靶向化疗：适配体修饰介孔二氧化硅纳米颗粒精准递送多柔比星至白血病细胞

摘要

如何高效、选择性地将化疗药物递送至肿瘤细胞以提升疗效仍是难题。本研究构建了基于适配体修饰介孔二氧化硅纳米颗粒的高效细胞靶向药物递送系统（Sgc8-MSN/Dox），利用适配体Sgc8的肿瘤靶向能力将多柔比星（Dox）定向递送至白血病细胞，从而提高治疗效果并降低毒性。实验表明，Sgc8-MSN/Dox表现出持续的Dox释放行为，能靶向并高效杀伤CCRF-CEM人急性T淋巴细胞白血病细胞，显示出作为癌症治疗的潜力。

引言

急性淋巴细胞白血病（ALL）是严重危害人类健康的异质性恶性肿瘤。美国每年确诊约6000例ALL，多见于儿童和青少年。ALL是儿童最常见癌症，也是20岁前癌症死亡的最常见原因。化疗放疗和骨髓造血干细胞移植是ALL标准治疗手段。放疗伴随显著全身副作用且最佳照射部位不明；骨髓移植常因费用、患者年龄和缺乏供体而不可行。化疗虽能消灭远处病灶防止复发，但大多数抗肿瘤药物仅小部分经循环到达肿瘤，导致生物利用度低、对病变细胞与正常细胞选择性差，增加严重不良反应和耐药风险。

纳米药物递送系统能比游离药物更有效、靶向地递送抗肿瘤药物，包括利用肿瘤微环境特异条件触发释药。其中介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）因具备大且可修饰的表面、可调孔容载药量和类型、良好生物相容性而备受关注。表面修饰功能响应基团可使MSNs在特定条件下释药，修饰靶向分子则可实现药物选择性递送。

适配体是一类单链DNA或RNA，作为"化学抗体"能特异性强结合靶标。相比单克隆抗体，适配体分子更小、制备修饰更易、组织渗透性更好、毒性和免疫原性更低，广泛用于肿瘤检测和靶向化疗。SELEX法筛选出的适配体Sgc8可特异性结合CEM人急性T淋巴细胞白血病细胞，识别CEM细胞膜上的蛋白酪氨酸激酶-7（PTK-7）。将Sgc8与化疗药物或纳米材料结合可提升白血病细胞靶向杀伤效果。我们此前设计了Sgc8适配体修饰荧光二氧化硅纳米颗粒系统（Sgc8-FSNPs）用于高灵敏度特异性检测白血病细胞，证实其不仅适用于白血病诊断，也可用于抗白血病药物靶向递送。基于此工作，本研究将多柔比星（Dox）包裹在MSNs中并修饰Sgc8（图1）。所得Sgc8-MSN/Dox具有良好药物递送形貌和尺寸，纳米颗粒被培养中的白血病细胞选择性摄取，有效杀伤肿瘤细胞。本研究旨在揭示适配体修饰介孔二氧化硅纳米颗粒不仅能靶向诊断肿瘤，还能通过载药杀伤肿瘤，为肿瘤靶向诊疗一体化提供思路。

实验材料与方法

试剂与材料

盐酸多柔比星（Dox）购自北京华丰联合技术。分析纯四乙氧基硅烷（TEOS）、3-三乙氧基硅基丙胺（APTES）购自上海化学试剂一厂，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，99%纯度）购自上海基质生化科技。其他试剂均为分析纯。羧基修饰Sgc8适配体由上海生物工程合成。

细胞系

人急性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM、人伯基特淋巴瘤B细胞系Ramos、人正常肝细胞系L02、人胚肾细胞系293T购自中国科学院上海细胞库。所有细胞在37°C、5% CO₂条件下用含10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的DMEM培养。

Sgc8-MSN/Dox制备

MSNs制备参考文献[19]：0.50 g CTAB溶于240 mL超纯水，加入1.75 mL 2 M NaOH，80°C油浴加热。剧烈搅拌下缓慢滴加2.50 mL TEOS，持续搅拌2 h得白色沉淀。10,000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀用超纯水和无水乙醇交替洗涤三次，60°C真空烘箱干燥过夜得MSNs。

Sgc8-MSN/Dox制备：0.2365 g MSNs置于三口瓶中加23.65 mL无水乙醇，滴加710 μL APTES回流24 h。用甲醇-盐酸溶液（4:1）和去离子水交替洗涤三次，干燥得MSNs-NH₂。室温下将MSNs-NH₂分散于PBS，滴加Dox（5 mg/mL）搅拌24 h。最后加入羧基修饰Sgc8适配体（100 nM/mL）搅拌1 h，离心，用PBS洗至无色得Sgc8-MSN/Dox。

Sgc8-MSN/Dox表征

X射线衍射（XRD）用Bruker D4衍射仪测定。N₂吸附-解吸等温线用TriStar 3000比表面积孔径分析仪测定，BET比表面积由BET图计算，孔径分布由BJH法从吸附支估算。粒径和电位用Malvern Nano S动态光散射仪测定，每样品测三次取平均。透射电镜（H-7650，100 kV）观察粒径形貌。傅里叶变换红外光谱（FT-IR，Nicolet-5700）评估Sgc8适配体与MSN表面偶联情况。收集制备Sgc8-MSN/Dox过程中的洗涤上清，紫外吸收法（260 nm）测定未结合适配体量，用标准曲线法计算适配体修饰量。

Sgc8-MSN/Dox体外Dox释放

10 mg Sgc8-MSN/Dox溶于10 mL pH 5.0或7.4缓冲液，37°C、100 rpm振荡。定时取样，5000 rpm离心10 min，上清液用Thermo Scientific酶标仪在482 nm处分光光度法测定Dox释放量。

Sgc8-MSN/Dox靶向能力

CEM或Ramos细胞（3×10⁶）用PBS重悬，加入Sgc8-MSN/Dox或MSN/Dox（适配体浓度200 nM），37°C孵育20-30 min。离心收集细胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。1 mg/mL DAPI染色5 min，PBS洗3次离心。细胞沉淀用PBS重悬滴于载玻片，荧光共聚焦显微镜（Nikon DS-Ri1）分析。

另行实验：对数生长期CEM和Ramos细胞（3×10⁵）重悬于50 μL PBS、45 μL结合缓冲液[PBS含5 mM MgCl₂、4.5 g/L葡萄糖、1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）]和10 μL FBS[PBS含1 mg/mL BSA]混合液中，加入指定材料（适配体浓度200 nM）。避光4°C振荡30 min。洗涤缓冲液洗细胞，1000 rpm离心5 min，再洗3次。最终用500 μL洗涤缓冲液重悬，流式细胞仪（Beckman Coulter Epics XL）分析。

MSNs细胞毒性

MTT法评估无Dox或适配体的MSNs细胞毒性。对数期CEM、Ramos、293T、L-02细胞接种96孔板（1.5×10⁴/孔），加入100 μL MSNs，37°C、5% CO₂培养24或48 h。加入20 μL MTT，37°C孵育30 min，1500 rpm离心10 min，弃上清。加入200 μL DMSO，避光振荡10 min，酶标仪测570 nm光密度（OD）。每样品设6复孔，结果以mean±SD表示。

Sgc8-MSN/Dox杀伤细胞

CEM、Ramos、293T、L-02细胞接种96孔板（1×10⁵/孔），分别孵育游离Dox、MSN/Dox或Sgc8-MSN/Dox（Dox浓度1、5、10、15、20 μg/mL）24 h。为进一步证实Sgc8-MSN/Dox通过适配体受体靶向杀伤CEM细胞，先用足量Sgc8适配体与CEM细胞孵育2 h，再加入Sgc8-MSN/Dox（Dox浓度20 μg/mL）孵育24 h。MTT法比较活力。

统计分析

Student's t检验和单因素方差分析（最小显著差异检验）进行统计分析，GraphPad Prism 6.02软件完成。

结果与讨论

Sgc8-MSN/Dox表征

XRD数据显示合成纳米颗粒具有六方介孔典型衍射峰（图2a），确证MSN结构。N₂吸附-解吸等温线呈IV型等温线特征（图2b），表明介孔特性。BET模型计算比表面积1389 m²/g。BJH曲线显示孔径分布窄（图2b插图），孔径5.23 nm，孔容2.51 cm³/g。巨大比表面积、孔容和丰富介孔赋予其强药物负载能力和优秀药物载体潜力。电镜显示Sgc8-MSN/Dox分散性好、尺寸均一、球形或椭球形（图3a）。MSN/Dox在PBS中平均ζ电位-26.53 mV，Sgc8-MSN/Dox降至-33.87 mV（图3b），反映Sgc8适配体负电荷。观察到介孔硅表面孔道。PBS中MSN/Dox平均水化粒径98.35 nm，接枝Sgc8适配体后增至103.24 nm（图3c,d）。FT-IR光谱进一步确证偶联成功（图3e）。3400、1100、500 cm⁻¹为二氧化硅特征峰；2400 cm⁻¹为CTAB模板剂峰；1600 cm⁻¹为NH₂峰；1700 cm⁻¹左右为MSNs负载Dox中簇碱C=O键伸缩振动特征峰；1650 cm⁻¹新峰归因于Sgc8与NH₂-MSN/Dox反应生成的希夫碱（-C=N-）。这些证据证明Sgc8-MSN/Dox药物递送系统制备成功。紫外分光光度计测260 nm处适配体吸光度（OD），基于修饰前后OD变化计算适配体修饰效率。适配体溶液和上清液UV-Vis谱见图3f。计算得Sgc8适配体修饰量约6.87 nmol/mg Sgc8-MSN/Dox。

Sgc8-MSN/Dox体外Dox释放

pH 7.4下MSN/Dox和Sgc8-MSN/Dox缓慢释药：96 h内释放不超过50%（图4），表明MSNs可支持长达96 h的缓释，可能因药物分布于介孔硅内部通道。pH 5.0下释放加快，48 h释放率达60%，96 h超80%。Sgc8-MSN/Dox和MSN/Dox释放曲线近似重合，提示适配体连接不影响纳米颗粒结构。酸性环境下释放增强具有重要意义：肿瘤细胞处于弱酸性微环境，Sgc8包被纳米颗粒被内吞进入内体/溶酶体。结果支持介孔硅可在酸性环境加速释药。

Sgc8-MSN/Dox体外靶向白血病细胞

以CEM T淋巴细胞白血病细胞为靶细胞，Ramos B淋巴瘤细胞为非靶细胞考察纳米颗粒摄取。流式细胞术显示，非靶细胞对MSN/Dox和Sgc8-MSN/Dox摄取程度相似；靶细胞对适配体包被纳米颗粒摄取显著高于MSN/Dox（图5a）。荧光共聚焦显微镜一致显示：暴露于Sgc8-MSN/Dox的CEM细胞内有强Dox荧光（红色），同等处理的Ramos细胞内则无（图5b）。结果反映Sgc8适配体靶向白血病细胞的既定能力。Sgc8识别CEM细胞表面PTK-7，招募纳米颗粒至细胞表面促进摄取。提示Sgc8-MSN/Dox可靶向原发、转移灶或循环中的PTK-7表达癌细胞，利于控制转移。未来可拓展至其他特异性适配体。

MSNs细胞毒性

鉴于纳米药物递送系统的生物安全性至关重要，首先考察空白MSNs对CEM、Ramos、293T、L-02细胞毒性。即使48 h孵育高达100 μg/mL MSNs，所有细胞系活力仍维持90%以上（图6），表明MSNs几乎无细胞毒性。

进一步考察Sgc8-MSN/Dox杀伤靶肿瘤细胞（CEM）和非靶细胞（Ramos、293T、L-02）能力。细胞分别孵育不同浓度游离Dox、MSN/Dox或Sgc8-MSN/Dox 24 h，MTT法评估活力。对靶CEM细胞，游离Dox毒性略高于两种MSN制剂，但Sgc8-MSN/Dox在同等药物浓度下毒性显著高于MSN/Dox（图7）。对Ramos、293T、L-02细胞，游离Dox毒性显著高于MSN制剂，后两者有无Sgc8毒性相似。为进一步证实Sgc8-MSN/Dox通过适配体受体PTK-7靶向杀伤CEM细胞，先用足量Sgc8适配体与CEM细胞孵育2 h阻断结合位点，再共孵育Sgc8-MSN/Dox。MTT显示游离适配体无毒性，阻断结合位点后Sgc8-MSN/Dox毒性显著低于未阻断组（图7e）。结果突显适配体靶向递药并增强杀伤靶细胞能力。这种靶向性可减少非靶细胞摄取药物，允许降低给药剂量，从而降低毒副作用风险。

适配体可作为药物、大分子或纳米载体递送至肿瘤细胞的导向分子，有时本身也具治疗功能。例如AS1411适配体特异性结合核仁蛋白，后者在肿瘤细胞表面表达并参与细胞分化、存活、炎症、血管生成和肿瘤发展。AS1411通过结合核仁蛋白诱导异种移植模型（肾癌、肺癌、MX1乳腺癌、胰腺癌）生长抑制。此外，AS1411适配体功能化多柔比星负载脂质体（Apt-Dox-Lip）在乳腺癌测试中显示巨大应用潜力。凭借优异特性，适配体在广泛临床试验中取得成功。首个适配体药物2005年获FDA批准，此后更多适配体进入临床试验，涉及前列腺癌、肺癌、急性髓系白血病等抗肿瘤试验，无疑为改变传统治疗模式带来新希望。

近年适配体与不同纳米材料结合用于肿瘤靶向治疗，显示出非凡分子识别和靶向能力。但适配体应用开发仍存不可忽视问题：核酸酶是否影响体内稳定性、小分子适配体入体后是否易被肾脏快速清除、体内实际靶向性能是否可行。充分发挥适配体靶向纳米材料潜力，更多体内测试和临床相关实验仍是当前研究重点。同时，肿瘤诊疗一体化是未来重要方向，设计制备更多多功能生物功能材料无疑是发展趋势。

结论

我们构建了适配体修饰MSN递送系统，能高效靶向白血病细胞并促进Dox摄取。这种靶向性结合MSNs缓释和酸性条件下优先释药能力，有助于递送系统在肿瘤部位富集并持续杀伤细胞。通过选择合适适配体，该MSN方法有望靶向几乎任何类型肿瘤细胞。但不可忽视Sgc8-MSN/Dox可能存在上述问题，其体内稳定性和靶向性仍需进一步研究。下一步我们将结合前期研究，使药物递送系统同时负载诊断试剂和药物，赋予其靶向诊断和靶向治疗的诊疗一体化功能。