金纳米颗粒-氧化石墨烯杂化等离子体生物传感器实现超灵敏无标记免疫分析

摘要

本文提出一种新型 AuNP-GO 纳米复合材料，结合氧化石墨烯的高生物相容性与金纳米颗粒的局域表面等离子体共振 (LSPR)。该杂化平台实现蛋白相互作用的无标记检测，灵敏度前所未有。利用 AuNP-GO 传感器，在 10 ng ml⁻¹ hCG 干扰下检测抗 BSA 浓度低至 145 fM。动态范围跨越五个数量级 (1.45 nM 至 145 fM)。结果展示 AuNP-GO 等离子体生物传感器用于快速、即时诊断 (POCT) 和生物标志物筛选的潜力。

背景

碳基纳米材料——石墨烯、碳纳米管、氧化石墨烯 (GO)——因其卓越的电、光和表面化学性质成为生物传感主流。GO 二维结构和富氧官能团 (环氧、羟基、羧基) 赋予高蛋白亲和力并允许共价偶联，使其成为电化学、荧光、SPR 和 LSPR 传感器的理想底物。金纳米颗粒 (AuNPs) 提供可调等离子体吸收、生物相容性和简便表面化学，可作为信号放大剂或光学标签。AuNPs 装饰于 GO 上，杂化材料继承 GO 的快速结合和 AuNPs 的强烈 LSPR，在免疫分析、DNA 检测和酶分析中增强灵敏度。尽管电化学和 SERS 研究广泛，但基于裸眼 AuNP-GO 杂化的快速、比色或无标记免疫分析迄今未见报道。本研究填补这一空白，开发基于化学吸附、LSPR 增强的免疫分析，在水相缓冲液中工作并耐受常见干扰物。

方法/实验

材料

石墨烯 (Graphene Supermarket)、GO (改良 Hummer 法, 0.1–1 µm 片层, 1.1 nm 厚)、胱胺双盐酸盐 (Cys, 96%)、HAuCl₄·3H₂O (99.99%)、柠檬酸钠、BSA、抗 BSA (兔 IgG)、NHS、EDC 均购自 Sigma‑Aldrich 或 Alfa Aesar。所有试剂未经进一步纯化直接使用。

AuNPs 合成

柠檬酸还原法合成 AuNPs：15 mL 1 mM HAuCl₄ 回流 550 °C、1100 rpm；加入 1.8 mL 38.8 mM 柠檬酸钠。5 分钟后，400 °C、900 rpm 沸腾 30 min 并冷却至室温。此法得 ~15 nm 球形 AuNPs；0.8 mL 柠檬酸得 ~60 nm 颗粒。反应：HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH。

GO-BSA 抗原靶标制备

GO 片层 (0.1 g L⁻¹) 用 EDC (400 µM) 和 NHS (100 µM) (1:1 体积比) 活化。BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) 经酰胺键共价偶联，反复离心纯化。图 1 展示 GO-BSA 偶联工作流。

GO-BSA 相互作用。GO 片层羧基经 EDC/NHS 活化制备基于抗原靶标的 GO-BSA

AuNP-抗BSA 探针制备

AuNPs 经 Cys (10 mM, 2 h, RT) 功能化引入暴露 –NH₂ 基团。抗 BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) 经酰胺键偶联无需额外活化，离心除去未结合抗体。100 µg mL⁻¹ 至 1 pg mL⁻¹ 系列稀释制备系列 AuNP-抗BSA 探针 (图 2a)。AuNP-GO-抗BSA 复合物通过 EDC/NHS 活化 GO 羧基共价连接 Cys 修饰 AuNPs，再偶联抗体组装 (图 2b)。

AuNP-抗BSA 和 AuNP-GO-抗BSA 相互作用。制备 a AuNPs 和 b AuNP-GO 基于抗体探针

表征技术

结构和光学表征采用 FE-TEM、HR-TEM、SEM (JEOL JSM‑7800F)、UV-vis 光谱 (U‑2900, Hitachi)、拉曼显微镜 (MRI, Protrustech)、FTIR (Bruker Vertex 80v ATR)、XPS (国家同步辐射研究中心)。所有样品确认 AuNP 尺寸、分布和表面化学。

结果与讨论

形貌与组成

SEM 和 TEM 显示均匀 60 nm AuNPs 均匀分布于皱褶 GO 片层上 (图 3)。XPS 确认 GO 上 C–C (sp²)、C–C (sp³)、C–O、C=O、O–C=O 官能团，Au 4f 峰验证 AuNP 整合。

纳米复合材料表面形貌分析。a GO 片层 SEM 图像 b AuNP-GO 复合材料 TEM 图像 c ERGO AuNP-GO 薜膜 TEM 图像

GO 光谱表征

高分辨 C 1s XPS、拉曼、ATR-FTIR 确认 GO 特征含氧官能团 (sp² C、环氧、羟基、羰基、羧基)。拉曼峰 1355 cm⁻¹ (D)、1614 cm⁻¹ (G)、2714 cm⁻¹ (2D) 佐证层状结构 (图 4)。

GO 片层光谱分析。a C1s 区高分辨 XPS 扫描 b 拉曼 c FTIR

蛋白相互作用与 LSPR 响应

UV-vis 谱显示 AuNPs (15 nm 和 60 nm) LSPR 峰分别在 520 nm 和 540 nm。GO 单独显示 π–π* 吸收 230 nm 和 n–π* 300 nm。功能化后，AuNP-Cys-抗BSA 偶联物呈现 540 nm (AuNP) 和 755 nm (AuNP-Cys-抗BSA) 双峰，随浓度位移 (图 5)。标定曲线 (y = 2.43 + 0.25 x, R² = 0.91 对 540 nm；y = 2.56 + 0.31 x, R² = 0.96 对 760 nm) 确认 1.45 nM 至 145 fM 抗 BSA 线性范围。

AuNP 抗 BSA 相互作用响应 UV-vis 吸收光谱分析。a AuNPs SP 吸收光谱 b GO-结合 BSA c AuNP-抗BSA 探针 d 不同浓度抗 BSA 蛋白 (1.45 nM ~ 145 fM) 稀释下 AuNP 抗 BSA 相互作用响应标定曲线

AuNP-GO-抗BSA 杂化物进一步放大 LSPR 信号。加入 GO-BSA 靶标后，540 nm 峰随抗 BSA 浓度线性位移 (1.45 nM–145 fM)，得 LOD 145 fM (图 6)。AuNP-GO 探针标定 (f(x) = 0.918 + 0.124 x, R² = 0.94) 和单独 GO (f(x) = 0.791 + 0.057 x, R² = 0.954) 显示杂化系统灵敏度优越。

免疫响应 UV-vis 吸收光谱分析。a AuNP-结合 GO 和 GO-结合 BSA b AuNPs 和 GO-结合抗 BSA c AuNP-GO-抗BSA 探针 d AuNP-GO-抗BSA 探针和 GO-BSA 靶标免疫响应

10 ng ml⁻¹ hCG 干扰研究显示极小交叉反应性 (AuNP-GO R² = 0.89；单独 GO 0.73)，确认分析稳健性。传感器经四次再生循环保持性能，指示高表面稳定性。

结论

我们构建了利用 LSPR 实现抗 BSA 145 fM 无标记检测的生物相容 AuNP-GO 杂化材料。纳米复合材料表现出高生物亲和力、快速响应和抗常见干扰物能力，成为即时诊断免疫分析的有力平台。未来工作将探索多重检测、微流控器件集成和临床相关生物标志物适配。

缩写

Ag:

银

AntiBSA:

牛血清白蛋白抗体

Au:

金

AuNP:

金纳米颗粒

BSA:

牛血清白蛋白

Cys:

胱胺

EDC:

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺

FEG-TEM:

场发射枪透射电子显微镜

FTIR:

傅里叶变换红外光谱仪

GO:

氧化石墨烯片层

HR-TEM:

高分辨透射电子显微镜

LOD:

检测限

LSPR:

局域表面等离子体共振

MOA:

8-巯基辛酸

NHS:

N-羟基琥珀酰亚胺

Pd:

钯

POCT:

即时检测

Pt:

铂

RGO:

还原氧化石墨烯

SAMs:

自组装单层

SERS:

表面增强拉曼散射

UV-vis:

紫外-可见

XPS:

X 射线光电子能谱

ZnO:

氧化锌