基于单颗粒ICP-MS评估人体皮肤中银纳米颗粒理化性质的新型分析体系

摘要

为确保银纳米颗粒（nAgs）在化妆品中安全使用，必须揭示其在皮肤内的物理性质，因这些性质可能随经皮吸收过程发生改变。本研究旨在建立基于单颗粒电感耦合等离子体质谱（sp-ICP-MS）的分析体系，测定皮肤中nAgs物理性质。首先优化皮肤样品溶解预处理方法，证实氢氧化钠处理可回收大部分银纳米颗粒且保持颗粒形态。为分离表皮与真皮，筛选多种微波照射条件，sp-ICP-MS分析显示200 W、30 s最优，该条件确保皮肤分层完整且不改变大多数nAgs物理性质。最后通过小鼠经皮暴露nAgs或Ag⁺后，分析表皮、真皮及外周血中银含量与物理性质，评估体内应用。结果显示：nAgs以离子化形式被吸收分布至深层；Ag⁺吸收分布时物理性质不变。研究表明，为全面理解皮肤暴露nAgs后的响应，必须同时考虑nAgs及其释放Ag⁺在皮肤中的分布与粒径。

引言

纳米技术进步推动工程纳米颗粒（ENPs，粒径<100 nm）快速发展。因增强组织穿透与表面反应等优势，ENPs广泛用于化妆品、食品、医药等产品。银纳米颗粒（nAgs）作为最常见ENPs之一，因持续释放银离子（Ag⁺）产生抗菌性而被添加于化妆品。但nAgs小尺寸赋予的独特理化性质也可能带来风险：可破坏血脑屏障等原本难渗透屏障并诱发炎症；多项研究报道ENPs可穿透皮肤屏障。为确定持续使用安全性，必须通过研究皮肤等组织内颗粒动力学来理解含nAgs的ENPs潜在毒性效应。

安全评估需综合“危害”（潜在毒性）与“暴露条件”。虽全球广泛分析ENPs危害，但针对ENPs暴露条件的研究寥寥。报道指出nAgs与Ag⁺在体内物理性质可变：nAgs电离生成更小粒径nAgs并释放Ag⁺；口服乙酸银后大鼠肠上皮检出小粒径nAgs；我们近期发现哺乳期小鼠暴露不同粒径nAgs后，较大nAgs更易在乳汁中检出。因此nAgs在体内物理性质变化会导致动力学改变，理解风险需评估颗粒粒径等物理性质并区分颗粒与离子形态。

为此我们采用单颗粒电感耦合等离子体质谱（sp-ICP-MS），每停留时间最多引入一个颗粒至分析器，通过峰强度确定粒径、峰频率确定颗粒浓度，峰信号与背景信号结合区分颗粒与离子。我们此前已优化生物样品sp-ICP-MS预处理，半定量测定肝、心、肺、肾、脾等器官中ENPs物理性质。

皮肤由表皮（含角质层SC）与真皮（含血管、淋巴管、神经）组成。ENPs进入不同皮肤层可能诱导不同程度毒性：二氧化钛纳米颗粒分布于表皮角质形成细胞可刺激活性氧产生；无毛小鼠经皮暴露二氧化钛纳米颗粒60天不仅导致真皮变薄等局部毒性病理改变，还经真皮血管扩散致肝液化坏死等全身毒性。此外各层生物响应可能因粒径等物理性质及颗粒/离子差异而异。为理解nAgs使用安全性，必须掌握其经皮暴露后在皮肤中的物理性质与生物分布。

解决此问题需要一种能预处理皮肤并分层且不造成回收损失或ENPs物理性质改变的最优方法。但针对皮肤的此类最优方法尚未建立。

本研究优化预处理方法，通过sp-ICP-MS半定量测定模型ENP——nAgs在各皮肤层中物理性质，并评估其体内有效性。

材料与方法

实验小鼠

购自日本SLC的Slc:ICR雌性小鼠（8周龄）。12 h明暗循环（8:00亮灯，20:00关灯）。食物颗粒与饮水自由获取。所有实验方案经大阪大学动物实验委员会批准。

nAgs与Ag⁺

柠檬酸配体修饰100 nm银纳米颗粒（nAg100）购自nanoComposix（1 mg/mL储备液）。硝酸银（AgNO₃）购自和光纯药（1 mg/mL储备液）。RM8013作传输效率计算标准品（NIST）。使用前各类纳米颗粒超声10 min、涡旋振荡10 s。

试剂

氢氧化钠（0.1 mol/L，Nacalai Tesque）、硝酸（70%，关东化学）、磷酸缓冲液（PBS，pH 7）自配。

预处理方法优化

小鼠表皮与真皮分离、与PBS（w/v=1:10）混合匀浆，加入100 ng/mL nAg100溶液。混合液与以下试剂v/v=1:1混合：0.1 mol/L NaOH、70% HNO₃、PBS。37℃孵育3 h后进行sp-ICP-MS分析。

微波照射分离皮肤层

异氟烷安乐死小鼠，手术剪刀与镊子剪取2 cm²（2 cm×1 cm）背部皮肤，避免组织损伤。Sharp RE-SW-20-H微波炉（2450 MHz）照射皮肤样品（置于盘中央）。按要求分别以200/600/900 W照射10/30/60 s。照射后迅速取出，用手术镊子轻刮快速分离表皮与真皮。用100 ng/mL nAg100溶液分析照射（200 W, 30 s）后回收率与平均粒径。

nAg100与Ag⁺经皮给药

9周龄雌性Slc:ICR小鼠按体重分6组，每组3只。异氟烷麻醉，电推剪（松下）与手动剃刀（吉列）刮除背部毛发。将nAg100与Ag⁺（20 μg/cm²）直接涂覆1.5 cm×1.5 cm（2.25 cm²）背部皮肤，非吸收性塑料膜密封覆盖，同尺寸纱布覆盖塑料膜，自粘弹性绷带缠绕固定，覆盖5天。

皮肤样品与血液预处理

给药5天后采集眶后静脉丛外周血与背部皮肤。剪取2.25 cm²背部皮肤，避免损伤。用2 cm胶带（3M Scotch®）按压10 s顺序剥离角质层（SC），每只小鼠需20片胶带完全去除SC。微波照射（200 W, 30 s）分离真皮与表皮，PBS（w/v=1:10）匀浆。采集血液、真皮与表皮匀浆分别与0.1 mol/L NaOH（v/v=1:1）混合，37℃孵育3 h。ICP-MS测定血液、表皮、真皮混合液总银质量；sp-ICP-MS定量评估nAgs与Ag⁺物理性质。

总银质量测定

Agilent 7700x ICP-MS（Agilent Technologies）测定血液、SC、表皮、真皮总银浓度。条件：射频功率1550 W；载气1.05 L/min Ar；停留时间100 ms。MS模式重复测3次。铑作Ag内标。靶元素¹⁰³Rh、¹⁰⁷Ag。Ag与铑标准液购自和光。

sp-ICP-MS分析与计算

Agilent 7700x ICP-MS进行sp-ICP-MS分析。条件：射频功率1550 W；载气1.05 L/min Ar；停留时间10 ms；分析时间30 s。用Wageningen食品安全研究所发布的RIKILT单颗粒计算工具计算粒径[20]。

统计分析

GraphPad Prism 5.0 for Macintosh统计分析，显著性水平P<0.05。

结果与讨论

构建各皮肤层nAg含量与物理性质测定方法策略

为测定各皮肤层nAg含量与物理性质，需完全溶解皮肤样品制备适合sp-ICP-MS分析的样品，且必须在无回收损失、无物理性质改变前提下分离表皮与真皮，因非经皮吸收nAg有时随角质层胶带剥离被消除[21]。

关于皮肤样品溶解，我们前文报道NaOH预处理为肝、心、肺、肾、脾等动物组织中nAg定量与物理性质分析的最优技术[16]，故本研究皮肤样品采用NaOH预处理。

水热处理可软化胶原纤维、增强酶消化促进表皮-真皮交界（EDJ）分离，广泛用于皮肤分层[22]。虽能高效分层，但水溶液中nAg可能电离导致物理性质改变。报道短脉冲微波照射通过热效应破坏EDJ实现皮肤分层[23,24]。故我们采用无溶液孵育的短时微波照射。

综上提出策略（图1），通过分析各皮肤层nAg回收率与物理性质变化验证。

表皮真皮中nAg100检测预处理方法优化

参考前期研究优化皮肤样品溶解预处理。Ishizaka等[15]报道在NaOH、HNO₃等多种溶解试剂中NaOH预处理最优。故筛选HNO₃（酸性）与NaOH（碱性）溶解试剂。小鼠皮肤分离的表皮真皮匀浆混合nAg100至终Ag浓度100 ng/mL，37℃下分别处理。先评价Ag回收率：ICP-MS显示NaOH与HNO₃处理均达近100%回收（图2a）。再评价物理性质变化：sp-ICP-MS分析颗粒与离子回收浓度。HNO₃处理使nAg100近乎完全电离（图2b），酸性试剂溶解颗粒转化为离子，符合前期研究[15]。相反NaOH处理大部分银纳米颗粒保持颗粒形态（图2b）。进一步评价粒径分布：HNO₃处理平均粒径从100 nm变为40 nm（对应电离）；NaOH处理平均粒径约100 nm（对应初始粒径，图2c）。表明NaOH预处理是检测小鼠皮肤中nAg100的最优方法。

微波照射分离表皮真皮及nAgs回收率与物理性质变化评价

为分离表皮真皮，应用与研究相关且前人报道成功的不同微波照射条件[24]，比较分层效果与物理性质变化。200 W 10 s、600 W 30 s、600 W 60 s、950 W 30 s、950 W 60 s下皮肤无法分层（图3a）；200 W 60 s、600 W 10 s、950 W 10 s仅部分分层；仅200 W 30 s实现表皮真皮完全分离。表明200 W 30 s为最优分层条件。

验证该条件（200 W, 30 s）是否影响nAg100物理性质：表皮真皮匀浆各混合100 ng/mL nAg100，NaOH裂解后微波照射。sp-ICP-MS显示照射组与非照射组nAg100大多保持颗粒形态（图3b）。粒径分布分析显示平均粒径近100 nm，对应初始粒径（图3c）。证实200 W 30 s微波照射可高效分离皮肤层且不改变nAg100物理性质。

综上，我们成功建立半定量测定各皮肤层nAg100物理性质的体系：(i) 胶带剥离法[21]去除SC消除非经皮吸收nAg100；(ii) 微波照射分离表皮真皮；(iii) NaOH处理溶解表皮真皮；(iv) sp-ICP-MS半定量测定各层Ag物理性质。

体内小鼠皮肤层中nAg100与Ag⁺含量物理性质实测评价

评估方法实际应用，分析小鼠经皮暴露nAg100与Ag⁺后表皮、真皮及外周血中Ag含量与物理性质。暴露5天后按优化条件微波分离皮肤层、NaOH溶解。ICP-MS显示所有组别所有组织（表皮、真皮、血液）均检出Ag。真皮与血液中Ag⁺暴露组Ag含量趋于高于nAg100暴露组（图4a），提示离子形式比颗粒形式更易渗透深层组织，两者均可经皮吸收分布（符合前人报道[8,9]）。

评价各样品中nAg与Ag⁺比例：Ag⁺暴露组表皮、真皮、血液中Ag几乎全为离子形式，表明Ag⁺经皮吸收分布时物理性质不变。相反nAg100暴露组表皮真皮中约70% Ag以颗粒形式存在，其余电离；外周血Ag几乎全电离，颗粒形式极难检出（图4b）。评价颗粒形式主要存在的表皮真皮层粒径：sp-ICP-MS显示两层检出粒径约70-80 nm，对应nAg100电离比例（图4c）。提示皮肤暴露nAg100时，其可被吸收分布的同时发生电离。

前人报道表面配体影响纳米颗粒皮肤吸收[25,26]：氨基修饰金纳米颗粒比羧基修饰在小鼠人皮肤外体实验中吸收更多；分子动力学分析显示皮肤穿透能力按中性疏水>阳离子>阴离子金纳米颗粒顺序降低[26]。本研究nAg100柠檬酸修饰带负电，推测难穿透表皮角质层这一初始皮肤屏障。真皮与血液中检出颗粒可能因颗粒经毛孔及表皮穿透。另报道细胞穿透肽（Tat、R7）修饰可提高金纳米颗粒穿透力[25]，未来可考虑类似修饰nAgs以深层递送；且因比表面积大时表面修饰效应更强，可能需减小nAgs尺寸。

结论

本研究建立基于sp-ICP-MS半定量测定各皮肤层nAg100物理性质的预处理方法。结果显示皮肤暴露nAg100可导致其电离、吸收并分布至深层。因此理解皮肤暴露nAg100相关生物响应或毒性，不仅需考虑nAg100分布与粒径，还需考虑熔入皮肤组织的Ag⁺分布。该方法作为风险分析基础技术极具前景。