基于混合金纳米颗粒-氧化石墨烯的无标记免疫测定的增强型等离子体生物传感器

背景

基于碳分子的材料，如碳纳米管 [1, 2]、碳球（buckminsterfullerene, C60）[3]、二维石墨烯 [4,5,6] 和氧化石墨烯 (GO) [7,8,9 ,10,11] 已广泛应用于生物传感器。其中，石墨烯的二维片状结构是一种理想的材料，使薄膜具有高导电性 [12, 13] 和优异的透光性 [14] 特性和高生物相容性 [15, 16]。由于这些原因，石墨烯基材料广泛用于生物医学和电化学传感技术 [17, 18]。此外，光电类生物传感技术主要基于GO[19,20,21]。因为可以调节氧化物基团来吸收和辐射光带隙[22, 23]，所以常用于荧光[24]、表面等离子体共振（SPR）[8,9,10,11,19,20,21 ] 和局部表面等离子体共振 (LSPR) [25, 26] 传感技术。特别是GO具有独特的化学官能团（环氧桥、羟基、成对羧基（羧基和羰基）），可以提高生物分子的亲和力和共价键合。

石墨烯材料与纳米粒子（如 Pt、Au、Ag、Pd 和 ZnO）的合成已被广泛研究，以开发新的纳米复合技术。特别是，金纳米粒子 (AuNPs) 的使用已被用作比色和吸收光谱能量转移的机制。此外，在过去十年中，对可见光下 AuNPs 的研究突出了其独特的等离子体共振特性。由于调整 AuNPs 的大小和形状可以改变光吸收波长的偏移，因此 AuNPs 可用于增强等离子体吸收和信号放大 [27, 28]。因此，AuNPs 因其特殊的光学和光电特性而被广泛用于广泛的应用，例如光电元件，以增强光提取 [29, 30] 和光吸收反应 [31,32,33]。此外，AuNPs 具有生物相容性，并且已对其在化学传感、生物医学成像、癌症治疗 [34, 35]、药物载体 [32, 33]、光热治疗 [36,37,38]、造影剂 [39]、放射增敏剂 [40]、生物传感 [33, 41,42,43] 应用。

通过添加交联剂来修饰 AuNPs 的功能，以避免氧化并充当植物化学物质或载体的载体；因此，这种组合可以提高生物相容性和生物活性 [44,45,46]。胱胺 (Cys) 或 8-巯基辛酸 (MOA) 等交联剂被修饰的 Au 表面上的羧酸封端的硫醇自组装单层 (SAM) 激活。 MOA通过硫醇接头（-SH端）与Au表面结合，形成单层。

此外，对等离子金属材料的研究也被广泛报道。例如，等离子体金属核壳纳米粒子 [47]、纳米星 [48] 和掺氟氧化锡纳米粒子 [49] 已被证明可以增强能带隙，这使得它们在太阳能电池和传感应用中很受欢迎。

此外，基于化学合成 [50,51,52] 和静电自组装 [53] 的 AuNP-GO 杂化物在传感器、能源和催化应用中的使用已有报道。近年来，越来越多的研究集中在 AuNP-GO 杂化物在生物传感器中的使用。这些混合物已被证明可用于开发电化学 [54,55,56,57,58,59] 和表面增强拉曼散射 (SERS) [56, 59] 平台技术，以改善在生物测定中的应用。但是，目前还没有关于使用肉眼或比色快速免疫生物传感器技术的相关报道。例如，基于 AuNP-GO 杂化物的电化学 DNA 生物传感器已被用于检测乳腺癌生物标志物，以实现早期诊断。使用这种生物传感器，ERBB2 生物标志物的检测限 (LOD) 为 0.16 nM，灵敏度为 378 nA/nM [54]。此外，基于 AuNP 点状还原氧化石墨烯 (rGO-AuNP) 纳米复合材料的电化学适体传感器已用于选择性检测 1 pg L ^{-之间的 3,3'4,4'-多氯联苯 (PCB77) 浓度1} 和 10 μg L ^{− 1} , LOD 为 0.1 pg L ^{− 1} [55]。此外，AuNP-GO 杂化物已被用作基于电化学的生物传感器来检测过氧化氢 (H2O2)，食物动态响应范围为 0.1 至 2.3 mM，LOD 为 0.01 mM [57]。另一个很好的例子是 AuNP-GO [56, 59] 和 AuNP-石墨烯 [59] 杂化物在不同应用中用于基于 SERS 的生物传感器，以及 SERS 测量的生物成像。

在这项研究中，我们提出了一种使用逐层自组装的化学合成和 AuNP-GO 杂化物静电自组装的替代方法。我们还分析了修饰的 AuNPs 和 GO 片的生物检测灵敏度及其蛋白质免疫反应。我们设计了两种基于 AuNP-GO 的蛋白质无标记免疫测定，并评估了它们在抗原-抗体相互作用中的响应时间和灵敏度。石墨烯-AuNP 复合材料的出色传感特性包括超高灵敏度和生物分子相互作用的亲和力，这些相互作用会影响具有高特异性的各种生物分子的检测。这些特征意味着这些复合材料在未来的应用中具有广阔的应用前景，并有可能成为临床诊断应用中疾病检测的首选途径。

方法/实验

材料

石墨购自石墨烯超市（Graphene Laboratories Inc., Reading, MA, USA）。通过使用改进的 Hummer 方法 [60] 从石墨薄片中获得 GO 片材，然后超声破碎 5 小时，薄片尺寸为 0.1-1 微米，厚度为 1.1 纳米。胱胺二盐酸盐（Cys，96%）、四氯金酸氢（III）三水合物（HAuCl4·3H2O）、ACS，99.99%（金属基）和 Au 49.5% min 购自 Alfa Aesar Co.（美国）。柠檬酸钠 (HOC(COONa)(CH2COONa)2·2H2O) 购自 J.T.贝克化学公司（美国）。牛血清白蛋白（BSA，SI-B4287，Sigma-Aldrich，美国），兔产生的抗牛白蛋白抗体（抗 BSA，SI-B1520，Sigma-Aldrich，美国），N -羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 和 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC) 购自 Sigma-Aldrich Inc. (USA)。抗BSA抗体结构的免疫球蛋白（Ig）由B淋巴细胞产生并分泌到血浆中。 Ig 分子的单体形式是分子量约为 150 kDa 的糖蛋白。每个 Ig 单体都能够结合两个抗原分子。所有试剂和溶剂均未经进一步纯化直接使用。

我们在 550、400 和 100°C 下使用了三种不同的温度条件，沸腾时间分别为 5、5 和 120 分钟，以控制纳米颗粒的还原。这些不同的温度降低了纳米颗粒，以在 520 nm 处获得相同的吸收光谱，如附加文件 1：图 S1 中清楚所示。

AuNPs 的合成

用于获得 AuNPs 的方法是基于使用柠檬酸钠作为还原剂来还原水中的四氯金酸盐牛磺酸离子。将 15 mL 含有 1 mM Au 的 HAuCl4·3H2O 溶液回流，并将 1.8 mL 38.8 mM 柠檬酸钠 (Na3C6H5O7) 溶液加入沸腾（550°C，1100 rpm）溶液中。 5 分钟后，柠檬酸根离子完全还原金离子，将溶液进一步煮沸 30 分钟（400°C，900 rpm），然后冷却至室温 [36, 61, 62]。该方法产生平均直径约为 15 nm 的球形 AuNP，并且可以使用降低浓度的 0.8 mL 的 38.8 mM 柠檬酸钠生产平均直径约为 60 nm 的 AuNP [63, 64]。化学反应如下：HAuCl4(aq) + C6H5O7Na3(aq) → Au(s) + CO2 + HCOOH。

基于抗原靶点的GO制备

我们设计了一种免疫测定方法来制备如图 1 所示的 GO 片。我们使用 200-μL 的 GO 片溶液，浓度为 0.1 g/l，并激活 GO 片表面的羧基端基以形成共价键使用 400 μM (EDC)/100 μM (NHS) 的混合物以 1:1 的体积比形成固定烃链。使用 EDC/NHS 将 BSA 蛋白固定在 GO 片的末端，以激活和促进​​ GO 上的羧基与 BSA 的-HN2 之间的共价键合反应。然后通过胺 (NH2) 偶联反应将活化的 -COOH 表面与 20 μl 浓度为 100 μg/ml 的 BSA 蛋白进行强共价固定。最后，我们使用离心机反复去除 GO 表面上未固定的 BSA 蛋白。 GO-BSA抗原靶向过程如图1所示。

GO-BSA 交互。使用EDC/NHS反应和基于抗原靶点的GO-BSA制备GO可激活GO片层的羧基

基于抗体探针制备AuNPs和AuNP-GO

我们使用 Cys 和 200 μL 的 15 nm AuNPs 进行了表面功能化。使用衍生的硫醇自组装单层 Cys 对 AuNP 进行化学修饰。 AuNPs 在室温下浸入 Cys (10 mM) 溶液中 2 小时。由于强的 AuNP-S 键（硫醇键），Cys 可以很容易地连接到 AuNPs 和暴露在 AuNPs-Cys-NH2 表面的 –NH2 基团。然后我们添加 20 μl 100 μg/ml 蛋白质的抗体 (antiBSA) 以固定 AuNP 的表面，然后重复离心以去除 AuNP 表面上的非固定 Cys。然后使用去离子水去除任何未固定的 AuNP（Cys 是一种氨基硫醇结构，不需要由 EDC/NHS 激活）。附着在 AuNP 上的 Cys 具有胺 (-NH2) 基团与抗 BSA 表面上的羧基 (-COOH) 基团共价偶联。最后，我们使用重复离心从 AuNPs 表面去除非固定化的抗 BSA 蛋白。通过从 100 μg/ml 到 1 pg/ml 的连续稀释制备一系列抗 BSA 蛋白浓度。不同浓度抗体下AuNP-antiBSA探针的制备如图2a所示。

AuNP-抗BSA和AuNP-GO-抗BSA相互作用。 a的制备 AuNPs和b 基于抗体探针的AuNP-GO

我们使用使用 GO 片法制备的 AuNP 来修饰 AuNP-GO 纳米复合材料。 AuNPs 使用柠檬酸钠还原法制备，60 nm AuNPs 的大小使用 Cys (5 mM) 修改。然后我们使用 EDC/NHS 激活 GO 片表面上的 -COOH 基团。附着在 AuNP 上的 Cys 包括与 GO 片表面上的 -COOH 基团共价偶联的 -NH2 基团。使用 Cys 接头固定 GO 片表面上的 AuNPs 以促进 AuNPs 和 GO 之间的共价键合反应。共价偶联为在 GO 片上键合表面功能化提供了一种稳定且简单的方法。用去离子水彻底冲洗 GO 片以去除 AuNP 接头表面未结合的 GO。 AuNP-Cys 形成了一个新的 AuNP-GO 复合物，然后用 100 μg/ml 到 1 pg/ml 的不同稀释浓度的抗体（antiBSA）探针蛋白进行固定，形成 AuNP-GO-antiBSA，如图 1 所示。 2b.

AuNPs 和 GO Sheets 的表征

使用 300 kV 场发射枪透射电子显微镜（FEG-TEM；Tecnai G2F30S-Twin，Philips-FEI，阿姆斯特丹，荷兰）和高分辨率透射电子显微镜（ HR-TEM）在 FEI Tecnai G20 系统（美国俄勒冈州希尔斯伯勒）上。使用 JEOL JSM-7800F Prime Extreme-resolution 分析场发射扫描电子显微镜（JEOL Inc.，USA）表征 AuNP-GO 和 GO 片的分散和形态。使用紫外可见分光光度计（U-2900，Hitachi High-Technologies Corporation，Tokyo，Japan）在室温下观察波长为200-1100nm的双光束分光光度计的紫外-可见（UV-vis）透射光谱.使用显微拉曼系统（MRI，Protrustech Co., Ltd.，台湾）进行拉曼测量。使用具有 1800 线/mm 光栅和 50-μm 狭缝的风冷光谱仪 (AvaSpec-ULS2048L) 作为检测器。傅里叶变换红外光谱仪 (FTIR) 测量是使用 Bruker Vertex 80v 光谱仪以衰减全反射 (ATR) 模式和分辨率为 2 cm ^{− 1} 的 DTGS 检测器（64 次扫描）进行的 在大约 6 Pa 的压力下在真空中使用 KBr 颗粒。国立清华大学仪器中心为这项工作提供了支持。 X 射线光电子能谱 (XPS) 使用台湾新竹国家同步辐射研究中心的设施进行。使用用于 XPS 的 09A2 U5 光谱光束线进行光电子能谱实验。在整个核心级光电子能谱实验中，固定能量为 380 和 900 eV 的光子用于 C (1s) 和 Co (2p)。实验是在 6 米高能球面光栅单色器上以全电子产率模式进行的。光子入射到法线表面，并且以与法线表面成 58° 的角度收集光电子。所有光谱中的结合能均以 Au 4f ^7/2 核心电平为 84.0 eV。减去线性背景后，光谱拟合基于非线性最小二乘算法的混合高斯-洛伦兹函数[65]。

结果与讨论

结构和形态分析

AuNPs 的大小取决于还原剂的性质以及形成和储存的条件。 SEM 分析表明 GO 片和 AuNPs 均匀地附着在 GO 表面，平均 AuNP 尺寸为 60 nm（图 3）。图 3a 显示了 Au 膜上 GO 片的 SEM 图像，并且 GO 片小于 1 μm。比较 GO 和 AuNP-GO，可以在 AuNP-GO 复合材料中观察到金元素。这表明 AuNPs 已成功吸附在起皱的 GO 表面上。合成的 AuNP-GO 杂化物使用 TEM 进行表征，如图 3b 所示。图 3b、c 显示了合成条件。 10 ml GO sheet 溶液的浓度为 0.1 g/l，200 μl AuNP 溶液的浓度为 2.2 nM。图 3a 中带有 100-nm 比例尺的 TEM 图像和带有 0.5-μm 比例尺的图 3b 显示了不同的尺寸放大，并清楚地表明 AuNP 固定在 GO 片的表面上。 AuNPs呈球形，表明GO片表面的羧基官能团可能在与AuNPs形成化学共价键中起重要作用，如图2b所示。

纳米复合材料的表面形貌分析。 一 GO 片材和 b 的 SEM 图像 AuNP-GO复合材料的TEM图像。 c ERGO AuNP-GO薄膜的TEM图

XPS、拉曼和 FTIR 光谱对 GO 的表征

图 4a 显示了 GO 片的高分辨率 C 1s XPS 光谱分析。结合能为 284.6 eV 时强度最高的 C1s 对应于 C-C (sp2) 的羰基官能团，285.6、286.6、288.2 和 289.4 eV 处的峰对应于芳环中的 C-C (sp3) , 羟基和环氧基中的 C-O，羰基中的 C=O 和羧基中的 O-C=O。金薄膜基材上 GO 片的 C 1s XPS 光谱表明，C–C (sp2)、C–C (sp3)、C–O、C=O 和 O–C=O 的相对原子百分比为分别为 77.44、2.16、18.14、1.77 和 0.49% [66]。图 4b 显示了 NaCl 溶液中 GO 片的拉曼光谱分析，光谱特征峰位于 1614 cm ^{− 1} (G 波段), 1355 cm ^{− 1} （D 波段），2714 cm ^{− 1} （二维波段），2947 cm ^{− 1} (G + D 波段), 和 ~ 3240 cm ^{− 1} （2D' 波段）[38, 67]。使用 ATR-FTIR 光谱进一步分析了 GO 片的形成，以阐明各种含氧物质的特性，如图 4c 所示。该 ATR-FTIR 光谱还揭示了 GO 的几个特征峰； C–O 在 850 cm ^{− 1} 由于 (C–O–C) 环氧化物振动，C–O 在 1080 cm ^{− 1} 由于 (C–O) 烷氧基伸缩振动，C=C 在 1500~1600 cm ^{− 1} 由于芳香族 C=C 键和 C-O 在 1260 cm ^{− 1} 由于（C-O-C）环氧化物不对称振动。 GO片边缘的羧基表现出-COOH伸缩振动，峰值在1652和1731 cm ^{− 1} 对应于来自羰基的 C=O 伸缩振动。光谱还显示在 2900 cm ^{− 1} 处的三个峰 与–CH2 的不对称和对称伸缩振动和1462 cm ^{− 1} 处的变形峰有关 由于位于GO平面上的烯烃基团（C-H）。 GO 的 FTIR 光谱在 3370 cm ^{− 1} 处显示了大范围的 C-OH 和 H2O 振动吸收宽带峰 由于伸缩振动[67]。

GO片的光谱分析。 一 C1s 区域的 XPS 高分辨率扫描，b 拉曼和 c 红外光谱

GO 和 AuNP 与蛋白质相互作用特性的分析

具有蛋白质相互作用分散体的水性 GO 和 AuNP 的 UV-vis 光谱如图 5 所示。AuNP 具有高消光系数和独特的尺寸，具体取决于表面等离子体 (SP) 吸收带。对于 520 和 540 nm 的 SP 吸收光谱 [68, 69]，两个不同尺寸的改性 AuNP 分别为 15 和 60 nm。图 5a 显示了用浓度为 5 mM 的 Cys 修饰的 AuNP（520 nm）溶液，带有 AuNP-Cys 消光带 [69]。 GO 水分散体的紫外-可见光谱产生两个吸收峰：230 nm 处的最大值对应于不同大小的芳香族 sp2 簇中芳香族 C-C 键的 π-π* 等离子体峰，以及 300 nm 处的肩峰对应于由于环氧化物和羰基 (C=O) 键的存在，n-π* 等离子体峰（图 5b）[9, 20]。 GO-EDC/NHS 和 GO-EDC/NHS-BSA 溶液的 UV-vis 光谱（图 5b）表明 GO-EDC/NHS 和 GO-EDC/NHS-BSA 在约 270 nm 处出现峰值，这是可能是由于 GO 和胺基之间的强相互作用 [70, 71]。图 5c 显示了不同浓度的 antiBSA 与 AuNP (60 nm) 的键的吸收光谱。图 1b 显示了 AuNP-antiBSA 探针（样品 B1）的合成溶液。波长在540和755nm处有明显的吸收峰，其中540nm处的波长主要由AuNPs（60nm）引起，755nm处的峰对应于AuNP+Cys+antiBSA组合吸收峰。该结果表明，抗 BSA 浓度的增加导致 540 nm 处的吸光度逐渐增加，并导致 755 nm 处的近红外吸收持续增加。 AuNPs 表面不同的抗 BSA 结合相互作用导致表面折射率发生变化，进而转化为 LSPR 的吸收强度。 LSPR 谱带受粒径影响。 AuNPs 在可见光区显示出很强的 SPR 带。随着中等大小粒子折射率的增加，SPR 峰值位置的偏移可以从可见光到近红外光进行调整。在蛋白质相互作用实验结果中，我们混合了 AuNP-antiBSA，如图 5d 所示。通过绘制 500-760 nm 波段的 LSPR 波长作为测量折射率的函数来确定灵敏度。然后我们使用从 1.45 nM 到 145 fM 的不同浓度的抗 BSA 蛋白稀释，并将它们混合到 200 μl 体积中。 540 和 760 nm 吸收的变化是由不同浓度的 antiBSA 和 AuNP 引起的。 5 分钟后进行光谱测量，结果显示不同浓度的光强度吸收，在 540 和 755 nm 处观察到 AuNP 的 60 nm 吸收峰。这些结果与 AuNP-antiBSA 吸收校准曲线一致。校准曲线由y拟合 =2.43 + 0.25×（相关系数，R ² =0.91) 对于 540 nm 吸收峰，y =2.56 + 0.31×（相关系数，R ² =0.96) 对于 760 nm 吸收峰，其中 x 是抗BSA和y的浓度 是吸光度。

具有抗 BSA 相互作用响应的 AuNP 的紫外-可见吸收光谱分析。 一 AuNPs的SP吸收光谱，b GO 绑定 BSA，c AuNP-anti-BSA探针和d 在 1.45 nM~145 fM 稀释不同浓度的抗 BSA 蛋白时，AuNP 与抗 BSA 相互作用响应的校准曲线

基于免疫分析相互作用的 AuNP-antiBSA 和 AuNP-GO-antiBSA 分析

为了了解 GO 和 AuNP-GO 纳米复合材料的免疫学检测机制，如图 6 所示进行了结合反应的光谱分析。图 6a 显示了 AuNP-GO 和 GO-BSA 纳米复合材料的 UV-vis 吸收光谱。对于 GO 片 (0.1 g/l) 溶液，在约 230 nm [70] 处有一个峰，在 300 nm 附近有一个肩峰，GO-BSA 偶联物在约 270 nm 处出现一个吸收峰，在约230 纳米 [9, 20, 70]. 在 AuNP-GO 纳米复合材料的组合中，分别在 230、300 和 540 nm 处注意到三个吸收峰。 AuNPs和GO片表面之间的π-π堆积或共价键相互作用是将AuNPs锚定在高度生物相容性GO材料上的主要驱动力。使 GO 片聚集在 AuNP 中，导致 200-300 nm 的强吸收带。因此，GO 片的吸收远大于 AuNPs 在可见光波段的吸收。图 6b 显示 AuNP 吸收峰的 UV-vis 光谱在 540 nm [50, 68, 69]。 AuNP+Cys 共轭物的吸收峰位于 540 和 660 nm； AuNP+Cys+GO 偶联物为 230、300、540 和 660 nm； AuNP+Cys+GO+antiBSA 偶联物的波长为 230、270、540 和 660 nm。 GO 片在 230 nm（π-π* 等离子体峰）和 300 nm（n-π* 等离子体峰）处有两个吸收峰。注意到吸收波长的变化，并且认为这种吸光度变化表明抗 BSA（0 fM ~ 1.45 nM）吸收到 AuNP+Cys+GO 表面上的确认。图 6c 显示了如图 2b 所示的 AuNP+Cys+GO+antiBSA 探针（样品 B2）溶液的合成。 540 nm 处抗 BSA 浓度的增加相对较高。图 6c 显示了不同浓度的光强度吸收，在 540 nm 处观察到 AuNP 的 60 nm 吸收峰。 540 nm 处抗 BSA 浓度的增加相对较高。该结果表明，当抗 BSA 浓度增加时，AuNP-GO 可以增强 540 nm 处的等离子体吸收特性。此外，在免疫测定实验中，我们将 GO-BSA (1.52 μM) 靶标（样品 A）和 AuNP+Cys+GO+antiBSA 探针混合，如图 6d 所示。除了 GO 片的疏水性和 π-π 相互作用特性，蛋白质和 GO 片上羧基之间的共价键也支持表面粘附。这一结果可能是由于 AuNP+GO-antiBSA 杂合结构与 GO-BSA 上的其他蛋白质形成稳定的免疫反应。波长在 260 nm 处有明显的吸收峰。除了 GO 片的疏水性和 π-π（π-π* 等离子体峰）相互作用特征外，蛋白质和 GO 片上的羧基之间的共价键也支持表面粘附。 BSA与antiBSA结合前后，GO的π-π*等离子体峰值(230和270 nm)显着偏移，证明BSA与antiBSA呈正键结合。

免疫反应的紫外-可见吸收光谱分析。 一 AuNP结合的GO和GO结合的BSA，b AuNPs 和 GO 结合的抗 BSA，c AuNP-GO-antiBSA探针和d AuNP-GO-antiBSA探针和GO-BSA免疫反应靶点

图 7 显示这些结果与校准曲线非常吻合。对上述实验结果（图 6c、d）的详细分析表明，对相应吸光度平均误差的感应响应分别为 1.3487、1.1776、1.0698、0.8755 和 0.8588（图 7a）和 0.9226、0.804653和 0.695（图 7b），分别对应于 1.45 nM、145 pM、14.5 pM、1.45 pM 和 145 fM 蛋白质浓度。图 7a 显示校准曲线的线性回归为 f(x) =0.918 + 0.124× （相关系数，R ² =0.94) 对于具有抗 BSA 相互作用的 AuNP-GO 探针，其中 x 是蛋白质浓度和 y 是吸光度。此外，图 7b 显示拟合曲线的线性回归方程为 f(x) =0.791 + 0.057× （相关系数，R ² =0.954) GO 和 AuNP-GO 基于免疫分析。

在不同蛋白质浓度下获得的传感响应校准曲线的比较。 一 具有抗 BSA 相互作用的 AuNP-GO 探针的校准曲线。 b 基于免疫分析的GO和GO-AuNPs校准曲线

在定量实验中，我们添加了固定浓度 10 ng/ml 的人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 蛋白作为干扰物。结果表明免疫测定校准曲线上的固定干扰hCG蛋白通过f(x)拟合 =0.843 + 0.113×（相关系数，R ² =0.89) 对于具有抗 BSA 相互作用的 AuNP-GO 探针（图 7a）和 f(x) =0.722 + 0.051× （相关系数，R ² =0.73）对于基于免疫测定的 GO 和 AuNP-GO（图 7b）。

此外，我们的实验结果表明，检测策略允许表面再生而不会损失特异性（四次再生），并且它还可以用于检测动态响应范围为 1.45 nM、145 pM、14.5 pM、1.45 pM 的抗 BSA 蛋白、145 fM 和 0 fM。结果表明，随着抗 BSA 浓度的降低（从 1.45 nM 到 145 fM），即使不存在抗 BSA（0 fM），光谱吸收强度也不会改变最低定量水平。 The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.

结论

We successfully demonstrated a GO-bound AuNP biocompatible nanocomposite in a biosensing mechanism in a rapid and label-free immunoassay for biomolecule interactions. The results showed that the AuNP-GO nanocomposite was biocompatible and exhibited LSPR extinction to biomolecules, which could promote the absorption spectra characteristic peaks, accelerate the reaction of molecules, and enhance the stability of chemical covalent bonds during immobilization. For the detection of antiBSA protein, the limit of detection of the GO and AuNP-GO based on the immunoassay was as low as 145 fM. Among the AuNP-GO biosensors, GO immobilized in the AuNP-GO nanocomposite showed the highest bioaffinity, with good sensitivity, low detection limit, and fast response toward the protein immunoassay. The results of our experiments showed that a fixed concentration 10 ng/ml of hCG protein as an interferer did not affect the test response. Given the growing trend of applying biosensors in POCT, LSPR for AuNP-GO nanocomposite technology is a highly promising and versatile tool for use in immunoassays. Combining the properties of AuNPs and GO sheets to develop new nanocomposites for the synthesis of smart materials shows promise for the development of user-friendly diagnosis applications. In the future, AuNP-GO nanocomposites may be used in innovative immunoassays, rapid detection reagents, and miniaturization, which may in turn make LSPR technology an irreplaceable tool for routine clinical analysis and POCT diagnostics.

缩写

Ag:

Silver

AntiBSA:

Bovine serum albumin antibody

Au:

Gold

AuNP:

Gold nanoparticle

BSA:

牛血清白蛋白

Cys:

Cystamine

EDC：

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG-TEM:

Field-emission gun transmission electron microscope

FTIR：

Fourier-transform infrared spectrometer

GO:

Graphene oxide sheet

HR-TEM:

High-resolution transmission electron microscope

细节层次：

检测限

LSPR：

局域表面等离子体共振

MOA:

8-Mercaptooctanoic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

Pd：

钯

POCT:

Point-of-care testing

Pt:

Platinum

RGO:

Reduction graphene oxide

SAMs:

Self-assembled monolayers

SERS:

Surface-enhanced Raman scattering

UV-vis:

Ultraviolet-visible

XPS：

X射线光电子能谱

ZnO:

Zinc oxide