使用酵母提取物作为还原剂和封端剂的银纳米颗粒的生物合成和抗菌活性

介绍

耐药性感染是导致死亡的主要原因，并已对公众健康造成严重威胁。此外，对抗菌药物耐药性的增加正在成为医学中的一个紧迫问题[1]。 金黄色葡萄球菌的多种菌株 对甲氧西林耐药，是医院获得性感染的主要原因。此外，其他耐抗生素细菌包括耐青霉素淋病奈瑟菌 和多重耐药大肠杆菌 (大肠杆菌 ) [2, 3]。耐药性的主要机制是外排增加和抗生素吸收减少[4]。耐药性的另一个机制是修饰抗生素分子结构的酶的表达[5]。尽管在开发下一代抗菌剂方面付出了很多努力，但对卓越的消毒方法的需求也在增加。

银纳米粒子 (Ag NPs) 已被用于许多应用，例如蛋白质载体、放射增敏剂、太阳能燃料电池效率提高和抗菌剂 [6,7,8]。纳米粒子，包括含金属的纳米粒子，Ag NPs 是最广泛使用的抗菌剂 [9]。实际上，银纳米粒子对细菌菌株显示出显着的抗菌活性，但对动物细胞的细胞毒性可忽略不计 [10, 11]。此外，Ag NPs 对真菌、某些病毒和抗生素耐药菌株表现出抗菌活性。就其作用机制而言，抑制 DNA 复制、阻断细胞质膜所需的电位差和抑制呼吸链是 Ag NPs 的主要作用机制。因此，Ag NPs 的尺寸、表面结构和受控形状在其抗菌活性和其他应用中起着至关重要的作用。制备银纳米颗粒的一般方法包括在适当的表面活性剂存在下还原银离子，以实现银纳米颗粒的可控生长 [12]。大多数还原剂和表面活性剂对人体组织细胞具有细胞毒性，并可能导致环境污染。因此，开发绿色制备形状可控的Ag NPs的方法至关重要。

在这项工作中，我们提出了一种利用酵母提取物生物合成 Ag NPs 的新途径。在此过程中，酵母提取物提供还原剂和封端剂，包括氨基酸、维生素和碳水化合物，而银离子则充当电子受体。因此，表面有机封端剂提供的良好稳定性，即单分散的 Ag NPs，可以保存一年以上而不会沉淀。结果发现，与氨苄西林相比，Ag NPs 对耐氨苄青霉素的大肠杆菌表现出优异的抗菌活性。大肠杆菌 细胞。与传统的合成方法相比，本文提出的生物合成方法具有生物相容性、成本效益和环境友好性。此外，形状可控且分散良好的Ag NPs对E显示出良好的抗菌作用。大肠杆菌 .

方法

材料

硝酸银 (AgNO3)、蔗糖 (C12H22O11)、氯化钠 (NaCl) 和氢氧化钠 (NaOH) 购自国药控股有限公司。干面包酵母购自 AB/MAURI 有限公司。E .大肠杆菌 购自 TransGen Biotech Co., Ltd. CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (MTS) 购自 Promega Biotech Co., Ltd. pcDNA3.4 质粒、1 × NuPAGE® LDS 样品缓冲液、Dulbecco 改良的 Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自赛默飞世尔科技公司。氨苄青霉素和Luria-Bertani（LB）培养基购自生工生物技术有限公司。所有化学品均为分析试剂，无需进一步纯化即可使用。实验全程使用去离子超纯水（18.2 MΩ.cm）。

Ag NPs 的合成

将储存的酵母细胞接种到 Luria-Bertani (LB) 培养基中，并在 25°C 下以大约 150 rpm 的速度振摇过夜以进行活化。然后，将活化的酵母细胞用 0.9% 盐水溶液洗涤并分散在 2% 蔗糖溶液中，在 25°C 下以大约 150 rpm 振荡 6 h。最后，通过在 2000 rpm 下离心 5 分钟收集无细胞酵母提取物用于 Ag NPs 的生物合成。在生物合成过程中，用NaOH溶液将酵母提取物的pH值调至10，然后在强力磁力搅拌下将AgNO3溶液逐渐加入上述溶液中。最后，将获得的Ag NPs用1 kDa透析膜透析5 天，冷冻干燥以进一步表征。

特征

在加速电压为 200 kV (JEOL, Japan) 的 JEM-2100 显微镜上观察 Ag NPs 的透射电子显微镜 (TEM) 图像。扫描电子显微镜 (SEM) 图像在 Carl Zeiss ULTRA plus 扫描电子显微镜 (Carl Zeiss, Germany) 上获得，该显微镜配备有在 20 kV 下操作的能量色散光谱仪 (EDS)。在 Lambda 950 UV/Vis/NIR 分光光度计（Perkin-Elmer，USA）上记录紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱。使用 D8 Advance 仪器（德国布鲁克）获得 X 射线粉末衍射（XRD）图。傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 记录范围为 4000-500 cm ^-1 在 Vertex 70 FTIR 光谱仪（德国布鲁克）上制备为 KBr 颗粒的样品。使用 Malvern Zeta Nano ZS-90（Malvern，英国）在 25°C 下测量 Ag NPs 的 zeta 电位。使用带有单色 Al Kα 源（1486.6 eV）（日本岛津制作所）的 Kratos AXIS Ultra DLD 仪器，通过 X 射线光电子能谱（XPS）鉴定 Ag NPs 上的表面元素。氨基酸成分分析采用L-8900型高速氨基酸分析仪（日本Hitachi）。

细胞毒性分析

为了探索制备的 Ag NPs 的生物相容性，采用 MTS 测定来评估 Ag NPs 的细胞毒性 [13]。 Cos-7 细胞在补充有 10% FBS 完全培养基的 DMEM 中培养，在含有 5% CO2 的湿润气氛培养箱中，37 °C。将细胞以每孔10000个细胞的密度接种于96孔平底板中，培养24 h。然后，将生长培养基更换为含有不同浓度 Ag NPs 的新鲜 DMEM 培养基。再孵育24 h后，通过MTS测定相对存活的细胞。使用 SpectraMax® M5 酶标仪（Molecular Devices，美国）在 490 纳米处测量吸光度。 DMEM培养基中未处理的细胞作为对照。

SDS-PAGE 分析

使用 10% (w/v) 分离胶和 4% 浓缩胶进行标准 SDS-PAGE。将样品与 1 × NuPAGE® LDS 样品缓冲液一起煮沸 5 分钟，然后以 12000 rpm 的速度离心 5 分钟，然后再用于凝胶。标准蛋白质标记物用作参考对照。凝胶用 0.5% 考马斯蓝染色。凝胶图像使用 GelDoc XR ⁺ 记录 凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）。

抗菌活性研究

为了确定抗微生物活性，测试合成的 Ag NPs 对大肠杆菌的杀菌活性。大肠杆菌 [14]。 E 的单个菌落。大肠杆菌 在 LB 培养基中 37°C 下在定轨振荡器上以 150 rpm 过夜生长。用新鲜的 LB 培养基将菌落调整到 600 nm 处的 OD 为 0.01-0.02。然后，将 100 μL 连续稀释的 Ag NP 填充到 96 孔微孔板上。然后用100 μL稀释的E接种微孔板。大肠杆菌 溶液并在 37°C 下孵育 16 小时。 E 的生存能力。大肠杆菌 通过使用 SpectraMax® M5 酶标仪（Molecular Devices，美国）测量 600 nm 处的吸光度来确定。进行时程分析以评估对大肠杆菌的抗菌敏感性。大肠杆菌 随着时间的推移。最后，100 μL E。大肠杆菌 将溶液添加到分别含有 10 和 20 μg/mL Ag NPs 的无菌管中。在 1、2、4 和 6 h 后，使用 SpectraMax® M5 酶标仪（Molecular Devices，美国）测量 600 nm 处的吸光度。

引入菌落形成单位测定来研究 Ag NPs 对抗生素耐药性细菌细胞的作用。 E。大肠杆菌 稳定表达含有 β-内酰胺酶基因的 pcDNA3.4 质粒，该基因赋予氨苄青霉素抗性作为模型。当氨苄青霉素耐药E.大肠杆菌 (大肠杆菌 -Amp ⁺ ) 细胞达到对数期生长，E。大肠杆菌 -Amp ⁺ 细胞在 LB 琼脂平板上生长，单独用氨苄青霉素处理或与 Ag NPs 联合处理，并在 37°C 下孵育 18 h。 E 的数量。大肠杆菌 -Amp ⁺ 计算在 LB 平板上形成的菌落。所有检测至少进行3次。

结果与讨论

Ag NPs 的合成

如方案 1 所示，Ag NPs 的制备始于酵母提取物中生物分子的自组装以形成酵母胶束。然后，Ag ⁺ 被酵母提取物中的还原剂原位还原，包括氨基酸、维生素和碳水化合物。形成的银纳米粒子被生物分子稳定。 Ag NPs 的表面涂层增强了对细菌膜的亲和力，增加了细胞壁的渗透性。 Ag NPs与肽聚糖的相互作用改变了肽聚糖的构型，最终导致细胞凋亡过程对细菌造成损伤。

Ag NPs生物合成示意图

Ag NPs 的结构表征

如图 1a 所示，典型的 SEM 图像显示合成的 Ag NPs 具有球形和细小的尺寸。 EDX 证实了 Ag NPs 的形成（图 1b）。在约 3 keV 处观察到强光吸收峰，这是银纳米微晶表面等离子体共振的典型光吸收峰。少量的氧和碳可归因于合成的 Ag NPs 上的有机覆盖薄层。 AgNO3 溶液与 NaOH 反应生成少量 Ag2O。因此，少量的 O 也可以归因于 Ag2O 的存在。 Ag NPs 的形态和尺寸通过高分辨率 TEM (HRTEM) 进一步表征。 Ag NPs 的直径范围从 10.3 到 18.9 nm（图 1c），平均尺寸为 13.8 nm（图 1d）。 Ag NPs 的大小、形状和表面化学对抗菌活性有重要影响。较小的尺寸和较高的表面积使 Ag NPs 能够更好地与细菌膜相互作用，从而进一步增强抗菌活性 [15,16,17]。 HRTEM 图像中清晰的晶格条纹显示条纹间距为 0.15 nm（图 2a），对应于银的 (220) 平面。如图 2b 所示，Ag NPs 的结晶性质由典型的选区衍射 (SAED) 图案证明，其中明亮的圆环对应于 (311)、(220)、(200) 和 ( 111) 飞机 [18, 19]。

一 Ag NPs的场发射SEM图像，b Ag NPs 的 EDX 光谱，c Ag NPs 和 d 的 TEM 图像 Ag NPs的粒径分布

一 HR-TEM 图像中 Ag NPs 的晶格条纹，b 来自典型选区衍射（SAED）图案的Ag NPs圆环

Ag NPs 的 UV-Vis 光谱在 418 nm 处表现出强峰，这是由于表面等离子体共振（图 3a）。合成的 Ag NPs 的黄色溶液如图 3b 所示，这表明 Ag NPs 的形成。合成的 Ag NPs 的 XRD 谱分析显示在 77.36°、64.30°、43.52° 和 38.16° 处有四个强峰，对应于银的 (311)、(220)、(200) 和 (111) 平面，分别（图3c）。该数据由 JCPDS 卡号 04-0783 [20] 中的标准银数据证实。 XRD 图证明了合成的 Ag NPs 的结晶性质，与之前的报告一致 [21]。 FTIR 分析用于表征和鉴定合成的 Ag NP 上的潜在生物分子（图 3d）。 3405 cm ⁻¹ 处的宽带 对应于 -OH 拉伸 [22]。 2915 cm ^-1 处的较弱峰 分配给-CH2伸缩振动。 1655 cm ⁻¹ 处的波段 在酵母提取物中是由于羧基部分的 C=O 伸缩振动，该带移至 1573 cm ^-1 在 Ag NPs 中，由于羧基部分和 Ag NPs 之间的相互作用 [23]。 1375 cm ⁻¹ 处的尖峰 归因于 C-N 伸缩振动。 1048 cm ⁻¹ 处的能带 和 1083 cm ⁻¹ 分别分配给 C-O-C 和 C-OH 的伸缩振动 [24, 25]。这些结果表明酵母提取物的生物分子负责 Ag NPs 的生物合成。 Ag NPs 上的表面涂层影响了对细菌膜的亲和力 [26, 27]。 Ag NPs 的状态通过 XPS 进一步表征。如图 4a 所示，具有清晰峰的 XPS 光谱全扫描归因于 C 1s , Ag 3d , Ag 3p , Ag 3s , 和 O 1s . Ag 3d (5/2) 和 Ag 3d (3/2) 峰分别在约 368.5 和 374.5 eV 的结合能处观察到（图 4b）。 6.0 eV的能量分裂值证明了Ag NPs的形成[28, 29]。

一 Ag NPs 的紫外-可见光谱，b 合成银纳米粒子的照片，c Ag NPs的XRD图谱，以及d Ag NPs和酵母提取物的FTIR光谱

一 Ag NPs和b的XPS谱全扫描 Ag 3d XPS 光谱

Ag NPs的表面电荷由Malvern Zeta Nano ZS-90仪器测定，是胶体溶液稳定性和分散性的重要参数。 zeta 电位是纳米粒子扩散层和致密层之间边界处的表面静电电位，是生物医学聚合物应用的指标[30]。如附加文件 1：图 S1 所示，在较低的 pH 值为 3 时，Ag NP 的 zeta 电位显示出轻微的负电荷 (- 3.2 mV)。 Ag NPs的zeta电位从pH 7.0时的-12.1 mV单调下降到pH 11.0时的-24.4 mV，这证实了Ag NPs表面的带负电基团。高等人。据报道，Ag NPs 的分散性和稳定性主要归因于表面电荷 [31]。带负电荷基团的存在提高了Ag NPs在水溶液中的稳定性和分散性[32]。

Ag NPs 的细胞毒性和生物分子分析

合成的 Ag NPs 的生物相容性对其进一步的生物医学应用很重要。为了研究 Ag NPs 的细胞毒性, 通过 MTS 分析检测了 Cos-7 细胞的细胞活力。将 Cos-7 细胞与不同浓度的 Ag NPs 孵育 24 h。如图 5a 所示，当细胞用浓度高达 200 μg/mL 的 Ag NPs 处理时，没有显示出显着的细胞毒性。可以得出结论，Ag NPs对Cos-7细胞表现出可忽略不计的细胞毒性和良好的生物相容性。

一 Ag NPs 在 Cos-7 细胞和 b 中的细胞毒性 SDS-PAGE 分析。泳道1：加载缓冲区控制。泳道 2-4：合成的 Ag NP。泳道5：8000 rpm离心的酵母提取物

为了探索合成的 Ag NPs 的合成机制，我们分析了 Ag NPs 和酵母提取物表面的生物分子。如图 5b 所示，SDS-PAGE 分析显示在合成的 Ag NP 表面或酵母提取物中没有可检测的或边缘的蛋白质。我们用高速氨基酸分析仪进一步测定了酵母提取物中的生物分子。如附加文件 1：支持信息的表 S1 中所述，酵母提取物中约有 22 种氨基酸，它们富含谷氨酸、γ-氨基丁酸、装饰物和 α-亚麻酸。这些氨基酸的等电点约为6，赖氨酸和精氨酸的等电点约为10~11。此外，还发现了多种含-NH2 的成分，如尿素、氨、天冬酰胺和谷氨酰胺。酵母提取物中的还原性氨基酸、α-亚麻酸和碳水化合物的生物分子在 Ag NPs 的形成中具有重要作用。据报道，NADH依赖性还原酶[33, 34]或硝酸还原酶参与了微生物提取物生物合成Ag NPs的还原过程[35,36,37]。

酵母提取物的生物分子通过保护它们免于聚集在 Ag NPs 的形成中起决定性作用。生物分子的稳定剂有助于防止 Ag NPs 之间的多余反应 [38]。氨基酸的两性分子包含碱性和酸性基团。这些氨基酸化合物的净电荷可以是负的或正的，这取决于酵母提取物溶液的 pH 值变化，这进一步影响了银纳米颗粒合成过程中的结合能力 [39]。在碱性溶液中，Ag NPs 表面的氨基酸带有净负电荷，使静电排斥相互作用最大化 [40,41,42]。来自酵母提取物的生物分子充当封端剂，在控制银纳米颗粒形成过程中的尺寸分布、形状和形态方面起着关键作用。 pH值是影响研究中Ag NPs受控合成的重要因素。当 pH 值低于 7 时，成核速率较低。在较高的 pH 值下，Ag NPs 可以在几分钟内形成，并且粒径随着溶液 pH 值的增加而减小。证明了生长过程和成核之间的最佳平衡 [43]。不稳定和团聚的Ag NPs总是出现在极端pH值(> 11)溶液的还原过程中[44]。

抗菌活性

E。大肠杆菌 Ag NPs 的抗菌活性已被广泛评估。 E的成长。大肠杆菌 在存在或不存在 Ag NPs 的情况下证明了抗菌能力。如图 6a 所示，合成的 Ag NPs 以浓度依赖的方式对 E 表现出显着的抗菌活性。大肠杆菌 .生长抑制试验证明E完全减少。大肠杆菌 与阴性对照相比，Ag NP 浓度高于 20.0 μg/mL。 Ag NPs 的半抑制浓度 (EC50) 为 13.4 μg/mL。 20.0 μg/mL Ag NPs 的剂量对E 表现出显着的抗菌作用。大肠杆菌 在整个测试时间内，10.0 μg/mL Ag NPs显示出部分抑制作用（图6b）。

一 E的生长抑制。大肠杆菌 和 b 抗菌作用的时程分析

为了研究 Ag NPs 是否真的影响抗生素抗性细菌细胞，我们评估了 Ag NPs 对氨苄青霉素抗性大肠杆菌的抗菌活性。大肠杆菌 通过菌落形成单位测定。 E。大肠杆菌 -Amp ⁺ 稳定表达含有 β-内酰胺酶基因的 pcDNA3.4 质粒的高拷贝数，该基因赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性。大肠杆菌 [45]. E。大肠杆菌 -Amp ⁺ 细胞在 LB 琼脂平板中生长，单独使用氨苄青霉素处理或与 Ag NPs 联合处理。制备的Ag NPs 的抑制活性如图7 所示。值得注意的是，Ag NPs 与氨苄西林联合处理显示出比单独使用氨苄西林更好的抗菌活性。相反，氨苄青霉素单独处理对大肠杆菌没有抑制活性。大肠杆菌 -Amp ⁺ .抗生素和银纳米颗粒的联合治疗提供了一种克服抗生素耐药细菌细胞的补充策略，进一步改进了当前的治疗方法。本研究的总体结果有助于开发替代抗菌抑制剂来治疗由多重耐药菌株引起的细菌感染。

E的成长。大肠杆菌 -Amp ⁺ 单独使用氨苄青霉素 (50 μg/mL) 或与 Ag NPs (25 μg/mL) 联合治疗。 一 高密度和b E的低密度。大肠杆菌 -Amp ⁺ 细胞

非常需要具有不同机制的新型药物来对抗细菌耐药性。由于其强大的抗菌活性，Ag NPs 已被用于医疗产品、个人护理产品和纺织品。 Ag NP 对抗微生物耐药性的机制有多种 [46]。 Ag NPs 积累在细菌膜表面，增加细胞壁的渗透性。 Ag NPs 和肽聚糖之间的相互作用改变了肽聚糖的构型，从而破坏了细菌膜 [47]。 Ag NPs的形状、表面结构、形态、分散性和生物相容性等特性对其抗菌活性有重要影响。

结论

在此，我们报告了一种使用酵母提取物制备 Ag NPs 的新型生物合成方法。当Ag ⁺ 溶液与酵母提取物混合。生物还原生物分子在还原 Ag ⁺ 中起主要作用 .此外，生物分子为合成的Ag NPs提供了良好的稳定性、单分散性和可控的尺寸分布，表现出良好的稳定性超过一年无沉淀。高速氨基酸分析显示，酵母提取物富含生物分子，包括氨基酸、α-亚麻酸和氨基丁酸。 Ag NPs 以浓度依赖的方式对大肠杆菌表现出显着的抗菌活性。大肠杆菌 .生长抑制试验证明E完全减少。大肠杆菌 Ag NPs 的浓度高于 20.0 μg/mL。与单独使用氨苄西林相比，Ag NPs 与氨苄西林联合处理对耐氨苄西林的大肠杆菌表现出优异的抗菌活性。大肠杆菌 (大肠杆菌 -Amp ⁺ ） 细胞。 Ag NPs 上的表面涂层增强了对细菌膜的亲和力并增加了细胞壁的渗透性。 Ag NPs与肽聚糖的相互作用改变了肽聚糖的构型，最终导致细菌凋亡。此外，这些由生物分子稳定的Ag NPs对Cos-7细胞表现出较低的细胞毒性和良好的生物相容性。

数据和材料的可用性

相应作者可根据合理要求提供支持本研究结论的数据集。

缩写

Ag NP：

银纳米粒子

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

E.大肠杆菌 ：

大肠杆菌

EDS：

能谱仪

FBS：

胎牛血清

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

HRTEM：

高分辨率透射电镜

LB：

卢里亚-贝尔塔尼

SAED：

选区衍射

SEM：

扫描电镜

TEM：

透射电子显微镜

紫外可见光：

紫外可见

XRD：

X射线粉末衍射