半定量测定暴露于银纳米粒子后皮肤物理特性的系统的开发和评估

介绍

纳米技术的最新技术进步加速了小于 100 nm 粒子的工程纳米粒子 (ENP) 的开发。与微米或更大尺寸的材料相比，由于其有益的特性，例如增强的组织渗透和表面反应，ENP 被广泛用于各种产品，包括化妆品、食品和药品 [1,2,3]。例如，银纳米粒子 (nAgs) 是最常见的 ENP 类型之一，因其稳定释放银离子 (Ag ⁺ ) [4, 5]。然而，与 nAg 的小粒径相关的独特物理化学性质可能是危险的。众所周知，这些颗粒可能会破坏原本无法穿透的屏障，例如血脑屏障，并诱发炎症 [6]。此外，一些研究报告称，ENPs 可以穿透皮肤屏障 [7,8,9]。因此，为了确定连续使用这些颗粒的安全性，重要的是通过研究这些颗粒在组织（如皮肤）内的动力学来了解与含有 nAg 的 ENP 相关的毒性作用。

为了确保安全，了解使用ENPs可能带来的风险是必不可少的，它涉及“危害”（潜在毒性）和“暴露条件”的综合概念。虽然 ENP 的危害已在世界范围内进行了分析，但只有少数研究检查了与暴露于 ENP 相关的条件 [10]。特别是，据报道，nAgs 和 Ag ⁺ 可以改变它们在体内的物理特性。例如，nAgs 的电离导致形成更小粒径的 nAgs 并释放 Ag ⁺ [11]。相反，口服醋酸银后，可以在大鼠的肠上皮中检测到小粒径的 nAg [12]。此外，我们最近报告说，与较小的 nAg 和 Ag ⁺ ，在暴露于这些 nAg 的哺乳小鼠的母乳中更容易发现较大的 nAg [13]。因此，nAg 可能会改变其在体内的物理特性，进而导致动力学发生变化。因此，为了了解所涉及的风险，有必要评估这些颗粒的物理特性，例如粒径，并区分这些颗粒和体内的离子。

在这方面，我们应用了单粒子电感耦合等离子体质谱法 (sp-ICP-MS)，它在每个停留时间内将最多一个粒子引入分析仪。它是一种有效的方法，可用于通过峰值速率分析峰值强度和粒子浓度来确定粒子大小。可以通过分析峰值和背景信号来区分粒子和离子 [14]。我们之前已经优化了生物样品中 sp-ICP-MS 的预处理方法，以半定量测定肝、心、肺、肾和脾等各种器官中 ENP 的物理性质 [15]。

皮肤包括表皮，包括角质层 (SC)，以及真皮，包括血管、淋巴管和神经 [16]。因此，ENPs进入每个皮肤层可能会引起不同程度的毒性。例如，二氧化钛纳米颗粒在人体表皮角质形成细胞中的分布可能会刺激活性氧的产生[17]。此外，在无毛小鼠中，皮肤暴露于二氧化钛纳米粒子 60 天不仅会导致病理变化，例如由于局部毒性导致真皮变薄，而且还会导致肝脏病理变化，例如由于全身毒性导致的液化坏死。通过真皮中的血管传播 [18]。此外，每一层中的生物反应也可能因物理特性而异，例如颗粒大小以及颗粒和离子之间的差异 [19]。为了了解使用nAgs的安全性，有必要了解nAgs暴露于皮肤后的物理特性和生物分布。

为了解决这个特殊问题，需要一种方法来预处理皮肤并分离其层，而不会在恢复过程中造成任何损失或 ENP 的物理特性发生变化。然而，尚未设计出这样一种针对皮肤的最佳方法。

在本研究中，我们优化了一种预处理方法，该方法通过 sp-ICP-MS 半定量测定皮肤每一层中 nAgs（一种模型 ENP）的物理特性，并随后评估其在体内的有效性。

方法

小鼠

Slc：ICR 小鼠（雌性，8 周龄）购自 Japan SLC（日本静冈）。小鼠被关在具有以下明暗循环的房间中：上午 8 点开灯，晚上 8 点关灯。食物和水以食物颗粒和位于笼子顶部的供水系统的形式提供。所有实验方案均在日本大阪大学动物研究委员会批准的条件下进行。

nAgs 和 Ag ⁺

直径为 100 nm (nAg100) 的柠檬酸盐配体封端的 nAg 悬浮液以储备分散体 (1 mg/mL) 的形式从 nanoComposix (San Diego, CA, USA) 购买。硝酸银 (AgNO3) 购自 Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)，也以储备分散体 (1 mg/mL) 的形式购买。 RM8013 用作计算运输效率的标准，购自美国国家标准与技术研究所（美国马里兰州盖瑟斯堡）。每种类型的纳米颗粒在使用前都经过超声处理 10 分钟。纳米粒子和离子也在使用前涡旋10 s。

试剂

氢氧化钠（NaOH，0.1 mol/L）购自 Nacalai Tesque 公司（日本大阪），硝酸（HNO3，70%）购自 Kanto Kagaku Chemical Industries（日本东京）。制备pH 7的磷酸盐缓冲液(PBS)。

预处理方法的优化

将每只小鼠的表皮和真皮分开，与 PBS (w/v 1:10 的比例），并均质化。将匀浆与 100 ng/mL nAg100 溶液混合。然后用以下试剂之一以 v/v 处理混合物 1:1的比例； 0.1 mol/L NaOH、70% HNO3 或 PBS。样品在 37 °C 下孵育 3 h，然后进行 sp-ICP-MS。

微波照射皮肤分离

每只小鼠都用异氟醚 (Wako) 安乐死，然后用 2 cm ² 使用手术剪和镊子切除（2 cm × 1 cm）背部皮肤样本。在切除过程中特别注意防止组织损伤。使用微波炉（RE-SW-20-H，Sharp，日本）以 2450 MHz 的频率照射皮肤。将皮肤样品放在盘子上并放在微波炉的中央。根据测试要求，皮肤样品分别以 200、600 和 900 W 的功率照射 10、30 和 60 秒。照射后，迅速取出样品，并通过用手术镊子轻轻刮擦快速分离每个表皮和真皮。 100 ng/mL nAg100溶液用于分析辐照后（200 W，30 s）的回收率和nAg平均直径。

nAg100 和 Ag ⁺ 的透皮给药

九周大的雌性 Slc:ICR 小鼠根据体重分为 6 组，每组 3 只。使用异氟醚麻醉小鼠。用理发剪（Panasonic®，大阪，日本）和手动剃须刀（Gillette®，德国）剃掉他们背上的毛发。接下来，nAg100 和 Ag ⁺ (20 微克/厘米 ² ) 被直接施加到表面积为 2.25 cm ² (1.5 cm × 1.5 cm) 的背部皮肤并用不吸水的塑料薄膜紧紧覆盖。一块相同大小的纱布放在塑料薄膜上。用自粘弹性绷带将纱布包裹在皮肤周围，并保持皮肤覆盖5天。

皮肤样本和血液的预处理

治疗后五天，从眶后静脉丛和背部皮肤收集外周血用于分析。接下来，2.25 厘米 ² 使用手术剪刀和镊子切除（1.5 cm × 1.5 cm）背部皮肤样本。在切除过程中特别注意防止组织损伤。在将表皮与真皮分离之前，使用 2 厘米的胶带 (Scotch®, 3M) 依次去除 SC 层。将胶带片压在背部皮肤的治疗区域，然后施加恒定压力 10 秒。需要 20 条胶带才能去除每只小鼠的整个 SC。接下来，用微波照射分离真皮和表皮，并用 PBS (w/v 1:10 的比例）。收集的血液，以及真皮和表皮匀浆，用 0.1 mol/L NaOH 以 v/v 处理 1:1 的比例并在 37°C 下分别培养 3 小时。孵育后，用电感耦合等离子体质谱法 (ICP-MS) 分析血液、表皮和真皮混合物中的总银质量。 nAgs和Ag ⁺ 物理性质的量化和评估 使用sp-ICP-MS进行。

测量银的总质量

为了测量血液、SC、表皮和真皮样品中的总银浓度，使用了 Agilent 7700x ICP-MS 系统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）。进行分析的条件如下： RF 功率 1550 W；载气 1.05 L/min Ar；和停留时间 100 毫秒。在 MS 模式下重复测量三次。铑用作 Ag 的内标。 ICP-MS分析的目标元素为 ¹⁰³ Rh 和 ¹⁰⁷ 银。 Ag和铑标准溶液购自Wako。

sp-ICP-MS 分析与计算

使用 Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) 进行 sp-ICP-MS 分析。分析条件如下：射频功率1550W；载气 1.05 L/min Ar；停留时间 10 毫秒；和分析时间 30 s。单粒子计算工具——由瓦赫宁食品安全研究中心（瓦赫宁根大学，荷兰瓦赫宁根）出版的 RIKILT——用于计算粒径 [20]。

统计分析

所有统计分析均使用适用于 Macintosh 的 GraphPad Prism 软件 5.0 版（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）进行。统计显着性设为P <0.05.

结果与讨论

构建确定每个皮肤层中 nAg 数量和物理特性的方法的策略

为了确定每个皮肤层中 nAg 的数量和物理特性，必须完全溶解皮肤样品并制备适合 sp-ICP-MS 分析的样品。将表皮和真皮分开也很重要，不要在恢复过程中丢失或改变 nAg 的物理特性，因为有时可以通过胶带剥离去除 SC 过程中消除非经皮吸收的 nAg [21]。

关于皮肤样品的溶解，我们之前曾报道过 NaOH 预处理是一种最适合量化和分析动物组织中 nAg 物理特性的技术，如肝脏、心脏、肺、肾、脾[16]。因此，对本研究中使用的皮肤样品进行了NaOH预处理。

水热处理可导致胶原纤维软化并增强酶消化，促进表皮 - 真皮交界处 (EDJ) 的分离，广泛用于将皮肤分为表皮层和真皮层 [22]。尽管这些处理有效地分离了皮肤层，但层中的 nAg 可能会在水溶液中被电离，从而导致其物理特性发生变化。据报道，微波辐射的短脉冲允许通过破坏 EDJ 的热量产生将皮肤分为表皮层和真皮层 [23, 24]。因此，我们在没有孵育的情况下对溶液进行了短时间的微波照射。

总的来说，我们提出了一种策略（如图1所示），通过分析每个皮肤层中nAg的回收率和物理性质变化来验证该策略。

确定每层皮肤组织中 nAg100 的数量和物理特性的策略。为了确定每一层皮肤组织中 nAg100 的数量和物理性质，必须 (1) 完全溶解皮肤组织和 (2) 将皮肤分为表皮和真皮组织，在恢复过程中没有组织损失或改变nAg100 的物理性质。在这方面，我们重点关注（1）NaOH预处理和（2）微波照射

用于检测表皮和真皮中 nAg100 的预处理方法的优化

我们参考了我们之前的研究，以优化溶解皮肤样品的预处理方法。石坂等。 [15]报道称，在NaOH、HNO3等各种增溶剂中，NaOH预处理效果最佳。因此，我们分别测试了 HNO3 和 NaOH 作为酸性和碱性增溶试剂。从小鼠皮肤样品中分离出的表皮和真皮匀浆与 nAg100 混合，以获得 100 ng/mL 的最终 Ag 浓度，然后在 37°C 下用每种增溶试剂处理。首先，我们评估了用这些试剂处理后 Ag 的回收率。 ICP-MS 分析表明仅通过 NaOH 和 HNO3 处理即可实现几乎 100% 的回收率（图 2a）。接下来，为了评估由于每次处理引起的物理性质的变化，我们分析了每个粒子和离子的回收浓度。 sp-ICP-MS 分析表明 nAg100 几乎被 HNO3 完全电离。这表明 HNO3 作为酸性试剂溶解了颗粒并将它们转化为离子，这在之前的研究中也有报道 [15]。相比之下，大部分用 NaOH 处理的 nAg100 保留为颗粒，而不是离子（图 2b）。因此，NaOH 使大部分 nAg100 保持为颗粒形式。最后，评估粒径分布以详细分析物理性质。 HNO3 处理使平均粒径从 100 nm 变为 40 nm，这对应于 nAg100 的电离。相反，NaOH 处理后的平均粒径约为 100 nm，对应于初始粒径（图 2c）。这表明NaOH预处理是检测小鼠皮肤nAg100的最佳方法。

NaOH 预处理是检测真皮和表皮中 nAg100 的最佳方法。筛选了两种增溶剂（HNO3 和 NaOH）作为预处理溶剂来溶解组织。将表皮 (E) 和真皮 (D) 匀浆与 nAg100 混合以获得 100 ng/mL 的最终 Ag 浓度，并在 37°C 下用每种增溶剂处理。 3 小时后，所有样品均通过 ICP-MS 和 sp-ICP-MS 进行分析。 a Ag的回收率，b nAg（黑条）和 Ag ⁺ （阴影条）恢复率和 c 显示了平均粒径。虚线代表初始粒径。数据表示为平均值±标准差。 (n =3)

通过微波照射将皮肤样品分离成表皮和真皮，并评估 nAg 的恢复率和物理特性的变化

为了将皮肤样品分成表皮层和真皮层，我们应用了与我们的研究相关且先前报道成功的不同微波辐射条件 [24]，并比较了它们在皮肤可分离性和皮肤变化方面的性能。物理特性。观察到在200 W 10 s、600 W 30 s、600 W 60 s、950 W 30 s和950 W 60 s条件下，皮肤未能分离成表皮和真皮层。图 3a)。此外，在200 W 60 s、600 W 10 s和950 W 10 s条件下，皮肤仅部分分离为表皮层和真皮层。相比之下，在 200 W 照射 30 秒后，皮肤仅完全分离为表皮层和真皮层。这些结果表明，200 W 照射 30 s 是皮肤层分离的最佳选择。

微波辐射将皮肤分为表皮和真皮的条件筛选和评价。 一 在九种条件下用微波照射皮肤组织并分离成表皮和真皮组织。左图和右图分别显示照射前后的皮肤样本。在右侧面板中，单个、两个和三个白色圆圈分别显示不可分离、部分可分离和完全可分离的条件。比例尺：1 厘米。将皮肤匀浆与 nAg100 混合以获得 100 ng/mL 的最终 Ag 浓度，并在 200 W 下照射 30 秒，并通过 sp-ICP-MS 进行分析。 b nAg（黑条）和 Ag ⁺ （阴影条）回收率和 c 显示了平均粒径。虚线代表初始粒径。数据表示为平均值±标准差。 (n =3)

为了验证这种 200 W 微波辐射 30 s 是否影响 nAg100 的物理特性，我们确定了表皮和真皮层中 Ag 的物理特性。分别与 100 ng/mL nAg100 混合的表皮和真皮匀浆使用 NaOH 裂解，并在 200 W 下照射 30 秒。 Sp-ICP-MS 分析显示，大部分用微波辐射处理的 nAg100 仍为颗粒，未处理组的也是如此（图 3b）。为了详细分析物理性质，还评估了粒径分布。平均颗粒直径几乎为 100 nm，这对应于初始颗粒尺寸（图 3c）。这些研究结果表明，在不改变 nAg100 物理性质的情况下，以 200 W 微波照射皮肤样品 30 s 是一种有效地将皮肤分为表皮和真皮层的方法。

总的来说，这些结果表明我们已经成功开发了一个系统来半定量确定每个皮肤层中 nAg100 的物理特性。具体而言，该方法需要以下内容： (i) 通过使用胶带剥离方法去除 SC 来去除非透皮吸收的 nAg100 [21]； (ii) 通过微波辐射将皮肤分为表皮层和真皮层； (iii) 用NaOH处理溶解表皮和真皮； (iv) 使用 sp-ICP-MS 半定量测定每个表层中 Ag 的物理性质。

通过确定 nAg100 和 Ag ⁺ 的数量和物理特性进行实际评估 在体内的小鼠皮肤层

为了评估这种方法的实际应用，我们分析了小鼠皮肤暴露于 nAg100 和 Ag ⁺ 后表皮和真皮以及外周血中 Ag 的数量和物理性质。 体内。暴露后五天，我们在微波辐射的优化条件下将皮肤分为表皮和真皮，并使用 NaOH 溶解它们，如上一节所述。 ICP-MS 分析表明 Ag 存在于所有组的所有组织（如表皮、真皮和血液）中。在真皮和血液中，Ag ⁺ 与 nAg100 暴露组相比，-暴露组趋于增加（图 4a）。数据表明，虽然离子和颗粒形式都如先前报道的那样经皮吸收和分布 [8, 9]，但离子形式比颗粒形式更容易渗入深层组织层。

nAg100和Ag ⁺ 的半定量物性分析 应用于体内小鼠皮肤。首先，小鼠皮肤暴露于 nAg100 和 Ag ⁺ (20 μg Ag/cm ² ）。暴露五天后，分别通过 ICP-MS 和 sp-ICP-MS 对表皮、真皮和血液中 Ag 的物理特性进行定量和评估。 一 Ag 浓度和 b 在表皮、真皮和血液中检测到的颗粒率。 c 在表皮和真皮中检测到的颗粒的平均直径。虚线代表初始粒径。所有数据均表示为平均值±S.E。 (n =3)。 *p <0.05（学生的t 测试）

接下来，我们评估了 nAg 和 Ag ⁺ 的比率 在每个样本中。在 Ag ⁺ -暴露组，表皮、真皮和血液中几乎所有的Ag均以离子形式被检测到，表明Ag ⁺ 经皮吸收分布，物理性质不变。相反，在暴露于 nAg100 的组中，表皮和真皮中大约 70% 的 Ag 以颗粒形式存在，而剩余的 Ag 被电离。此外，在外周血中检测到的 Ag 几乎完全电离，几乎没有检测到颗粒形式（图 4b）。最后，我们评估了表皮和真皮层的粒径，其中主要检测到颗粒形式。 sp-ICP-MS 分析表明，在两层中检测到的粒径约为 70-80 nm，对应于 nAg100 电离的速率（图 4c）。这些数据表明，当皮肤接触nAg100时，它可以在被电离的同时被吸收和分布。

正如之前报道的那样，纳米颗粒的表面配体会影响它们被皮肤吸收 [25, 26]。例如，在体外实验中，氨基修饰的金纳米粒子比羧基修饰的金纳米粒子在更大程度上被小鼠和人体皮肤吸收 [25]。此外，分子动力学分析表明，皮肤穿透能力从中性疏水性到阳离子再到阴离子金纳米粒子依次降低 [26]。在这方面，本研究推断 nAg100 不太可能穿透表皮（最初的皮肤屏障）中的 SC，因为 nAg100 被柠檬酸盐修饰并带负电荷。因此，在真皮和血液中观察到颗粒的原因可能是颗粒通过毛孔和表皮渗透。

也有报道称，通过使用细胞穿透肽（如 Tat 和 R7）进行修饰，金纳米粒子的渗透性得到了改善 [25]。因此，在未来，可以考虑对 nAg 进行类似的修改，以便将它们更深地传递到皮肤中。此外，可能有必要减小nAg的尺寸，因为表面改性的效果越大，比表面积越大。

结论

在本研究中，我们开发了一种预处理方法，使用 sp-ICP-MS 半定量测定每个皮肤层中 nAg100 的物理特性。使用这种方法，我们发现皮肤暴露于 nAg100 会导致 nAg100 被电离、吸收并分布到更深层。因此，为了了解与皮肤暴露于 nAg100 相关的生物学反应或毒性，可能不仅需要考虑 nAg100 的分布及其粒径，还需要考虑 Ag ⁺ 来自 nAg100，它会融入皮肤组织。因此，这种方法显示出作为可用于风险分析的基本技术的前景。

数据和材料的可用性

数据共享不适用于本文，因为当前研究期间没有生成或分析数据集。

缩写

ENP：

工程纳米粒子

nAg::

银纳米颗粒

Ag ⁺ ：

银离子

sp-ICP-MS：

单粒子电感耦合等离子体质谱

SC：

角质层

nAg100：

直径为100 nm的银纳米粒子

AgNO3：

硝酸银

NaOH：

氢氧化钠

HNO3：

硝酸

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

ICP-MS：

电感耦合等离子体质谱

EDJ：

表皮-真皮交界处