酵母提取物绿色合成银纳米颗粒：可控形貌与增强抗菌活性

摘要

生物合成制备抗菌银纳米颗粒（Ag NPs）是一种无需细胞毒性还原剂和表面活性剂的绿色方法。本文利用酵母提取物作为还原剂和封端剂，生物合成了形貌可控、分散良好的Ag NPs。合成Ag NPs呈均匀球形，尺寸精细，平均粒径13.8 nm。酵母提取物中还原性氨基酸、α-亚麻酸和碳水化合物等生物分子在Ag NPs形成中起重要作用，傅里叶变换红外光谱分析证实了这一点。此外，Ag NPs表面氨基酸在碱性溶液中带净负电荷，最大化静电排斥相互作用，提供超过一年无沉淀的良好稳定性。Ag NPs与氨苄青霉素联用逆转了氨苄青霉素耐药大肠杆菌细胞的耐药性。这些单分散Ag NPs可作为多重耐药细菌株消毒的有前景替代品，对Cos-7细胞显示可忽略细胞毒性和良好生物相容性。

引言

耐药感染是主要死亡原因，对公共卫生构成严重风险。此外，抗菌药物耐药性增加正成为医学紧迫问题[1]。多株金黄色葡萄球菌耐甲氧西林，是医院获得性感染主要原因。此外，其他耐抗生素细菌包括耐青霉素淋球菌和多重耐药大肠杆菌[2,3]。主要耐药机制为外排增加和抗生素吸收减少[4]。另一耐药机制是表达修饰抗生素分子结构酶[5]。尽管大量努力集中于开发下一代抗菌剂，但对优越消毒方法需求日增。

银纳米颗粒（Ag NPs）用于许多应用，如蛋白载体、放射增敏剂、太阳能电池效率提升、抗菌剂[6-8]。纳米颗粒包括金属纳米颗粒中，Ag NPs作为抗菌剂应用最广[9]。实际上，银纳米颗粒对细菌菌株显示显著抗菌活性，但对动物细胞细胞毒性可忽略[10,11]。此外，Ag NPs对真菌、某些病毒和耐抗生素细菌菌株展现抗菌活性。关于作用机制，抑制DNA复制、阻断细胞质膜所需电位差、抑制呼吸链是Ag NPs主要作用机制。因此Ag NPs尺寸、表面结构、可控形状在其抗菌活性和其他应用中起关键作用。制备Ag NPs通用方法涉及在适当表面活性剂存在下还原银离子以实现Ag NPs可控生长[12]。大多数还原剂和表面活性剂对人体组织细胞有细胞毒性并可能造成环境污染。因此开发制备形貌可控Ag NPs绿色方法至关重要。

本文提出利用酵母提取物生物合成Ag NPs新途径。过程中酵母提取物提供还原剂和封端剂，包括氨基酸、维生素、碳水化合物，而银离子作为电子受体。结果，有机封端剂提供表面有利稳定性，单分散Ag NPs可保存超一年无沉淀。发现Ag NPs对耐氨苄青霉素大肠杆菌显示优于氨苄青霉素的抗菌活性。与传统合成方法相比，本文生物合成法具有生物相容性、成本效益、环境友好。此外形貌可控、分散良好Ag NPs对大肠杆菌显示良好抗菌效果。

方法

材料

硝酸银（AgNO₃）、蔗糖（C₁₂H₂₂O₁₁）、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）购自国药集团有限公司。干面包酵母购自AB/MAURI有限公司。大肠杆菌购自TransGen Biotech有限公司。CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒（MTS）购自Promega Biotech有限公司。pcDNA3.4质粒、1×NuPAGE® LDS样品缓冲液、Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Thermo Fisher Scientific公司。氨苄青霉素和Luria-Bertani（LB）培养基购自Sangon Biotech有限公司。所有试剂为分析纯，未经进一步纯化直接使用。全程使用去离子超纯水（18.2 MΩ·cm）。

Ag NPs合成

储存酵母细胞接种于LB培养基，25 °C约150 rpm振荡过夜活化。然后用0.9%生理盐水洗涤活化酵母细胞，分散于2%蔗糖溶液中，25 °C约150 rpm振荡6 h。最后离心2000 rpm 5 min收集无细胞酵母提取物用于Ag NPs生物合成。生物合成过程中，用NaOH溶液将酵母提取物pH调至10，然后在剧烈磁力搅拌下逐渐加入AgNO₃溶液。最后所得Ag NPs用1 kDa透析膜透析5天并冻干进一步表征。

表征

透射电镜（TEM）在JEM-2100显微镜（JEOL，日本）200 kV加速电压观察Ag NPs图像。扫描电镜（SEM）在Carl Zeiss ULTRA plus扫描电镜（Carl Zeiss，德国）配备能量色散光谱仪（EDS），20 kV操作获取图像。紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱在Lambda 950 UV/Vis/NIR分光光度计（Perkin-Elmer，美国）记录。X射线粉末衍射（XRD）用D8 Advance仪器（Bruker，德国）获取。傅里叶变换红外光谱（FTIR）在Vertex 70 FTIR光谱仪（Bruker，德国）上用KBr压片法4000-500 cm⁻¹记录。Ag NPs ζ电位用Malvern Zeta Nano ZS-90（Malvern，英国）25 °C测量。Ag NPs表面元素用X射线光电子能谱（XPS）Kratos AXIS Ultra DLD仪器单色Al Kα源（1486.6 eV）（岛津，日本）鉴定。氨基酸成分用L-8900高速氨基酸分析仪（日立，日本）分析。

细胞毒性实验

为探究制备Ag NPs生物相容性，采用MTS法评价Ag NPs细胞毒性[13]。Cos-7细胞在含10% FBS完全培养基DMEM中培养，37 °C、5% CO₂湿润培养箱。细胞接种于96孔平底板，密度10000细胞/孔，培养24 h。然后用含不同浓度Ag NPs新鲜DMEM培养基替换生长培养基。再孵育24 h后用MTS测定相对存活细胞。用SpectraMax® M5酶标仪（Molecular Devices，美国）490 nm测定吸光度。DMEM培养基中未处理细胞作对照。

SDS-PAGE实验

标准SDS-PAGE用10%（w/v）分离胶和4%浓缩胶进行。样品与1×NuPAGE® LDS样品缓冲液混合煮沸5 min，12000 rpm离心5 min上样。标准蛋白标记作参比对照。胶用0.5%考马斯亮蓝染色。Bio-Rad GelDoc XR+凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）记录凝胶图像。

抗菌活性研究

为测定抗菌活性，测试合成Ag NPs对大肠杆菌杀菌活性[14]。单克隆大肠杆菌37 °C LB培养基中150 rpm振荡过夜培养。菌落用新鲜LB培养基调整OD₆₀₀至0.01-0.02。然后将Ag NPs系列稀释液100 μL加入96孔板。微孔板再接种100 μL稀释大肠杆菌溶液，37 °C孵育16 h。用SpectraMax® M5酶标仪（Molecular Devices，美国）600 nm测定吸光度确定大肠杆菌活性。进行时间进程分析评估Ag NPs对大肠杆菌随时间抗菌敏感性。最后向含10和20 μg/mL Ag NPs无菌管中加入100 μL大肠杆菌溶液。1、2、4、6 h后用SpectraMax® M5酶标仪600 nm测定吸光度。

引入菌落形成单位实验研究Ag NPs对抗生素耐药细菌细胞作用。大肠杆菌稳定表达含β-内酰胺酶基因pcDNA3.4质粒，赋予氨苄青霉素耐药性作为模型。当氨苄青霉素耐药大肠杆菌（E. coli-Amp⁺）达对数生长期，在仅氨苄青霉素处理或Ag NPs联合氨苄青霉素处理下于LB琼脂平板培养，37 °C孵育18 h。计算LB平板形成E. coli-Amp⁺菌落数。所有实验至少重复三次。

结果与讨论

Ag NPs合成

如Scheme 1示意，Ag NPs制备始于酵母提取物生物分子自组装形成酵母胶束。然后Ag⁺在酵母提取物还原剂（包括氨基酸、维生素、碳水化合物）原位还原。形成Ag纳米颗粒被生物分子稳定。Ag NPs表面包覆增强对细菌膜亲和力，增加细胞壁通透性。Ag NPs与肽聚糖相互作用改变肽聚糖构型，最终导致凋亡过程损伤细菌。

Ag NPs结构表征

图1a典型SEM图像显示合成Ag NPs呈球形、尺寸精细。EDX确认Ag NPs形成（图1b）。~3 keV处强光学吸收峰为银纳米晶体表面等离子共振典型吸收峰。微量氧和碳可归因于合成Ag NPs薄层有机封端。AgNO₃溶液与NaOH反应生成少量Ag₂O，因此少量O也可归因于Ag₂O存在。HRTEM进一步表征Ag NPs形貌和尺寸。Ag NPs直径10.3-18.9 nm（图1c），平均粒径13.8 nm（图1d）。Ag NPs尺寸、形状、表面化学对抗菌活性有重要影响。更小尺寸和更高比表面积使Ag NPs更好与细菌膜相互作用进而增强抗菌活性[15-17]。HRTEM图像清晰晶格条纹显示0.15 nm条纹间距（图2a），对应银(220)晶面。图2b典型选区电子衍射（SAED）图案明亮圆环对应(311)、(220)、(200)、(111)晶面[18,19]，证明Ag NPs结晶性质。

Ag NPs UV-Vis光谱在418 nm显示强峰，因表面等离子共振（图3a）。图3b合成Ag NPs黄色溶液指示Ag NPs形成。合成Ag NPs XRD图谱显示四个强峰：77.36°、64.30°、43.52°、38.16°，分别对应银(311)、(220)、(200)、(111)晶面（图3c），经JCPDS卡片No. 04-0783标准银数据确认[20]。XRD图谱证明合成Ag NPs结晶性质，符合前人报道[21]。FTIR分析表征鉴定合成Ag NPs潜在生物分子（图3d）。3405 cm⁻¹宽带对应-OH伸缩振动[22]。2915 cm⁻¹较弱峰归因于-CH₂伸缩振动。酵母提取物1655 cm⁻¹带因羧基C=O伸缩振动，在Ag NPs中移至1573 cm⁻¹，因羧基与Ag NPs相互作用[23]。1375 cm⁻¹尖峰归因于C-N伸缩振动。1048 cm⁻¹和1083 cm⁻¹带分别归因于C-O-C和C-OH伸缩振动[24,25]。这些结果证明酵母提取物生物分子负责Ag NPs生物合成。Ag NPs表面包覆影响对细菌膜亲和力[26,27]。XPS进一步表征Ag NPs状态。图4a XPS全谱扫描清晰峰归因于C 1s、Ag 3d、Ag 3p、Ag 3s、O 1s。Ag 3d(5/2)和Ag 3d(3/2)峰分别在约368.5和374.5 eV结合能观测（图4b）。6.0 eV能量分裂值证明Ag NPs形成[28,29]。

用Malvern Zeta Nano ZS-90测定Ag NPs表面电荷，这是胶体溶液稳定性和分散性重要参数。ζ电位是纳米颗粒扩散层和紧密层边界表面静电势，是生物医用聚合物应用指标[30]。附件Figure S1显示，较低pH 3时Ag NPs ζ电位显示微弱负电荷（-3.2 mV）。Ag NPs ζ电位从pH 7.0的-12.1 mV单调降至pH 11.0的-24.4 mV，确认Ag NPs表面带负电荷基团。Gao等人报道Ag NPs分散稳定性主要归因于表面电荷[31]。Ag NPs表面负电荷基团改善水溶液中稳定性和分散性[32]。

Ag NPs细胞毒性与生物分子分析

合成Ag NPs生物相容性对其进一步生物医学应用重要。为研究Ag NPs细胞毒性，用MTS法检测Cos-7细胞活力。Cos-7细胞与不同浓度Ag NPs孵育24 h。图5a显示，即使Ag NPs浓度高达200 μg/mL，也未显示显著细胞毒性。结论Ag NPs对Cos-7细胞显示可忽略细胞毒性和良好生物相容性。

为探究合成Ag NPs合成机制，分析Ag NPs表面生物分子和酵母提取物。图5b SDS-PAGE分析显示合成Ag NPs表面或酵母提取物中无可检测或边缘蛋白。进一步用高速氨基酸分析仪测定酵母提取物生物分子。附件Table S1汇总显示，酵母提取物含约22种氨基酸，富含谷氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、α-亚麻酸。这些氨基酸等电点约6，除赖氨酸和精氨酸约10-11外。此外可发现多种含-NH₂成分，如尿素、氨、天冬酰胺、谷氨酰胺。酵母提取物中还原性氨基酸、α-亚麻酸、碳水化合物生物分子在Ag NPs形成中起重要作用。有报道微生物提取物生物合成Ag NPs中NADH依赖还原酶[33,34]或硝酸还原酶[35-37]参与还原过程。

酵母提取物生物分子在Ag NPs形成中起决定性作用，保护其免聚集。生物分子稳定剂防止Ag NPs冗余反应[38]。氨基酸两性分子含碱性和酸性基团。这些氨基酸化合物净电荷随酵母提取物溶液pH变化可为负或正，进而影响Ag NPs合成结合能力[39]。碱性溶液中Ag NPs表面氨基酸带净负电荷，最大化静电排斥相互作用[40-42]。酵母提取物生物分子作为封端剂在Ag NPs形成中控制尺寸分布、形状、形貌起关键作用。pH值是研究中影响Ag NPs可控合成重要因素。pH<7时成核低速率发生。较高pH值下Ag NPs几分钟内形成，粒径随溶液pH增加而减小。在生长过程和成核间展示最佳平衡[43]。极端pH值（>11）还原溶液中总出现不稳定团聚Ag NPs[44]。

抗菌活性

大肠杆菌广泛用于评价Ag NPs抗菌活性。大肠杆菌在有无Ag NPs存在下生长证明抗菌能力。图6a显示合成Ag NPs对大肠杆菌呈浓度依赖性显著抗菌活性。生长抑制实验显示Ag NPs浓度>20.0 μg/mL时大肠杆菌完全抑制，相比阴性对照。Ag NPs半抑制浓度（EC₅₀）为13.4 μg/mL。20.0 μg/mL Ag NPs在整个测试时间显示显著抗菌效果，而10.0 μg/mL Ag NPs显示部分抑制效果（图6b）。

为研究Ag NPs是否真正影响抗生素耐药细菌细胞，用菌落形成单位实验评价Ag NPs对耐氨苄青霉素大肠杆菌抗菌活性。E. coli-Amp⁺稳定表达高拷贝数含β-内酰胺酶基因pcDNA3.4质粒，赋予大肠杆菌氨苄青霉素耐药性[45]。E. coli-Amp⁺在仅氨苄青霉素处理或Ag NPs联合处理下LB琼脂平板培养。制备Ag NPs抑制活性见图7。注意Ag NPs联合氨苄青霉素处理显示优于单独氨苄青霉素抗菌活性。相反单独氨苄青霉素处理对E. coli-Amp⁺无抑制活性。抗生素与Ag NPs联合治疗提供克服抗生素耐药细菌细胞互补策略，进一步改善当前治疗方法。本研究总体结果有助于开发替代抗菌抑制剂治疗多重耐药细菌菌株引起感染。

迫切需要不同机制新药对抗细菌耐药。因强效抗菌活性，Ag NPs用于医疗产品、个人护理产品和纺织品。Ag NPs对抗微生物耐药有多重机制[46]。Ag NPs积累细菌膜表面，增加细胞壁通透性。Ag NPs与肽聚糖相互作用改变肽聚糖构型从而损伤细菌膜[47]。Ag NPs形状、表面结构、形貌、分散性、生物相容性特性在其抗菌活性中起重要作用。

结论

本文报道利用酵母提取物制备Ag NPs新型生物合成方法。Ag⁺溶液与酵母提取物混合形成酵母胶束。生物还原生物分子在Ag⁺还原中起主要作用。此外生物分子为合成Ag NPs提供有利稳定性、单分散性、可控尺寸分布，展现超一年无沉淀良好稳定性。高速氨基酸分析揭示酵母提取物富含氨基酸、α-亚麻酸、氨基丁酸等生物分子。Ag NPs对大肠杆菌呈浓度依赖性显著抗菌活性。生长抑制实验显示Ag NPs浓度>20.0 μg/mL完全抑制大肠杆菌。Ag NPs联合氨苄青霉素处理对耐氨苄青霉素大肠杆菌（E. coli-Amp⁺）显示优于单独氨苄青霉素抗菌活性。Ag NPs表面包覆增强对细菌膜亲和力，增加细胞壁通透性。Ag NPs与肽聚糖相互作用改变肽聚糖构型最终导致细菌凋亡。此外生物分子稳定Ag NPs显示低细胞毒性和良好生物相容性对Cos-7细胞。