm）和冻干24 h，得CS-FA粉末。

HFNDs的制备

HCPT（10 μg）溶于200 μL 0.1 M NaOH（溶液A）；CS-FA（10 μg）溶于200 μL 0.1 M HCl（溶液B）。将溶液A和B在剧烈搅拌下滴加至1 mL纯水中30 s，然后超声（200 W，冰浴）6 min。所得悬液离心（10000 rpm，5 min）并冻干24 h。为对比，溶液B中用壳聚糖代替CS-FA制备非靶向纳米针（NDs）。

表征

SEM（UV-70，15 kV）观察形貌。粒径和Zeta电位用Malvern Zetasizer Nano-ZS测定。XRD（X'pert PRO）表征结晶度。FA含量用281 nm处UV定量；HCPT负载用383 nm处荧光定量。负载率和包封率按公式(1)-(4)计算。

$$\begin{aligned} \text{药物负载\%} &= \frac{\text{HFNDs中HCPT重量}}{\text{HFNDs重量}}\times100\%\;(1)\\ \text{包封率\%} &= \frac{\text{HFNDs中药物重量}}{\text{投料药物重量}}\times100\%\;(2)\\ \text{共轭物中FA\%} &= \frac{\text{共轭物中FA重量}}{\text{共轭物重量}}\times100\%\;(3)\\ \text{FA负载\%} &= (1-\text{HCPT负载\%})\times\text{共轭物中FA\%}\times100\%\;(4) \end{aligned}$$

体外药物释放研究

HFNDs分散于10 mL PBS，置于3 kDa MWCO透析袋中，浸入200 mL PBS（pH 7.4），37°C，100 rpm。48 h内定时取样，荧光光谱分析。

细胞共聚焦成像

HeLa细胞接种培养24 h后，与HFNDs共孵育8 h。Leica共聚焦显微镜成像（HCPT激发382 nm，发射500-550 nm）。

荧光法测定细胞摄取

用NDs或HFNDs（等量HCPT）孵育细胞6 h后，洗涤，胰蛋白酶/EDTA消化，超声破碎。荧光法（382 nm）定量HCPT含量。

细胞毒性实验

HeLa细胞接种于96孔板进行MTT实验。药物处理24 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT继续孵育4 h，再加150 μL DMSO终止反应。570 nm处测吸光度。

生物分布

将DiR负载的NDs和HFNDs经尾静脉注射入HeLa瘤负荷裸鼠。Maestro系统在1、4、8、12、24 h进行荧光成像。24 h处死小鼠，取肿瘤及主要器官体外成像。

体内肿瘤抑制

当肿瘤体积达~60 mm³时，小鼠分组尾静脉注射生理盐水、游离HCPT、NDs或HFNDs（每只80 μg HCPT），每3天一次。监测肿瘤体积（0.5×L×W²）和体重21天。实验结束处死，称肿瘤重，H&E染色做组织学检查。

统计分析

数据用双尾Student's t检验分析；p<0.05为显著差异（95%置信度）。

结果与讨论

FA-壳聚糖共轭物的合成

FA通过EDC/NHS介导的酰胺化反应共价连接到壳聚糖上（图1）。FT-IR谱图（图2）显示1605 cm⁻¹处有明显的C=O伸缩振动峰，确认酰胺键形成。UV定量显示共轭物中FA负载量为23.4±2.5%。

HFNDs的制备

利用HCPT水不溶和壳聚糖酸溶特性：HCPT溶于NaOH，CS-FA溶于HCl。中和混合后两种物质均处于差溶剂环境，触发HCPT沉淀并同步被CS-FA包裹成纳米针（图3a）。超声和CS-FA的空间位阻稳定作用抑制了块状晶体生长，生成高长径比纳米针（图3b-c）。正交实验设计（表1）优化了HCPT:CS-FA比例、超声功率、pH和浓度以获得理想形貌。

SEM分析（图4）显示过量CS-FA包覆颗粒表面，而CS-FA不足导致聚集。中性pH对保持纳米针完整性至关重要，超声功率影响聚集和破碎。较高混合浓度减小粒径，DLS证实（图4f）。优化后的HFNDs平均长度~800 nm，宽度~80 nm，流体动力学直径104.3±5.7 nm，Zeta电位+16.3±1.9 mV。2 wt%分散液稳定≥2.5天。

药物负载率70.2±3.1%，包封率83.1%。按共轭物FA百分比计算，FA占总质量7.0%。

XRD分析

XRD谱图（图5）证实HCPT在HFNDs中保持结晶态，而半结晶壳聚糖贡献宽峰。对比下，块状HCPT晶体（图6）呈棒状且长>10 μm，凸显CS-FA对HCPT生长动力学的调控作用。

体外药物释放研究

游离HCPT在1 h内释放30%，18 h近100%释放完毕。HFNDs在48 h内表现出明显较慢的持续释放（图7），归因于CS-FA外壳的扩散屏障。这种释放曲线有利于维持治疗浓度同时降低峰值相关毒性。

细胞摄取

共聚焦成像（图8）显示HFNDs处理组HeLa细胞内HCPT荧光强于非靶向NDs，提示叶酸介导的摄取。荧光定量（图9）证实HFNDs内化率更高，验证了靶向策略。

细胞毒性实验

MTT结果（图10）显示，在等量HCPT浓度下，HFNDs的杀细胞效果优于游离HCPT和NDs，凸显靶向递送和持续释放的双重优势。增强的细胞毒性归因于高效的受体介导内化和延长的胞内药物释放。

生物分布

体内成像（图11a）显示DiR-NDs肿瘤信号微乎其微，而DiR-HFNDs呈现显著的时间依赖性积累，12 h达峰。体外分析（图11b-c）确认HFNDs肿瘤荧光更强，表明叶酸介导的肿瘤靶向成功。

体内肿瘤抑制

HFNDs实现最显著的肿瘤生长抑制，最终肿瘤重量显著低于游离HCPT和NDs组（图12c）。组织学（图12d）显示HFNDs处理组肿瘤大面积坏死。重要的是，HFNDs未引起体重下降或明显毒性，而游离HCPT组观察到显著副作用（图12b）。这些结果表明HFNDs兼具强大的抗肿瘤活性和良好的安全性。

结论

我们建立了一条完全绿色、无溶剂的路线制备叶酸功能化HCPT纳米针，结合高药物负载、靶向细胞摄取和持续释放。体外和体内数据证实其相比常规制剂具有更优的抗癌活性和更低的全身毒性。该平台展示了环境友好型化学如何推动纳米颗粒制剂的治疗应用。