以壳聚糖、N-酰化壳聚糖和壳聚糖寡糖为 DNA 载体的金纳米粒子

背景

基因治疗可以简单地定义为一种将遗传物质导入细胞以用于不同目的的方法，其中包括治疗遗传疾病[1]。在用于基因治疗的两种主要 DNA 载体类型（病毒和非病毒）中，最后一种具有无免疫原性、依从性好、非感染性 [2]、储存稳定性和易于生产等优点。另一方面，即使逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒载体具有高转染率和快速转录，它们也存在从循环中快速清除、毒性、免疫原性和容量降低等缺点。携带大量信息 [3,4,5]。通常，在非病毒载体的情况下，外源 DNA 被加载到质粒上，并在整个结合物或复合物的形成过程中受到保护和稳定。特别是，壳聚糖 (CO) 已被研究用于开发非病毒 DNA 载体，因为它显示出高转染率和低毒性，在细胞间运输过程中保护 DNA 免受核酸的影响 [4]。这种广泛存在于自然界中的聚合物（被发现是甲壳类动物壳的主要成分和许多真菌细胞壁的一部分 [6]）是一种多糖，可在几丁质转化后获得（获得 2-amino-2-deoxy -β-D-吡喃葡萄糖重复单元，但仍保留少量 2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖残基 [7]）（图 1a）。在大多数情况下，天然壳聚糖的医学应用需要对聚合物进行一些修改；需要克服的主要缺点是在生理 pH 值下不溶和在稀酸溶液中粘度高 [8]。一些研究人员指出，细胞转染动力学取决于载体的大小和形状 [1, 8,9,10,11,12]，例如，Huo 等。阿尔。报道了这些特性如何与金纳米粒子的穿透效率相关[10]。

壳聚糖的溶解度可以通过改变链中剩余乙酰基的分布和乙酰化程度来改变 [13]。另一种控制壳聚糖物理特性的方法是酰化（图 1b）。根据氨基的可用性和乙酰化程度，可以控制壳聚糖的一些生物相互作用，通过与脂肪酸酰化来增加其疏水性，例如 [7]。乐天等阿尔。 [7] 报道了用于药物控释基质的壳聚糖 N-酰化。巴特拉伊等。阿尔。 [14] 获得了 N-酰化壳聚糖稳定的金纳米粒子，用于生理条件下的应用，展现了非酰化壳聚糖的优点。壳聚糖的另一个有用的修饰是聚合物链长度的减少（壳聚糖寡糖，COS）[15]。在从壳聚糖获得的多种 COS 的特性中，它们较低的粘度和较高的水中溶解度对许多应用非常有用[16]。据报道，低分子量壳聚糖可能会增加细胞摄取，主要是因为其链长较短（2-10 个 D-葡糖胺单位）（图 1c）和游离氨基 [17,18,19]。此外，以壳寡糖为还原剂合成金纳米粒子，不含任何有毒试剂[20]。

a的化学结构 壳聚糖，b 酰化壳聚糖和c 壳寡糖

金纳米粒子 (AuNPs) 促进了新型纳米材料的开发，利用其光学特性和高物理稳定性使其成为多种应用的非常可行的选择 [21,22,23,24,25]；因此，它们通过具有更高的密度并因此减少摄取时间来改进脂质复合物或聚合物的细胞转染[12]。由于金对氨基 (-NH2)、氰基 (-CN) 和硫醇 (-SH) 官能团具有很强的亲和力，因此为多种类型的官能化提供了广阔的机会 [9, 26]。例如，通过将阳离子聚合物添加到金纳米粒子中，改善核酸相互作用和静电吸附，可以获得阳离子单层 [27, 28]。通过这种方式，壳聚糖和金结合的纳米复合物利用了两种材料的生物学应用优势[29,30,31,32,33]，代表了一种很有前途的DNA载体开发材料[5,10,12,14]。

有多种生物方法可以合成 AuNP，包括使用碳水化合物、微生物、酶、维生素和生物聚合物等 [34]。在所谓的绿色合成 [35] 之间，使用壳聚糖作为还原剂和稳定剂的一锅法合成方法已被证明对于生物医学应用而言更加可调和安全 [36, 37]。与传统合成方法一样，一锅法合成时，得到的粒径取决于还原剂的浓度；这样，在壳寡糖的特殊情况下，必须控制壳聚糖/金比以获得不同的粒径，壳聚糖的分子量是影响纳米颗粒尺寸和形状分布的重要因素。这项工作旨在评估不同的基于壳聚糖-AuNP 的纳米复合物用于 DNA 转染，包括绿色/一锅合成 5 kDa 壳聚糖寡糖，其分子量低于类似应用中报道的那些 [36, 38]。

在 HEK-293 细胞系 (Homo sapiens （人）-上皮形态-胚胎肾-胎儿）与 pSV-β-Gal 和 pIRES2-EGFP 质粒。根据 Corsi 等人的说法，这些测试是根据转染效率和细胞毒性来选择的，这取决于细胞类型。阿尔。 [4] 与MG63和间充质干细胞相比，HEK-293细胞的转染更有利。

方法

纳米复合材料合成

每个实验都是用含有改性和未改性壳聚糖的金纳米粒子进行的；使用了两种主要的合成方法：一种涉及用简单形式的壳聚糖 (CO-AuNPs) 和具有酰基的疏水改性壳聚糖 (Acyl-CO-AuNPs) 化学合成金纳米粒子，另一种是绿色/一-使用短链壳聚糖（壳聚糖寡糖，COS@n-AuNPs）进行锅合成。图 2 显示了每个合成的示意图；相应的实验步骤描述如下。

每个合成的示意图：a –b 用简单形式的壳聚糖 (CO-AuNPs) 和疏水改性的酰基 (Acyl-CO-AuNPs) 和 c 化学合成金纳米粒子 –f 短链壳聚糖（壳聚糖寡糖，COS@n-AuNPs）的绿色/一锅法合成

材料

氯化金 (III) 三水合物 (HAuCl4∙3H2O)、硼氢化钠 (NaBH4)、低分子量壳聚糖（50-190 kDa，脱乙酰度 75%）和壳寡糖（低分子量，5 kDa）购自 Sigma Aldrich .清洗所有玻璃器皿，并将其置于新鲜制备的王水 (HCl:HNO3, 3:1 v /v ) 24 h，使用前用 Mili-Q 水彻底冲洗，去除任何金属痕迹 [39]。

壳聚糖-金纳米颗粒 (CO-AuNPs)

壳聚糖-金纳米颗粒的合成是按照 Huang 等人进行的。阿尔。 [9] 的方法论。为此，将 20 mg 低分子量壳聚糖溶液 (2 mg/ml) 加入 10 ml 1% 乙酸中，涡旋混合直至完全溶解并储存过夜。使用0.22 μm聚醚砜注射器过滤器过滤2 毫升所得溶液，然后通过强烈搅拌30 分钟将其与1 ml 10 mM HAuCl4·3H2O溶液混合。 0.4 ml新鲜配制的100 mM NaBH4冷溶液用作还原剂；边搅拌边滴加，观察到颜色迅速由黄色变为酒红色；之后，继续搅拌总时间为 2 h（图 2a）。

酰化壳聚糖-金纳米颗粒 (Acyl-CO-AuNPs)

己酰氯（C6H11ClO，Sigma Aldrich）用于合成酰化壳聚糖-金纳米颗粒。

凝胶

壳聚糖（低分子量）酰化按照 Remant Bahadur 等人报道的方法进行。 [6] 略有修改。为此，在磁力搅拌下将0.83 g壳聚糖添加到100 ml的1%乙酸溶液中，持续24 小时。用0.22-μm聚醚砜注射器过滤器过滤5 毫升该溶液，然后在剧烈搅拌下缓慢加入0.1-M氢氧化钠(NaOH)溶液将其pH调节至7.2。将1 毫升己酰氯加入到5 毫升最后一种溶液中，并将所得混合物搅拌5 小时。用氢氧化物溶液将混合物的 pH 值调至 6.8-7。所得凝胶用丙酮沉淀并在4 °C下以5000 rpm离心20 分钟。通过用甲醇 (50–60 °C) 洗涤 3 次并倾析去除过量的己酸，使其在炉子上干燥 3 天。该凝胶用于纳米复合材料的合成。

纳米复合材料

将 1 毫升 10-mM HAuCl4∙3H2O 溶液加入到 2 ml 凝胶中，该凝胶在 0.1 M HCl 溶液中稀释为 0.33%，搅拌 1 小时。最后，在搅拌的同时加入最后 0.4 ml 0.1-M NaBH4 新鲜制备的冷溶液，在完成 2 小时的连续搅拌之前，金纳米颗粒明显形成，呈粉红色/红色转变（图 2b）。

壳寡糖-金纳米颗粒 (COS@n-AuNPs)

COS@n-AuNPs 是按照 Manivasagan 等人报道的改进方法制备的。 [20]。将壳寡糖 (COS) 添加到 10 ml HAuCl4∙3H2O 溶液中，并在 80 °C 下搅拌 60 分钟。通过改变 COS 的量（100 和 200 mg）和 HAuCl4∙3H2O 溶液中金的浓度（0.003 和 0.017 wt%）进行了四种合成。表 1 显示了每个实验在 AuNP 合成中使用的参数。金纳米颗粒的形成随着酒红色/粉红色转变为明显，在每种情况下记录不同时间的颜色变化，这取决于还原剂和金前体的量。通过在 12,000g 离心纯化获得的纳米复合材料 30 分钟（图2c-f）。

纳米复合材料表征

红外光谱

用于 CO-AuNPs 的壳聚糖、用于 Acyl-CO-AuNPs 的酰化壳聚糖和用于 COS@n-AuNPs 系列的壳聚糖寡糖通过 FTIR 光谱法（Spectrum One，Perkin Elmer）表征，通过比较样品间官能团特征带的强度。根据 Remant Bahadur 等人的说法，取代度 (SD) 是根据 IR 光谱信息估计的。阿尔。 [6].

ξ-潜力

Zetasizer（Nano Z，Malvern）用于评估复合材料表面电位。纳米复合材料有望成功粘附到 DNA 上形成复合物。 ξ- 在复合物形成之前和之后评估电位以确认 DNA 粘附后​​的变化。 1.5 ml 适当稀释的样品用于表面电位测量，使用毛细管细胞（DTS 1060，Malvern）。

紫外-可见光谱

UV-Vis 光谱（UV-1800 m，Shimadzu）在 400 到 700 nm 范围内，通过 530 nm 附近的表面等离子体共振带初步确认金纳米颗粒的形成。另外，新制备的纳米复合材料的光谱用于定性评估样品的光稳定性；这是通过与合成后 150 天从相同样品获得的光谱进行比较，通过跟踪表面等离子体共振带周围的变化，为每种方法选择一个样品，并使用 COS@2-AuNPs 作为 COS@n-AuNP 的最具代表性来完成的系列。以石英池为样品容器，去离子水为空白。

透射电子显微镜 (TEM)

TEM 显微镜（JEM 1010，JEOL）用于确定形状和粒度分布。对于 TEM 图像，通过将 10 μl 溶液沉积在 200 目铜网格载体上，用 Formvar 覆盖，并在室温下干燥 15 分钟来制备纳米复合材料样品。利用Matlab®软件开发的自制成像处理程序，对每个样品选取三幅图像进行分析。

复杂的形成和附着度

纳米复合-pDNA

pSV-β-Gal (6.82 kb) 和 pIRES2-EGFP (5.3 kb) (pDNA) 从转化的 DH5α 大肠杆菌 中分离 .使用 Mo Bio® UltraClean Microbial DNA Isolation Kit，通过碱裂解进行质粒纯化。琼脂糖凝胶电泳用于验证质粒的结构完整性，使用高性能紫外线透射仪，使用 Kodak Gel Logic 100 数字成像系统获取图像。使用 Gen5 程序通过 Synergy™ 2 Multi-Detection Microplate Reader 验证质粒 DNA 浓度和纯度。通过将质粒 DNA (pDNA) 与每种类型的金-壳聚糖纳米颗粒纳米复合材料在无血清 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM，Sigma-Aldrich）中以 200 到 400 ng 的质粒量混合来获得复合物。 pDNA与纳米复合材料的粘附通过使用琼脂糖凝胶在0.8%和90 V电压下电泳60 分钟来评估。

壳聚糖-金纳米颗粒-pDNA 复合物转染 HEK-293 细胞

细胞培养

HEK-293 智人 （人）-上皮形态-胚胎肾-胎儿细胞在含有胎牛血清（SFB，Sigma-Aldrich）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中在 37 °C 和 5% CO2 气氛下培养。对于 pDNA 转染，将 HEK-293 细胞以每孔 12,000 个细胞接种在 96 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 气氛中培养 24 h，达到 90% 融合。

使用 pIRES2-EGFP 的转染效率

体外 pDNA 纳米复合材料的功能化是通过从孔中倾倒培养基直到几乎没有覆盖细胞并在每个孔中加入复合溶液（15 μl 纳米复合材料和 200 ng DNA），在相同的培养条件下孵育 2 h 来进行的。之后加入500 μl完全DMEM培养48 h。 pIRES2-EGFP转染通过荧光显微镜（Axio Vert.A1，Carl Zeiss）直接评估。

使用 pSV-β-Gal 的转染效率

X-gal 组织化学用于评估 β-半乳糖苷酶活性，通过修改 HEK-293 细胞系上的 pSV-β-Gal 质粒表达；在这种方法中，转染的细胞变成蓝色。如上所述进行体外 pDNA 纳米复合材料功能化，在相同培养条件下孵育 2 小时。之后，加入500 μl完全DMEM培养24 h，换培养基再培养24 h。去除培养基后用50 μl无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤2次1×，然后用2%甲醛和0.2%戊二醛混合液固定细胞5 min；之后，将它们用50 μl PBS 1×洗涤两次。在用 50 μl PBS 1x 洗涤两次之前去除固定剂，然后用 0.4 mg/ml X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，Sigma-Aldrich）稀释的混合物在 5 mM 亚铁氰化钾 (Meyer) 和氯化镁 2 mM (Meyer) 中，PBS 1×。然后，将细胞在室温下孵育 24 h。通过明场显微镜（AE2000，Motic）观察β-半乳糖苷酶的表达，每孔取5个视野，物镜× 40，预计转染细胞变为蓝色。通过将具有 β-半乳糖苷酶表达（变为蓝色）的细胞与每个区域的总细胞进行比较来评估转染效率。 LipofectAMINE ^TM 2000（30 μl）作为每个测试的阳性对照。

染料排除法的细胞活力

细胞传代后24 小时使用微量培养。去除培养基，细胞用PBS洗涤1次，然后加入40 μl复合溶液。之后，将细胞在 37 °C、含 5% CO2 的气氛中培养 2 小时。对于染料排除，用50 μl PBS 1×和20 μl台盼蓝（PBS 1×上的0.2％）从细胞中洗涤复合溶液。使用最后一种混合物，将细胞在 37 °C 和 5% 的 CO2 气氛中孵育 10 分钟。在最后一次孵育后，从孔中除去染料并通过用 50 μl PBS 1× 洗涤两次来清洁。通过明视野显微镜观察细胞，对每个视野的总细胞计数蓝色染色细胞（死亡或受损）。获得了在水中不同复合物浓度的细胞活力测试，从 0.1 mM 到 3 mM，CO-AuNPs 和 Acyl-CO，浓度为 3 mM； COS@3-AuNPs 和 COS@4-AuNPs，浓度为 0.5 mM； COS@1-AuNPs和COS@2-AuNPs的最低浓度(0.1 mM)。

软件 Image J （开源软件 (开源软件 ) 许可 ) 与插件基于图像的核计数工具-ICTN 用于细胞计数，用于转染和活力测试。

结果和讨论

纳米复合材料的合成与表征

在本工作合成的三种配合物中，COS@n-AuNP 值得特别关注，因为它们的合成没有使用有毒试剂，如硼氢化钠或十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)。据报道，壳聚糖适合作为还原剂和稳定剂以及合成所需大小和形状的 AuNP 复合物的最佳浓度，这取决于多种因素：反应时间、温度、壳聚糖脱乙酰度及其分子量等 [38] , 40]。在此考虑下，采用不同浓度的HAuCl4∙3H2O和壳聚糖溶液，四种COS@n-AuNP合成的壳聚糖分子量均保持在5 kDa不变。

图 3 显示了本工作中合成的 AuNPs-壳聚糖纳米复合材料的 UV-Vis 吸收光谱。壳聚糖 (CO-AuNPs) 的等离子体带位于 534 nm，酰化壳聚糖 (Acyl-CO-AuNPs) 位于 507 nm，各种壳聚糖寡糖的等离子带位于 533 nm (COS@1-AuNPs)，530@2 nm (COS@1-AuNPs) -AuNPs)、535 nm (COS@3-AuNPs) 和 536 nm (COS@4-AuNPs) 证实了金纳米粒子的存在。该图中的插图显示了所获得的纳米复合材料的图片，其着色取决于纳米颗粒的浓度、尺寸、形状和表面功能化。

纳米复合材料的紫外-可见光谱。插图中的值对应于局部表面等离子体共振的最大波长。这些最大值如下：对于 CO-AuNPs 在 534 nm (0.1 M NaBH4) (a )，对于 Acyl-CO-AuNPs 在 507 nm (b )，以及 COS-@n-AuNP 壳聚糖寡糖在 533, 530, 535, 536 nm 处，分别在 1-4 种不同厚度的纳米复合材料制备中 (c )

纳米复合材料的稳定性

图 4 显示了新合成的纳米复合材料的 UV-Vis 吸收光谱与合成后 150 天的比较；可以观察到，每种情况下的两个光谱基本保持相同，共振带的最大值没有显着移动，也没有额外峰值的迹象。这些结果定性地表明所获得的纳米复合材料具有较高的稳定性。

金纳米颗粒纳米复合材料在合成后 150 天的紫外-可见吸收光谱的稳定性：化学合成的 CO-AuNPs (a ) 和酰基-CO-AuNPs (b ) 和绿色/一锅法合成 COS@2-AuNPs (c )

三种不同壳聚糖样品的红外光谱如图 5 所示。该技术用于通过比较其在红外 (IR) 区域内的吸收带（这是化学结构的特征）与 IR 来鉴定酰化壳聚糖数据库。一些特征红外波段值得指出：壳聚糖（50-190 kDa，75% 脱乙酰度）波段在 1656 cm ⁻¹ , 1593 cm ⁻¹ , 和 1373 cm ⁻¹ 对应于酰胺基团（分别为酰胺 I、II 和 III）； 2895 cm ⁻¹ 处的波段 对应C-H键，3200-3500 cm ^-1 N-H 和 O-H 键。对于酰化壳聚糖，在 1651 cm ^-1 处获得红外波段 , 1591 cm ⁻¹ , 和 1369 cm ⁻¹ 对应于酰胺基团（分别为酰胺 I、II 和 III），以及 3200–3500 cm ^-1 对应于 N-H 和 O-H 键。根据红外光谱数据[7]证实壳聚糖酰化：1591 cm ^-1 的谱带 与天然壳聚糖相比，由于酰化壳聚糖上的仲酰胺数量较多，酰化壳聚糖的 。 3200–3500 cm ⁻¹ 内的带 天然壳聚糖中的 N-H 和 O-H 振动特征，由于伯酰胺还原，酰化壳聚糖和壳聚糖寡糖消失。

壳聚糖、酰基壳聚糖和壳寡糖的 FT-IR 光谱。波段在 1591 cm ⁻¹ 对应于仲酰胺； 3200–3500 cm ^-11 区域对应于 N-H 和 O-H 振动

根据 Bahadur 等人的说法，估计了酰化壳聚糖的取代度。阿尔。 [6]，由以下表达式：

其中 A 1651 =1.973965 和 A 3350 =1.977278 对应于酰化壳聚糖在 1631 cm ^-1 处的吸光度（分别为酰胺 I 和 OH 振动） 和 3350 cm ⁻¹ 分别，0.25 对应于游离胺基团。得到75%的N-酰化度。

ξ 潜力

获得每种复合材料的 ξ-电位值如下（表 2，“ξ-电位”列）：43.3 mV（CO-AuNPs）、40.2 mV（酰基-CO-AuNPs）、52.2 mV（COS@1-AuNPs） , 55.3 mV (COS@2-AuNPs), 51.6 mV (COS@3-AuNPs), 和 46.3 mV (COS@4-AuNPs)。由于壳聚糖中的胺基团，所有纳米复合材料的潜力都是积极的，因为它是计划通过静电力实现 DNA 复合物形成的。复合物形成后，ξ-电位值的降低证实了 DNA 的成功粘附（表 2，“ξ-电位/DNA”列）。

透射电子显微镜 (TEM)

图 6 显示了每种纳米复合材料的代表性 TEM 显微照片，以及用于尺寸分布计算的纳米颗粒尺寸直方图。获得每个纳米复合材料的尺寸分布如下：获得每个样品的三个 TEM 图像，并使用由 Matlab® 开发的自制图像处理软件进行分析，酰基-CO-AuNPs 的纳米颗粒数为 500，CO-AuNPs 为 1000 , COS@n-AuNP 系列为 100。每个样品的平均尺寸总结在表 2 的“平均 TEM 直径 (nm)”列中。值得指出的是，与文献[36,38,41,42,43]报道的其他绿色合成方法获得的类似纳米颗粒相比，壳寡糖合成的AuNPs呈球形，具有更好的粒径分布。

a 的 TEM 显微照片 4.7 nm 酰化壳聚糖 AuNP，b 3.5 nm 壳聚糖 AuNPs (0.1 M NaBH4)，c 7.4 nm 寡糖壳聚糖 AuNPs (COS@1)，d 15.6 nm 寡糖壳聚糖 AuNPs (COS@2)，e 10 nm 寡糖壳聚糖 AuNPs (COS@3) 和 f 14 nm寡糖壳聚糖AuNPs (COS@4)

复杂的形成和粘附程度：纳米复合-pDNA

对所有 pDNA 复合物和纯 DNA 进行电泳图谱，取不同浓度的质粒；结果如图 7 所示。图 7a 显示了纯质粒和所有带有 200 和 300 ng 质粒的复合物的相应电泳图。这些电泳图谱中纳米复合材料样品的分布如下：第 1 和第 2 道的酰基-CO-AuNPs（300 和 200 ng），第 3 道的 CO-AuNPs（300 ng），COS@1-AuNPs（300 和 200 ng）在 4 和 5，COS@2-AuNPs（300 和 200 ng）在 6 和 7，COS@3-AuNPs（300 和 200 ng）在 8 和 9，COS@4-AuNPs（300 和 200 ng）在 10和 11，以及 300 ng 纯 pDNA 在泳道 12。对于所有测试，使用 10 μl 复合溶液。该图显示只有 pDNA 在凝胶中移动（如第 12 道所示），其他 pDNA 复合物保留在其相应的孔中，通过这种方式证实了 pDNA 在所有复合物上的粘附。这是由于保留在金纳米颗粒表面的壳聚糖氨基的正电荷与DNA螺旋的磷酸基团的负电荷相互作用所致。

一 具有 200 和 300 ng pDNA 浓度的纳米复合物的电泳图。泳道 12 对应于纯 pDNA。 b CO-AuNPs 和 Acyl-CO-AuNPs 与 300 ng pDNA，泳道 3 中的纯 pDNA。c COS@2-AuNPs 纳米复合物，300 和 350 ng DNA，400 ng 纯 pDNA，位于泳道 3。d 1:10稀释的相同CO-AuNPs和Acyl-CO-AuNPs，泳道3分别为纯DNA对照

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et.阿尔。 [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). 一 HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

数据和材料的可用性

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

缩写

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNPs：

金纳米粒子

CO:

Chitosan

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

FTIR：

傅里叶变换红外

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

TEM：

透射电子显微镜