通过基于氧化石墨烯的递送系统连续释放金属蛋白酶-1 的组织抑制剂可以促进皮肤再生

背景

皮肤损伤可由多种因素引起，例如事故、糖尿病并发症、烧伤或浅表手术[1]。自体皮肤移植或用于制造人造皮肤的生物聚合物是最常用的伤口闭合方法 [2]。这些替代品可能包括可用供体软组织的限制，特别是在严重烧伤的患者中 [3]、感染 [4]、疼痛和皮瓣坏死 [5]、减缓材料的愈合和生物相容性。

金属蛋白酶-1 组织抑制剂 (TIMP-1) 通过与基质金属蛋白酶 (MMP) 形成抑制性复合物来防止细胞外基质 (ECM) 分解 [6, 7]。 TIMP 蛋白还控制 MMP 驱动的周转和生长因子以及与伤口修复和再生相关的细胞因子的加工 [8]。 TIMPs 和 MMPs 在正常伤口愈合过程中受到调节，它们的不平衡与皮肤修复缺陷、瘢痕疙瘩和纤维化有关 [9]。上皮来源的 TIMP-1 可以直接或间接调节不同阶段的上皮形成。切除伤口修复和皮肤再生的一个重要阶段是再上皮化，即外伤表面上皮细胞的再生长 [10]。当伤口边缘的细胞松开它们的细胞 - 细胞和细胞 - ECM 接触并开始在伤口上迁移时，就会发生再上皮化。这些过程与TIMP-1生物学有关[11]。

用于修复皮肤的最佳区域 TIMP-1 给药系统取决于所使用的递送载体。已经开发了一些旨在释放细胞因子的递送载体 [12]。载体包括 PLGA（聚乳酸-乙醇酸共聚物）[13]、壳聚糖 [14]、PLGA 纳米球 [15] 和水凝胶。使用递送载体将有助于减少用于皮肤再生的 TIMP-1 剂量，并允许局部递送药剂。石墨烯由碳原子组成，具有平坦的单层和蜂窝状二维结构[16]。氧化石墨烯 (GO) 已在文献中用作小分子药物递送载体，因为它具有有效的负载（吸收）、生物相容性和低毒性 [17,18,19]。 GO的基本特征包括疏水性π 结构核心中的域，边缘有电离区域。与众不同的π –π 堆积相互作用使GO高效水溶性，比表面积大，负载能力高[20, 21]。

在本研究中，我们研究了重组人 TIMP-1 蛋白是否可以与 GO 配对作为一种递送载体来改善皮肤再生。为了研究对皮肤再生的影响，已将 TIMP-1 加载到 GO 薄片上，并通过大鼠成纤维细胞在体外测量其释放和毒性。结果最终在使用皮肤伤口模型的大鼠身上进行测试。

材料和方法

细胞培养

大鼠成纤维细胞购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海），并在含有 10% (v /v ) 胎牛血清 (FBS, Gibco)。每 2 天更换一次培养基。所有细胞均保持在 37°C。

GO 表征

GO薄片购自中国科学院成都有机化工有限公司（中国成都），并在铂涂层后使用扫描电子显微镜（SEM，JSM-6701F，JEOL，Tokyo，Japan）进行表征。在扫描电子显微镜（Hitachi S3000N）下以 15 kV 加速电压扫描样品。 GO薄片的尺寸分布用基于zeta电位的分光光度计（Zetasizer 3000 HSA，Malvern，UK）测定。使用原子力显微镜（AFM，MultiMode，VEECO，USA）结合倒置显微镜（IX71倒置显微镜，Olympus，Tokyo，Japan）确定GO薄片的形态。使用 TGA/DSC 热重分析仪（Pyris 1 TGA，Perkin-Elmer，USA）进行热重分析和差示扫描量热分析，将样品置于氧化铝盘中，并在 10°C/25 至 1100°C 的温度范围内加热升温/分钟

TIMP-1 GO 吸附

在人类重组 TIMP-1（华安公司，杭州，中国）吸附之前，GO 薄片用 1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基-乙基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI，红色，Sigma）标记。对于 TIMP-1 吸附，将异硫氰酸荧光素（FITC，green，Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）结合的 TIMP-1（华安公司，杭州，中国）和 DiI 标记的 GO 添加到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中) 并在 4°C 下孵育 4 小时。 GO与重组TIMP-1的重量比为1:1。为了确定 GO 上的 TIMP-1 负载，将 TIMP-1（1 μg）添加到 20 μl 含有 GO 的 PBS 中，并在 4°C 下孵育 4 小时。使用激光扫描共聚焦显微镜（IX81-FV1000 倒置显微镜，奥林巴斯）观察吸附到 GO 上的 TIMP-1。为了确认 TIMP-1 吸附到 GO 上，使用 Nicolet 5700 光谱仪（ThermoFisher Co., SGE, Australia）对通过将 2 mg GO 与 100 mg 混合制备的丸粒（直径 10 mm）进行傅立叶变换红外光谱（FTIR） KBr 和压制以生产待分析的颗粒。使用EZ OMNIC (Nicolet)软件进行基线校正后的光谱分析。

TIMP-1 蛋白的释放动力学

TIMP-1 从各种 GO 浓度（10、20 和 30 μg/ml）的释放曲线使用商业人 TIMP-1 特异性酶联免疫吸附测定（ELISAs，R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN，美国）。在 4°C 下孵育 4 小时后，上清液的 ELISA 显示几乎所有 TIMP-1 都吸附在 GO 上。将装载 TIMP-1 的 GO 悬浮在含有 1.5 ml PBS 的 60 mm 培养皿中。然后将培养皿在 37°C 下孵育。在不同的时间点，连续搅拌后收集上清液，并将新鲜的缓冲液加入培养皿中。 ELISA法测定上清中人TIMP-1的浓度。

GO 生物相容性检测

向大鼠成纤维细胞培养物中加入每毫升 20 微克的载有 20 μg/ml TIMP-1 的 GO 薄片，并将细胞培养 6、24、48 和 72 小时。如制造商说明中所述，使用细胞计数 8 (CCK8) 测定法评估细胞活力。样品的吸光度表示为 450 nm 处的吸光度值 (n =每组 5 个）。

流式细胞术表征

通过胰蛋白酶消化收集成纤维细胞并用 Hoechst 33258 和 Annexin-V-FITC/PI 标记。随后通过流式细胞术分析试剂盒（Lianke，杭州，中国）测定细胞周期活性和细胞凋亡。在封闭剂（Lianke，杭州，中国）存在下，在 4°C 下进行标记 30 分钟，然后使用 PBS 进行两个洗涤步骤。洗涤固定后，至少10 ⁴ 获得并分析细胞。流式细胞仪分析采用 Becton Dickinson FACSCanto II。

体内实验

所有实验程序均按照美国 NIH 的指导方针进行。实验动物经浙江大学伦理委员会批准。如前所述（图 4a）[22]，对 4 周大的雄性 Sprague-Dawley 大鼠进行了皮肤缺损手术 (SDS)。皮肤缺损的大小为 10 毫米 × 10 毫米。手术后，将动物放回各自的笼子里。 SDS 后 14 天，将动物随机分成四组并开始治疗。局部注射对照剂（仅 4 ml PBS）、GO 剂（4 ml GO 与 PBS，1:20）、TIMP-1 剂（4 ml TIMP-1 与 PBS 1:20）或 TIMP-1-GO 剂（4 毫升 GO 与 TIMP-1，1:1 v /w ) 皮下注射。每周在皮肤缺损周围进行注射（共 4 个点，每个点 1 毫升），在 2 周内进行总共两次治疗。手术后 4 周处死大鼠（图 4a）。解剖再生皮肤，石蜡包埋，苏木精-伊红染色和Masson染色观察。

组织学和免疫组化分析

再生的皮肤在 4% 福尔马林中固定 72 小时。然后，在室温下将样品在 9% 甲酸中脱钙 2 周。皮肤样品用分级乙醇脱水。连续切片用苏木精-伊红 (HE) 和 Masson 染色。通过免疫组织化学染色分析皮肤缺损处CD34的表达。切片在二甲苯中脱蜡并通过分级醇水合。用 1% 山羊血清（1:100 稀释，Sigma）封闭后，将切片与抗 CD34 的一抗（Abcam，Cambridge，UK）在 4°C 下孵育过夜。用 PBS 洗涤 3 次后，将切片与二抗在 37°C 下孵育 1 小时。使用 3,3'-二氨基联苯胺 (DAB) 溶液（Dako，Hamburg，Germany）进行染色。再生的皮肤由三名训练有素的观察者观察。免疫组化切片采用DBA百分比分期。

统计分析

所有实验均重复 3 次，数据表示为平均值 ± 标准偏差。单向方差分析和 Student-Newman-Keuls 事后检验确定了显着性水平。 p 分别小于 0.05 和 0.01 的值被认为是显着的和高度显着的。使用SPSS 17.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）进行统计分析。

结果

GO 表征

GO 图像的 2D 表示显示在 AFM 上（图 1a）。 SEM 显示 GO 薄片是不规则形状的薄片（图 1b）。通过基于电势的分光光度计测量GO薄片的尺寸分布。尺寸分布的最大强度为 1140 nm，GO 的最大强度体积为 10,674.1 nm（图 2a）。

去吸收。 一 在 AFM 上显示的 GO 图像的 2D 表示。 b SEM 显示 GO 薄片是不规则形状的薄片。 GO薄片是不规则形状的薄片。 c GO薄片的尺寸分布。最大强度为 1140 nm，最大强度体积为 10,674.1 nm

GO 和 TIMP-1-GO 表征。 一 TIMP-1 被吸收到 GO 上。分析表明 75±1.2% 的 GO 被 TIMP-1 吸收。 b 记录了 TIMP-1 的累积释放曲线。嵌入到 GO 中的 TIMP-1 代表了一个合适的系统，可以将 TIMP-1 的释放时间延长约 40 天。 c 使用 FTIR 光谱研究了 GO 和 TIMP-1-GO 之间的化学成分。 GO 的波形和波峰与 TIMP-1-GO 的有显着差异。 d 热重分析曲线显示 GO 和 TIMP-1-GO 在 50 到 800°C 之间没有显着差异。热重分析曲线显示对照GO和TIMP-1-GO之间没有明显差异

TIMP-1 GO 吸附

以下是 FITC 结合的 TIMP-1（绿色）和 DiI 标记的 GO（红色）在 PBS 中孵育 4 小时； TIMP-1 吸附在 GO 上。分析显示 75 ± 1.2% 的 GO 在 4 小时后被 TIMP-1 吸收，这表明 GO 有效地与 TIMP-1 蛋白结合（图 1c）。我们使用 FTIR 光谱研究了 TIMP-1-GO 的化学成分（图 2b）。 GO 的波形和波峰与 TIMP-1-GO 的有显着差异。我们进一步研究了对照 GO 和 TIMP-1-GO 之间的热重分析（图 2d）。热重分析曲线显示对照GO与TIMP-1-GO无明显差异。

TIMP-1 版本

将不同浓度的 TIMP-1（第 1 组 3 微克/毫升、第 2 组 2 微克/毫升和第 3 组 10 微克/毫升）加载到 GO 上。 TIMP-1 的累积释放曲线如图 2c 所示。与 10 和 30 微克/毫升 TIMP-1 剂量相比，2 微克/毫升 TIMP-1-GO 释放达到 50% 的累积释放更快。 TIMP-1 持续发布了大约 40 天。这表明在GO中嵌入TIMP-1的应用可能代表了一个适合延长TIMP-1释放的系统（图2c）。

TIMP-1-GO 上的细胞增殖和活力

在对照、GO 和 TIMP-1 中培养的大鼠成纤维细胞的增殖和活力与在不同 TIMP-1-GO 样品中生长的细胞的增殖和活力没有明显差异 (p> 0.05)。在对照、GO 和 TIMP-1 中培养的成纤维细胞的细胞周期和凋亡与在 TIMP-1-GO 样品中培养的细胞没有明显差异 (p> 0.05)（图 3a-c）。

TIMP-1-GO对大鼠成纤维细胞增殖和活力的影响。 一 不同组培养的成纤维细胞活力在不同时间点无显着差异(p> 0.05）。 b 成纤维细胞的细胞周期与不同组生长的细胞没有显着差异（p> 0.05）。 c 成纤维细胞的细胞凋亡与不同组生长的细胞相比没有显着差异（p> 0.05)

TIMP-1-GO 在皮肤伤口模型中的功效

将 TIMP-1-GO 皮下注射给大鼠以确定它是否可以促进实验伤口的愈合。术后 4 周，与对照组相比，TIMP-1-GO 治疗的皮肤缺损在终点出现显着差异（p <0.05），而TIMP-1治疗的皮肤缺损在终点与对照组和GO组有显着差异（p <0.05)。此外，TIMP-1-GO组在毛囊再生中表现出增强的治疗效果（p <0.05)。 TIMP-1治疗的皮肤缺损在终点与对照组和GO组有显着差异（p <0.05）（图4b）。

体内实验。 一 方案和 SDS 和模型。 b 体内组织学和免疫组织化学分析（1 cm）。在 TIMP-1-GO 组中可以看到连续的胶原纤维。 c 定量评估显示，与 TIMP-1 和 TIMP-1-GO 相比，对照和 GO 之间存在显着差异（p <0.05）。不同组的毛囊有显着差异(p <0.05）。 TIMP-1治疗的皮肤缺损与对照组和GO组半定量显示有显着差异（p <0.05)

组织学和免疫组化分析

用PBS处理后皮肤再生的组织学特征显示在图4b中。皮肤缺损后对照组的特征显示治疗后 4 周标本中可见断裂的胶原纤维。相比之下，TIMP-1-GO 组在同一时间点可见连续的胶原纤维，与对照组相比具有统计学差异。 TIMP-1-GO 治疗后血管化的免疫组织化学特征显示在图 3c 中。 4 周后，在 TIMP-1-GO 治疗组的标本中可见 CD34+ 皮下细胞。定量评估显示对照组和 TIMP-1-GO 治疗组之间存在显着差异 (p <0.05）（图4c）。

讨论

在本研究中，我们分析了一种通过将重组 TIMP-1 蛋白与 GO 的控释相结合来增强切除伤口修复的潜在新方法。 GO在体外表现出良好的生物相容性。并且 TIMP-1 被证明可以从 GO 车辆中持续释放长达 40 天。在实验性皮肤缺损模型中，TIMP-1 与 GO 的结合可促进血管化和胶原蛋白再生。

多种生物医学材料已被评估为用于在组织再生中递送药剂的治疗载体。胶原蛋白、丝、钛、磷酸钙骨水泥和聚乳酸-聚乙醇酸等载体往往会产生生物制剂的快速释放，这在某些治疗环境中可能是不希望的 [23]。因此，生物医学载体提供生物分子缓慢连续释放的能力可以被视为一个重要特征。对这种质量的要求是在电荷的帮助下能够灵活地装载药物 [24]。氧化石墨烯 (GO) 提供了一种“启动”效应，已显示出在体外和体内缓慢释放各种生物制剂的效用 [25,26,27]。在这里，我们表明 GO 可用于持续释放重组人 TIMP-1 蛋白。疏水π之间的相互作用 GO 的结构域和静电相互作用可以激活 GO 的带负电荷的结构域，并允许 TIMP-1 蛋白质通过内部疏水区域有效吸收到 GO。 GO中TIMP-1的长效释放非常适合于皮肤伤口修复中必要的血运重建。

有人建议，浓度超过 50 毫克/毫升的碳颗粒可能会沉积在组织中 [28]。王等人。表明这可能会导致炎症反应，因为它的直径极小，但 GO 的功能表面积很大 [29]。与之前的研究相比，我们的研究中未检测到 GO 沉积。鉴于此处没有明显的副作用，无法支持 GO 纳米粒子的潜在负面影响。对石墨烯的进一步研究提出了包括生物学反应和安全性测试的建议[30]。

研究氧化石墨烯对细胞的相互作用是一个重要的课题。石墨烯是一种新开发的生物医学材料，其特性表明其可用于许多生物应用。然而，二维碳结构/石墨烯毒理学的潜在生物学和一般生物相互作用尚未完全了解，这需要广泛的额外研究。

结论

当用作缓慢递送重组 TIMP-1 的载体时，氧化石墨烯 (GO) 显示出持续的生物相容性。显示 TIMP-1 从 GO 中持续释放长达 40 天，并且显示 TIMP-1 与 GO 的组合在皮肤再生模型中促进血运重建和胶原再生。