CKAP4 靶向硅量子点胶束：肺癌靶向成像新剂

摘要

目前已有多种荧光纳米材料被设计合成作为手术导航光学对比剂，但尚无利用硅量子点（Si QDs）制备肺癌手术导航荧光对比剂的报道。本研究改进修饰 Pi 等报道的水分散 Si QD 胶束，制备了 Si QD 胶束-CKAP4。表征显示：Si QD 胶束-CKAP4 为球形颗粒，平均流体动力学直径约 78.8 nm；UV-Vis 吸收范围 200–500 nm；330 nm 激发下发射峰位于 640 nm，呈强红色荧光。激光共聚焦显微镜和荧光显微镜实验证实，Si QD 胶束-CKAP4 对肺癌细胞和组织在体外具有良好靶向能力。体内荧光成像显示，该材料经肝脏代谢、肾脏排泄，且在体内特异性靶向肺癌组织而非正常肺组织。细胞毒性和 HE 染色实验表明，Si QD 胶束-CKAP4 在体外和体内均表现出高生物安全性。该材料是肺癌特异性靶向成像剂，有望成为未来肺癌手术导航的荧光对比剂。

引言

癌症是威胁人类健康的重大疾病。肺癌发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中居首且逐年上升。手术切除是实体瘤主要治疗手段，但区分恶性与正常组织主要依赖触觉、视觉及医生经验。近年来荧光引导手术成为术中实时导航肿瘤切除的研究热点。借助荧光对比剂和成像系统，医生可实时切除原发肿瘤并识别残留病灶。相比传统生物医学成像，荧光成像无电离辐射、空间分辨率高等优势。

目前已报道多种荧光纳米材料用于生物成像，其中硅量子点（Si QDs）因生物相容性好、光稳定性高等优势备受青睐。但尚无利用 Si QDs 制备肺癌手术导航荧光对比剂的报道。2014 年 Pi 等报道新型水分散 Si QD 胶束合成法，具有尺寸可控、荧光量子效率高、光稳定性优等优势。本研究旨在改进修饰该水溶性 Si QD 胶束，制备新型荧光对比剂，期望用于肺癌手术导航。2018 年 Yanagita 等报道 CKAP4 在肺癌患者血清和癌组织中高表达，可作为肺癌早期诊断新生物标志物。因此，CKAP4 抗体偶联的 Si QD 胶束可能成为新型荧光对比剂，用于肺癌手术导航。

本研究用 DSPE-PEG-COOH 制备表面带羧基的 Si QD 胶束，再用 EDC 偶联 CKAP4 抗体。结果显示：Si QD 胶束-CKAP4 水分散性好，365 nm 紫外光下发强红光；抗体偶联赋予其体内外对肺癌细胞/组织的良好靶向能力；且体内外生物安全性高。制备了潜在的肺癌手术导航荧光对比剂。

方法

试剂

牛血清白蛋白（BSA，≥98%，Sigma）、四氢呋喃（THF，99.9%，Adamas-beta）、DSPE-PEG-COOH（Aladdin）、CKAP4 抗体（0.55 mg/mL，Abcam）、DMEM 和 PBS（Hyclone）、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（Gibco）、4% 多聚甲醛、免疫染色渗透缓冲液（含 Triton X-100）和封闭液（Beyotime）、甘油（≥99%，Solarbio）、胰蛋白酶（0.25%，Kingmorn）。

仪器

透射电镜（TEM，JEM-2100F）、动态光散射（DLS，Zetasizer Nano-ZS90）、UV-Vis 吸收光谱（Cary 50）、荧光发射光谱（F-182 4500）、XPS（RBD-upgraded PHI-5000C ESCA）、光致发光量子产率（PL QY，FLS1000）、傅里叶变换红外光谱（FTIR，Thermo IS50）、X 射线衍射（XRD，SmartLab）。

细胞

A549 和 293 T 细胞系购自上海细胞生物学研究所。

Si QD 胶束制备

按文献 [12] 以水硅化反应制备十二烷基修饰 Si QDs（dodecyl-Si QDs），溶于 THF 配制 15 mg/mL 溶液。20 mg DSPE-PEG-COOH 溶于 10 mL 去离子水（2 mg/mL）。将 66 μL dodecyl-Si QDs 溶液滴加入 10 mL DSPE-PEG-COOH 溶液，超声 3 min 得透明溶液，避光搅拌 12 h，透析 24 h，冻干 3 天得 Si QD 胶束。

Si QD 胶束-CKAP4 制备

用 EDC 活化羧基偶联 CKAP4 抗体 [14]。4 mg Si QD 胶束分散于 900 μL PBS，10 mg EDC 溶于 100 μL PBS，混合超声 5 min。缓慢加入 20 μL CKAP4 抗体，避光室温搅拌 2 h。4000 rpm 离心超滤 15 min，PBS 洗涤 3 次，得 Si QD 胶束-CKAP4。

细胞毒性测试

采用台盼蓝法评估生物安全性 [15]。A549 和 293 T 细胞接种 24 孔板（1×10⁶/孔），37°C 培养 12 h。弃液后加入不同浓度 Si QD 胶束或 Si QD 胶束-CKAP4（Si 浓度 0–152 μg/mL），37°C 孵育 2 h。弃液，PBS 洗涤两次，台盼蓝 1:1 混合悬液，Countstar 计数存活/死亡细胞。细胞活力 = 存活细胞 /（存活+死亡）×100。三次生物学重复，Prism 7.01 统计，双因素方差分析 + Dunnett 事后检验，P<0.05 为显著。

体外靶向肺癌细胞

A549 和 293 T 细胞分别孵育 Si QD 胶束或 Si QD 胶束-CKAP4（Si 150 μg/mL），激光共聚焦显微镜检测（激发 405 nm，发射 630 nm）。ImageJ 定量分析平均荧光强度，单因素方差分析 + Dunnett 检验，P<0.001 显著。

肿瘤负荷小鼠模型

购买 5–6 周雄性裸鼠 10 只（上海 SLAC），SPF 级饲养。皮下接种 1×10⁶ A549 细胞建模，肿瘤直径达 6 mm 时实验。所有动物实验遵循机构指南，经同济大学实验动物伦理委员会批准。

体外靶向肺癌组织

处死肿瘤小鼠，取瘤组织和正常肺组织制石蜡切片。脱水、抗原修复、血清封闭后，孵育 Si QD 胶束或 Si QD 胶束-CKAP4（Si 150 μg/mL），37°C 2 h。洗涤后 DAPI 染核 10 min，抗淬灭封片，荧光显微镜成像（激发 405 nm，发射 630 nm）。ImageJ 定量分析红色荧光强度，统计方法同上。

体内荧光成像

9 只肿瘤小鼠分三组：Si QD 胶束-CKAP4 注射组、Si QD 胶束注射组、生理盐水组。尾静脉注射 200 μL 对应样品（Si 4 mg/kg）。不同时间点（0–4 h）获取荧光图像。4 h 处死 Si QD 胶束-CKAP4 组小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、瘤组织检测荧光信号。用 VISQUE Invivo Smart-LF 成像（PE 滤光片组：激发 450–500 nm，发射 600–650 nm）。单因素方差分析 + Dunnett 检验，P<0.05 显著。

HE 染色

12 只肿瘤小鼠尾静脉注射生理盐水、Si QD 胶束（Si 4 mg/kg）或 Si QD 胶束-CKAP4（Si 4 mg/kg），24 h 后处死，心、肝、脾、肺、肾作 HE 染色，光镜观察病理变化。

结果

Si QD 胶束制备与表征

按文献 [12] 水硅化法制备 dodecyl-Si QDs（Scheme 1 步骤 1）。TEM 显示球形、尺寸均一，直径 4.1–5.3 nm，平均 4.7 nm（图 1a）。高分辨 TEM 可见清晰晶格条纹，平面间距 ~0.35 nm，与文献 0.34 nm 吻合，结晶度好。DLS 测得流体动力学直径 4.8–13.5 nm，平均 6.5 nm（图 1b）。

用 DSPE-PEG-COOH 替代 F127 自组装制备水分散 Si QD 胶束（Scheme 1 步骤 2），表面带羧基。TEM 显示球形胶束内嵌 Si QDs，直径 22.7–54.6 nm，平均 34.3 nm（图 1c）。DLS 测得流体动力学直径 43.8–615.9 nm，平均 58.7 nm（图 1d），平均 ζ 电位约 -20.7 mV。FTIR（附件 Figure S1A）显示 DSPE-PEG-COOH 特征基团（N-H、O-H、C=O、C-O、P-O-C、O=C-N）和 dodecyl-Si QDs 特征基团（Si-C、Si-H）均出现，证实成功包裹。XRD（附件 Figure S1B）衍射峰尖锐，结晶度好；27.073°、28.451°、56.598°、73.145° 对应 Si (100)、(002)、(112)、(203) 晶面（PDF#80-0005），证实 Si QDs 成功包裹；NaCl 峰源于制备后溶于 PBS。UV-Vis 吸收 200–500 nm（图 2a）；330 nm 激发下发射峰 650 nm（图 2b）；自然光下透明，365 nm UV 下发强红光（图 2c）。绝对 PL QY 约 14.49%（激发 365 nm）。

Si QD 胶束-CKAP4 制备与表征

EDC 偶联 CKAP4 抗体（Scheme 1 步骤 3）。TEM 显示球形，直径 24.4–67.7 nm，平均 35.5 nm（图 1e）。DLS 测得流体动力学直径 58.7–824.9 nm，平均 78.8 nm（图 1f），略大于 Si QD 胶束，因抗体偶联。C1s XPS（图 1g、h）：Si QD 胶束含 C(O)O（288.81 eV）、C=O（286.5 eV）、C-O（285.76 eV）、C-N（285.25 eV）、C-C（284.88 eV）、C-H（284.34 eV）六种碳；Si QD 胶束-CKAP4 中 C(O)O 峰近乎消失，证实羧基与伯胺偶联成功，CKAP4 抗体接合。平均 ζ 电位升至约 -10.7 mV，因抗体偶联减少表面羧基。UV-Vis 吸收同 Si QD 胶束（200–500 nm，图 2a）；330 nm 激发发射峰 640 nm（图 2b），抗体偶联未显著影响荧光性质；自然光透明，365 nm UV 下强红光（图 2c）。绝对 PL QY 约 16.96%。

Si QD 胶束-CKAP4 体外细胞毒性

以 A549 和 293 T 为靶细胞，测不同浓度（Si 0、2.375、4.75、9.5、19、38、76、152 μg/mL）孵育 2 h 后活力（图 3）。GraphPad 计算 ID50：Si QD 胶束在两细胞系 ID50 均 >152 μg/mL；Si QD 胶束-CKAP4 在 A549 中 ID50 为 25.94 μg/mL，在 293 T 中为 72.69 μg/mL。Si QD 胶束-CKAP4 细胞毒性显著高于 Si QD 胶束，且对 A549 毒性显著高于 293 T，可能因补体依赖性细胞毒性。这表明 Si QD 胶束-CKAP4 在正常细胞中生物安全性高于肺癌细胞，为体内应用奠基。

Si QD 胶束-CKAP4 体外靶向肺癌细胞

激光共聚焦检测（图 4）：Si QD 胶束-CKAP4 孵育 A549 红色荧光显著强于其他三组（Si QD 胶束-CKAP4+293 T、Si QD 胶束+A549、Si QD 胶束+293 T），证实其体外特异性靶向 A549 细胞。

Si QD 胶束-CKAP4 体外靶向肺癌组织

皮下成瘤小鼠取瘤组织和正常肺组织孵育纳米材料（图 5）。Si QD 胶束-CKAP4 孵育 A549 组织在 405 nm 激发下发强红光；其他三组仅弱红光。定量分析证实 Si QD 胶束-CKAP4 红色荧光强度显著最高，表明其能有效靶向肺癌组织，具备潜在荧光对比剂应用价值。

体内荧光成像

三组小鼠肺癌组织荧光信号均不显著（数据未显示），可能因 Si QD 胶束-CKAP4 和 Si QD 胶束荧光穿透力弱。4 h 处死 Si QD 胶束-CKAP4 组小鼠检测器官荧光（图 6）：肝、肾、瘤组织荧光显著；心、脾、正常肺无显著信号。肝肾信号表明材料经肝代谢、肾排泄；瘤组织荧光显著高于正常肺，归因于靶向能力。结果表明 Si QD 胶束-CKAP4 体内特异性靶向肺癌组织，有望作为肺癌手术导航荧光对比剂。

Si QD 胶束-CKAP4 体内生物安全性评价

12 只肿瘤小鼠注射生理盐水、Si QD 胶束或 Si QD 胶束-CKAP4（Si 4 mg/kg），24 h 后 HE 染色（图 7）。与生理盐水组相比，两纳米材料组主要脏器无明显病理改变，表明该剂量下体内无显著毒性。

讨论

目前多种荧光纳米材料已作为手术导航光学对比剂。2020 年 On 等制备 ICG 或 Cy5.5 偶联糖壳聚糖纳米颗粒用于肺癌手术导航，但无 Si QDs 相关报道。本研究首次利用 Si QDs 合成肺癌手术导航荧光对比剂，丰富了工具库；优化了 Pi 等的水分散 Si QD 胶束，赋予靶向能力，为 Si QDs 生物医学应用提供新可能；靶向机制基于肺癌组织 CKAP4 高表达，抗体偶联实现主动靶向，比依赖 EPR 效应的被动靶向纳米材料对肺癌特异性更强；Si QD 胶束-CKAP4 在特定浓度范围对肿瘤细胞表现出选择性细胞毒性，在合理药物浓度范围内生物安全性高，具临床应用潜力。

PL QY 测试显示 Si QD 胶束绝对 PL QY ~14.49%，Si QD 胶束-CKAP4 ~16.96%。Pi 等报道 dodecyl-Si QDs PL QY ~26%（红光发射 <700 nm 的 Si QDs 中极高），但胶束化后下降，可能因乳化过程引入表面缺陷，与文献 [12,21] 一致。Si QD 胶束-CKAP4 PL QY 略高于 Si QD 胶束，可能因抗体偶联修复了部分表面缺陷。

Si QDs 生物应用挑战：虽 Si 低毒，但尺寸减小到一定程度可能呈现细胞毒性。本研究显示 Si QD 胶束-CKAP4 在 9.5–19 μg/mL 对肺癌细胞有选择性细胞毒性，因抗体偶联使其对正常细胞毒性显著低于肺癌细胞，为生物应用提供有力条件。

靶向实验用 A549（p53 野生型）和 293 T 细胞。实验中 293 T 为半贴壁细胞，反复离心洗涤导致细胞数减少，图 4 中 293 T 细胞较少。且 A549 仅代表 p53 野生型肺癌，未来需测试 p53 阴性细胞系（如 H1299）以夯实临床应用基础。

结论

本研究改进 Pi 等的 Si QD 胶束，制备水分散 Si QD 胶束-CKAP4。平均流体动力学直径 ~78.8 nm，UV-Vis 吸收 200–500 nm，330 nm 激发发射 640 nm 强荧光。体内外均展现对肺癌细胞/组织的良好靶向能力；体内经肝代谢、肾排泄，特异性靶向肺癌组织；细胞毒性和 HE 染色证实体内外高生物安全性。Si QD 胶束-CKAP4 是肺癌特异性靶向成像剂，有望成为未来肺癌手术导航荧光对比剂。