在怀孕期间接触二氧化钛纳米颗粒会改变母体肠道微生物群并增加大鼠的血糖

介绍

二氧化钛纳米粒子 (TiO2 NP) 是应用最广泛的纳米材料之一，在防晒霜、油漆、墨水和食品中很容易找到 [1, 2]。它们在商业产品的使用过程中很容易被释放并进入人体。值得注意的是，孕妇无法避免接触它们。动物研究表明，当成年雌性小鼠暴露于二氧化钛纳米粒子时，观察到卵巢和生殖系统功能障碍 [3]，单胺能神经递质也受损 [4]。此外，在怀孕小鼠暴露于 TiO2 NPs 后，也观察到了妊娠并发症和不利的出生结果 [5]。上述所有研究表明，TiO2 NPs 对成年雌性动物以及怀孕雌性动物有害，但其机制尚不完全清楚。因此，TiO2 NPs的安全性评价还需开展相关研究。

TiO2 NP用作一种强力抗菌剂；它们可以杀死多种细菌，包括金黄色葡萄球菌 , 沙门氏菌, 变形链球菌 等[6]。抗菌作用实际上是非选择性的，而目前大多数研究主要集中在其杀灭有害细菌的作用上，很少报道二氧化钛纳米颗粒是否会杀死益生菌或其他共生细菌并对人类产生不利影响。也缺乏关于二氧化钛纳米颗粒是否会改变肠道微生物群的正常组成并对孕妇造成不利影响的研究；因此，我们从肠道菌群的角度开展了这项研究。

近年来，越来越多的研究表明肠道菌群与人类疾病包括2型糖尿病[7]和肥胖[8]密切相关。益生菌可影响妊娠期糖尿病孕妇的代谢[9]，改变胎儿糖尿病相关基因的甲基化[10]。研究报告称，成年小鼠暴露于二氧化钛纳米颗粒 12 周后，血浆葡萄糖水平会升高 [11]。孕妇暴露后血糖是否会升高，暴露时间是否会缩短，均未见报道。

上述所有研究都表明TiO2 NPs可能影响肠道微生物群并增加血糖水平，但没有直接证据证明肠道微生物群与母体血糖水平之间存在联系，其机制也不清楚。以往的研究主要集中在成年动物研究上，而二氧化钛纳米颗粒对怀孕女性的影响只是从肠道微生物群的角度进行研究。本研究建立大鼠妊娠暴露模型，探讨母鼠暴露于二氧化钛纳米颗粒后母体肠道菌群是否会发生变化，以及母体肠道菌群如何变化，并试图回答对母体肠道菌群会带来哪些不良影响的问题。 TiO2 NPs 暴露后肠道微生物群的变化对怀孕女性的影响。我们的研究引起了人们对 TiO2 NPs 对孕妇安全性的担忧，并揭示了潜在的机制。

材料和方法

研究设计

根据 Weir, A. 及其同事在人类中进行的一项研究 [12]，确定了大鼠的暴露途径和暴露剂量。从怀孕后第 5 天到第 18 天，雌性大鼠每天灌胃给药 5 毫克/千克体重/天的 TiO2 NP，进展如图 1a 所示。每只大鼠口服前称重，0.5%的甲基纤维素作为载体对照。

一 本研究的实验设计。 b TiO2 NPs 的 TEM 图像，bar =50 nm。 c 介绍了制造商测量或报告的 TiO2 NPs 的主要特征

动物

动物研究是在伦理委员会的许可下进行的。 Sprague-Dawley (SD) 大鼠购自北京维塔尔河实验动物技术有限公司。雌性大鼠 (n =8, 12 周龄）与雄性大鼠（n =8, 14 周龄），将同性别的大鼠关在一个大笼子里。所有大鼠都饲养在温度 (22 ± 2°C) 和湿度控制 (40-60%) 的条件下，12 小时光/暗循环，休息 1 周。然后将雌性大鼠随机分为对照组（n =4) 和暴露组 (n =4)，并在单独的笼子中以 1:1 的比例与雄性交配。每天早晨观察阴道塞，有阴道塞即为妊娠，记为妊娠第0.5天（GD 0.5），将妊娠大鼠分笼饲养。

TiO2 NPs 的制备和管理

TiO2 NP 是从 Sigma-Aldrich (13463-67-7) 购买的商业产品。根据先前的研究 [13]，将 TiO2 NP 的储备溶液以 5 mg/ml 的浓度溶解在甲基纤维素 (0.5%) 中，并超声处理 30 分钟（100 瓦）。采用动态光散射法（DLS）测定甲基纤维素中二氧化钛纳米颗粒的流体力学直径。

粪便收集和粪便总 DNA 制备

每只大鼠的粪便分别在 GD 0（交配前）、GD 10 和 GD 17 与妊娠过程中收集。在分析细菌多样性之前，粪便储存在 - 80°C。根据制造商的方案，使用 Power Soil DNA 试剂盒（Mo Bio Laboratories，Carlsbad，California，USA）提取粪便总 DNA。 DNA浓度采用NanoDrop分光光度计（NanoDrop™ 2000/2000C，美国）测定。

16S rRNA 基因测序和数据分析

16S rRNA基因的细菌测序使用Illumina MiSeq平台（杭州谷禾信息科技有限公司，浙江，中国）进行。如前所述 [14] 用特异性引物扩增细菌 16S rRNA 的 V3 和 V4 区域。扩增纯化后的DNA进行Illumina MiSeq测序。根据先前的研究，使用对微生物生态学的定量洞察 (QIIME) 处理测序数据 [15]。从原始 DNA 片段读取并合并数据，读取长度在 400 到 500 bp 之间。如果出现嵌合序列，则使用QIIME进一步检查。

血液样本采集和血糖测定

采集粪便时，也相应采集所有雌性大鼠的空腹静脉血。分别在 GD 0、GD 10 和 GD 17 饥饿 12 小时后的早晨，从尾静脉收集血样。然后在采集后立即根据制造商的方案使用罗氏 ACCU-CHEK® Performa 测量仪测定空腹血糖水平。

统计分析

使用 Graphpad Prism 6 进行统计分析；所有关于细菌多样性的数据都用箱线图表示为Mean ± SE，并且通过单向方差分析和Dunnett多重比较检验检查所有组之间的显着性。 P <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

二氧化钛纳米颗粒的特性

在动物研究之前测量并展示了 TiO2 NPs 的主要特性。图 1b 显示了透射电子显微镜下 TiO2 NPs 的视野。 TiO2 NPs 的形态接近球形，主直径约为 21 nm。甲基纤维素溶液中的平均流体动力学直径约为 199.5 nm（图 1c）。 TiO2 NPs的纯度≥ 99.5%，表面积为 35–65 m ² /g 根据制造商的报告。最近的研究报道，纳米级和细级二氧化钛在口服暴露后均会增加成年动物的血糖水平[11, 16]，是否会影响怀孕女性的血糖尚不清楚。为阐明这一问题及其潜在机制，我们建立了妊娠大鼠暴露模型，以评估TiO2 NPs的毒性并探讨其对妊娠大鼠的危害。

产品中大多数 TiO2 颗粒的初级尺寸主要在 60 到 300 nm 之间，少数（~ 20%）<100 nm [17]，而最近的研究表明，一些食品中 TiO2 NPs 的含量远大于我们知道（~ 90%），例如，口香糖[18]。众所周知，较小的纳米粒子具有更高的毒性[19, 20]，并且女性在怀孕期间对有害底物更敏感，因此与大多数细颗粒相比，少数 TiO2 NPs 可能对怀孕女性带来不可忽视的影响。在本研究中，我们将怀孕大鼠模型暴露于纳米级 TiO2（~ 21 nm），以研究 TiO2 NPs 对孕妇的潜在风险。

正常妊娠期间细菌多样性的变化

在怀孕期间，怀孕的女性对物理和化学暴露变得更加敏感；为减少人工操作对受精卵着床的影响，选择第5天为囊胚着床完成后的第一天暴露。 GD 17 是分娩前的最后一天，GD 10 是怀孕中期。使用来自对照组的三个时间点（GD 0、GD 10 和 GD 17）的粪便样本检查怀孕期间肠道微生物组的正常动态。我们通过计算 Shannon、Simpson 和 Chao1 指数观察了肠道微生物组随时间的 alpha 多样性，但差异不显着（图 2a）。基于非度量多维尺度（NMDS）分析，不同时间点的样本也没有发现显着差异（图2b），这与之前的研究一致[21, 22]。维恩图（图2c）显示了不同时间点样本中共享和特定的操作分类单元（OTU），对照组中三个时间点（GD 0、GD 10、GD 17）的共享OTU为164；这些结果表明特定 OTU 的数量在怀孕期间随着时间的推移而增加。我们的研究结果表明，正常妊娠期间肠道菌群没有显着变化，这些变化不会带来不良影响，甚至对母体有益。我们的研究结果表明，肠道微生物群的变化可能是妊娠过程的结果，这可能是由怀孕女性的荷尔蒙变化引起的 [23]，类似于怀孕期间阴道菌群的变化 [24]。另外，这可能是正常怀孕的先决条件。

正常妊娠过程中对照（未暴露）大鼠肠道微生物群特征的变化。 一 Shannon、Simpson 和 Chao1 指数揭示的肠道微生物组的 α 多样性。 b 非度量多维缩放 (NMDS) 分析揭示了 beta 多样性。 c 维恩图中显示了唯一且共享的操作分类单元 (OTU) 编号。 D0 Ctrl为交配前对照组大鼠，d10 Ctrl和d17 Ctrl分别为GD 10和GD 17的对照大鼠

怀孕期间暴露于 TiO2 NPs 后细菌多样性的变化

研究表明，肠道微生物群对于维持正常的免疫状况至关重要 [25]；正常怀孕期间肠道微生物群的自然变化可能会调节免疫系统以接受受精卵的着床 [26]。同时，正常妊娠期间肠道菌群的自然变化也可能有助于孕妇适应妊娠期间的代谢变化。一旦肠道菌群的改变超过“适当程度”，就有可能带来不良的妊娠结局。因此，我们在以下部分分析了 TiO2 NPs 暴露后微生物群的变化。通过分析雌性暴露于纳米粒子后 GD 0、GD10 和 GD17 的 α 多样性和β 多样性，评估了 TiO2 NPs 对怀孕期间细菌多样性的影响。结果表明,Shannon的α-多样性呈增加趋势,Simpson指数(P <0.05) 与正常妊娠相比，但 Chao1 没有差异（图 3a）。 NMDS 分析（图 3b）也显示出与正常妊娠无显着差异，但在暴露于 TiO2 NPs 后，样品中的特定 OTU 在妊娠中后期降低（图 3c）。正常妊娠期间，肠道菌群的多样性没有明显变化，但我们观察到雌性小鼠在妊娠期间接触 TiO2 NPs 后母体粪便中细菌多样性增加的趋势，这可能是由于 TiO2 NPs 是一种高效的抗菌剂，并能杀死多种细菌；它们抑制了肠道中的优势细菌，原本被抑制的细菌在这种条件下可以繁殖。研究表明，肠道微生物群与许多疾病有关，包括糖尿病、肥胖症、高血压 [27] 和癌症 [28]；肠道微生物群与妊娠糖尿病之间的联系也已得到证实 [29]。暴露后GD 0、GD10和GD17没有显着变化的原因可能是TiO2 NPs“相对安全”，或者TiO2 NPs暴露引起的微生物群变化可能被怀孕相关的微生物群变化所覆盖。 <图片>

妊娠期暴露大鼠肠道菌群特征的变化[J]. 一 Shannon、Simpson 和 Chao1 指数揭示的肠道微生物组的 alpha 多样性。 b NMDS 分析揭示了β多样性。 c 维恩图中显示了唯一和共享的 OTU 编号。 D0 Test 指大鼠暴露于 TiO2 NPs 前采集的样本，d10 Test 和 d17 Test 指分别在 GD 10 和 GD 17 时采集的大鼠样本

暴露于二氧化钛纳米颗粒后孕中期肠道微生物群的变化

为了排除怀孕的影响并进一步找出 TiO2 NPs 对肠道微生物群的独立影响，我们使用从孕中期 (GD 10) 收集的样本比较了对照组和治疗组之间肠道微生物群的差异。根据 Shannon、Simpson 和 Chao1 指数（图 4a），没有发现 alpha 多样性的显着差异。基于 NMDS 分析观察到两组之间的显着差异（图 4b）。图 4c 显示，与对照组 (Venn) 相比，暴露于 TiO2 NPs 导致处理组中某些特定 OTU 的变化。这些结果表明，TiO2 NPs 相对安全，不会引起明显的菌群失调。但菌群组成，即特定属的丰度，分别在孕中期和孕晚期发生变化。为了进一步找出怀孕期间发生的变化的潜在风险并探索可能带来的不利影响，我们利用生物信息学确定了肠道微生物群的功能变化。结果表明，通过LefSe分析（线性判别分析（LDA）> 2）发现了两种主要生物标志物Ellin6075和梭菌。在 TiO2 NPs 暴露后，Ellin6075 的丰度分别减少和梭菌增加（图 4d）。 Ellin6075 是从澳大利亚农场中分离出来的，但关于其表型特征或功能的信息很少，因此它们对怀孕的影响需要进一步调查。 Yan和他的同事发现，肥胖SD大鼠中梭菌显着增加[30]，这与我们发现梭菌与高血糖共存的发现一致。为了揭示肠道微生物群变化对妊娠的影响，我们通过重建未观察到的状态（PICRUSt）（图 4e）使用群落的系统发育调查预测粪便样本中的基因差异，并发现与 2 型糖尿病相关功能和治疗组脂质生物合成蛋白增强，而牛磺酸和亚牛磺酸代谢减弱。研究人员已经证明肠道微生物群可以产生短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸，并依次调节宿主血糖[31]。牛磺酸和亚牛磺酸的变化也与牛磺酸下调母体血糖浓度有关[32]。

GD 10时对照大鼠与TiO2 NP暴露大鼠肠道菌群特征的变化。a , b 肠道微生物组的 Alpha 和 Beta 多样性表示为 Shannon、Simpson 和 Chao1 指数，以及 NMDS 分析。 c 维恩图显示了 OTU 的特征。 d , e Lefse 和通过重建未观察到的状态 (PICRUSt) 预测的群落系统发育调查分别发现了主要生物标志物和相关基因功能。 D10 Ctrl表示GD 10时的对照大鼠，d10 Test表示GD 10时的暴露大鼠

暴露于二氧化钛纳米颗粒后妊娠晚期肠道微生物群的变化

通过在 GD17 收集的粪便样本检查妊娠晚期的肠道微生物组。在 alpha 多样性中没有发现显着差异（图 5a）。这些样品在 NMDS 模型中被对照组和治疗组显着划分（图 5b）。如图 5c 所示，在治疗组中发现观察到的 OTU 数量减少。我们还使用 Lefse 来识别潜在的生物标志物。值得注意的是，如图 5d 所示，治疗组 Ellin6075 的丰度在妊娠晚期持续下降（LDA> 2），脱盐杆菌科的丰度也因暴露于 TiO2 NPs 而下降（LDA> 2）。在这个阶段，没有观察到糖尿病相关的基因变化，这表明妊娠中期而不是妊娠晚期是 TiO2 NPs 增加母体血糖的敏感窗口。结果与我们的临床认识一致，我们的医生在妊娠中期（大约第 26 周）进行了人类妊娠糖尿病的常见诊断口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)，以筛查孕妇的妊娠糖尿病。孕妇）。结果表明，怀孕大鼠暴露于 TiO2 NPs 后 GD 10 的空腹血糖升高，并且早于先前报道的成年动物结果（~ 12 周）[11]，这证明了怀孕雌性比成年人更敏感。

GD 17时对照大鼠与TiO2 NP暴露大鼠肠道菌群特征的变化。a 比较两组之间呈现α多样性的Shannon、Simpson和Chao1指数。 b NMDS 分析揭示了β多样性。 c 维恩图显示了两组中唯一和共享的 OTU。 d Lefse 发现了候选生物标志物（LDA> 2），并预测了基因功能的差异。 e 在暴露于 TiO2 NPs 后，在 GD 0、GD 10 和 GD 17 测量大鼠的空腹血糖水平。 D17 Ctrl和d17 Test分别为妊娠第17天的对照组和暴露组

二氧化钛纳米颗粒对产前暴露后血糖的影响

为了证明PICRUSt预测的结果，我们分别测量了大鼠在GD10和GD17的空腹血糖。在怀孕的大鼠接触 TiO2 NPs 12 天 (GD5-GD17) 后，测量空腹血糖水平。如图 5e 所示，与对照组相比，大鼠的空腹血糖水平在 GD10 (P <0.05) 和 GD17 (P <0.01) 暴露于 TiO2 NPs 后，这与之前报道 TiO2 NPs 可以增加成年动物的血糖水平一致 [11, 33]。但对照组与GD 17之间的值增量相对较小（~ 0.5 mM），并没有达到妊娠糖尿病的标准[34]。结果表明，母体在孕期单独暴露于TiO2 NPs不足以诱发妊娠糖尿病，但血糖升高可能对孕母及其后代带来不良影响。并且有报道称，母体孕期暴露于较高的血糖可能会增加胎儿肥胖和糖耐量异常的风险[35]，这也提醒我们，TiO2 NPs可能会给后代带来潜在风险。

结论

我们的研究表明，产前接触二氧化钛纳米颗粒可能会增加孕妇空腹血糖水平，肠道微生物群的改变可能是潜在的机制。并得出TiO2 NPs可能增加人类孕妇妊娠糖尿病风险的结论，应引起我们的重视。

缩写

DLS：

动态光散射

GD：

孕期

LDA：

线性判别分析

NMDS：

非度量多维标度

OGTT：

口服葡萄糖耐量试验

OTU：

操作分类单元

PICRUSt：

基于未观测状态重构的群落系统发育研究

QIIME：

微生物生态学的定量洞察

标准差：

斯普拉格-道利

TiO2 纳米粒子：

二氧化钛纳米粒子