生物素功能化氧化还原敏感壳聚糖寡糖纳米粒包覆藻蓝蛋白实现姜黄素靶向递送

摘要

本研究设计了一种包覆藻蓝蛋白（PC）并负载姜黄素（CUR）的生物素-壳聚糖寡糖-二巯基二丙酸-姜黄素（BCSC）纳米粒（CUR-BCSC@PCs），旨在提高CUR的生物相容性。通过¹H-NMR确认了BCSC的结构。CUR-BCSC@PCs的平均流体动力学直径为160.3 ± 9.0 nm，生物模拟蛋白冠赋予了纳米粒优异的稳定性，并有潜力避免血液循环中的蛋白质吸附。体外释放实验证实，具有氧化还原响应外壳的CUR-BCSC@PCs对高浓度谷胱甘肽敏感。此外，CUR-BCSC@PCs通过增强CUR的细胞内摄取，有效增加了对A549细胞增殖的抑制活性。这些结果表明，CUR-BCSC@PCs作为高效药物递送载体在癌症治疗中具有广阔的应用前景。

研究背景

壳聚糖寡糖（COS）具有β-(1-4)-连接的D-葡糖胺结构，主要通过壳聚糖或几丁质的脱乙酰和酶水解脱聚制备，来源于节肢动物外骨骼或真菌细胞壁[1, 2]。值得注意的是，壳聚糖及其改性材料可作为吸附剂去除重金属和染料[3]。多项研究表明，COS具备抗癌、抗炎、抗氧化和免疫刺激等生物学特性[4]。因其生物相容性好、水溶性高、可化学修饰，COS被视为无毒药物递送载体材料[5, 6]。

为提高疏水性抗癌药物溶解度并降低对正常组织毒性，研究者探索能自组装成特定粒径范围胶束的共聚物[7, 8]。这些共聚物组装体可被动或主动到达并渗透肿瘤部位。胶束由两部分组成：疏水药物封装的核心，以及控制体内药代动力学性质的外层壳或冠[8]。Wang等[9]通过化学修饰将脱氧胆酸接枝到COS链上形成两亲性嵌段共聚物，可在低成本无机溶剂中自组装成胶束，其疏水核心包裹槲皮素，显著提高了抗癌药物水溶性及槲皮素生物利用度。

姜黄素（CUR）是姜黄的主要化学成分[10]。近年来大量研究证实CUR可通过多种信号通路影响肿瘤细胞生长并增强免疫系统[11]。此外，CUR还是具有良好光动力特性的光敏剂[12]，是癌症治疗的有前景药物。但其溶解性差、稳定性低、生物利用度有限，阻碍了临床应用[13]。为克服这些缺点，研究者通过药物递送系统改善CUR生物利用度。例如，Chen等[14]设计了一种新型双pH敏感药物载体，增强了CUR水溶性并改善其抗肿瘤效果。

藻蓝蛋白（PC）主要来自蓝细菌，是一种水溶性集光色素蛋白，在光合作用中捕获并传递光能转化为化学能[15]。PC具有抗癌[16]、抗炎、抗氧化等多重生物学特性，备受食品医药领域关注[15, 17]。Hao等[16]发现PC通过下调TIRAP抑制非小细胞肺癌细胞生长。PC还作为无副作用的优良剂用于肿瘤光动力治疗（PDT）[18,19,20]。将PC用作荧光探针需与生物素、抗体、链霉亲和素等特异性识别元件偶联[21, 22]。生物素是一种水溶性维生素，为人体必需微量营养素，具有肿瘤靶向特性[23]。生物素特异性受体蛋白（亲和素、中性亲和素、链霉亲和素）在多种癌细胞表面高表达，远超正常细胞[24, 25]。因此，生物素化纳米粒作为受体介导内吞的药物递送系统被广泛研究[24]。

本研究构建了一种新型PC功能化纳米载体，CUR-BCSC@PCs制备过程如图1所示。COS与CUR间的二硫键赋予两亲性载体材料还原敏感性[26]。CUR位于疏水内核，受COS/PC外壳保护。利用生物素与PC的相互作用及带正电COS与带负电PC的静电相互作用，将PC修饰到CUR-BCSCs表面。CUR-BCSC@PCs预期可通过改善渗透性、增强渗透滞留效应（EPR效应）及生物素受体靶向作用到达肿瘤组织[27]。肿瘤微环境中谷胱甘肽浓度高于正常细胞，CUR-BCSC@PCs通过巯基-二硫键交换反应解体，实现肿瘤细胞高药物浓度[23, 28, 29]。本文描述的CUR-BCSC@PC纳米递送系统不仅提高了CUR生物利用度，还有潜力在临床肿瘤治疗中发挥疗效。

材料与方法

材料

CUR购自上海展云化工有限公司。COS购自山东维康生物科技有限公司。PC购自浙江滨梅生物科技有限公司。3,3'-二巯基二丙酸购自上海阿达马斯试剂有限公司。碳化碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、二甲氨基吡啶（DMAP）、四氢呋喃（THF）、草酰氯、生物素购自上海阿拉丁生化科技有限公司。L-谷胱甘肽（GSH）和Hoechst 33342购自上海西格玛-奥德里奇。透析袋（MWCO 300 Da）购自北京百欧泰科技有限公司。甲酰胺由天津福宇精细化工有限公司制备。去离子水为实验室自制。

选用A549细胞系（人肺癌细胞）（北京贝纳培养集藏）评价新型纳米载体细胞毒性。A549细胞在DMEM培养基（山东烟台赛尔西生物科技有限公司）中培养。胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone。青霉素和链霉素购自上海西格玛-奥德里奇。3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴化物（MTT）亦购自上海西格玛-奥德里奇。

CUR-BCSC@PCs合成

CUR-BCSC@PCs合成路线见图2，详细实验步骤如下。

COS-S-S-CUR合成

通过酰氯催化酯化反应的两步法合成3,3'-二巯基二丙酸功能化COS。

步骤1：将3,3'-二巯基二丙酸（42.05 mg, 0.25 mmol）和干燥THF（4 mL）置于棕色圆底烧瓶中搅拌溶解。冰浴条件下加入稀释THF的草酰氯（0.3 mmol），反应在35℃维持搅拌3 h。旋转蒸发除去未反应草酰氯得产物1。将CUR溶于含34 μL三乙胺的3 mL THF中，冰浴下滴加至含产物1的烧瓶，搅拌15 min后，氮气保护下50℃搅拌6 h。旋转蒸馏除去三乙胺和THF，柱层析纯化得纯品HOOC-S-S-CUR。

步骤2：纯品HOOC-S-S-CUR与EDCI（1.2 eq）和DMAP（1.2 eq）在甲酰胺中活化2 h。随后加入溶于4 mL甲酰胺的COS，55℃搅拌12 h。反应完成后，用透析袋（MWCO 300 Da）透析，冻干12 h。

BCSC和生物素-COS合成

将生物素、EDCI、DMAP溶于3 mL甲酰胺转入棕色圆底烧瓶，30℃搅拌2 h后，将溶于3 mL甲酰胺的COS-S-S-CUR滴加，45℃反应2天。最终产物用透析袋（MWCO 300 Da）在去离子水中透析，经离心和冻干获得氧化还原敏感BCSC。生物素-COS合成采用相同方法将生物素连接到COS链上。

使用DMSO-D₆和D₂O混合溶剂测定COS-S-S-CUR、BCSC和生物素-COS的¹H-NMR。

CUR负载BCSC胶束（CUR-BCSCs）制备

采用自组装法制备CUR-BCSCs。将10 mg BCSC溶于4 mL甲酰胺，混合1 mL CUR溶液（1 mg/mL，甲酰胺溶解）。混合液用透析袋（MWCO 300 Da）在去离子水中透析24 h，每2 h换水一次。CUR-BCSCs经800 nm、450 nm、220 nm密理博膜过滤。

CUR-BCSC@PCs制备

将制备的CUR-BCSCs与水溶性PC（1.0 mg/mL）混合，4℃孵育30 min。随后用100 kDa离心滤器除去PC，水洗三次。最终产物（CUR-BCSC@PC）避光4℃保存备用。

表征

用贝克曼库尔特Delsa Nano C粒度分析仪进行动态光散射（DLS）测量，观察粒径、Zeta电位和分散指数（PI）。透射电镜（TEM, H-600；日立，东京，日本）确认CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs形态。

包封率（EE）和药物负载量（DL）

采用HPLC（Agilent 1260GB12C）测定纳米粒EE和DL。将2 mL CUR-BCSCs或CUR-BCSC@PCs与3 mL乙腈混合超声破乳，定容至10 mL。测定前调节Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）柱温25℃，流动相流速1.0 mL·min⁻¹，0.5%冰醋酸与乙腈体积比40:60。检测波长425 nm，进样量20 μL[30]。计算公式如下：

EE% = （纳米粒中CUR重量 / 投料CUR重量）× 100%

DL% = （纳米粒中CUR质量 / 纳米粒质量）× 100%

体外稳定性测试

配制含GSH（0, 20 μM, 10 mM）的PBS，37℃处理CUR-BCSC@PCs 4 h，观察不同谷胱甘肽浓度下粒径变化。此外，用Delsa Nano C粒度分析仪在37℃下不同时间点（4, 8, 12, 24 h）测定PBS中CUR-BCSC@PCs流体动力学直径。

体外CUR释放

采用透析法考察CUR-BCSC@PCs体外释放行为。配制含谷胱甘肽（GSH: 20 μmol/L, 1 mmol/L, 5 mmol/L, 10 mmol/L）的PBS并加入0.5% Tween 80。将45 mL不同GSH浓度的PBS缓冲液置于50 mL离心管，放入装有1 mL CUR-BCSC@PCs的透析袋，37℃振荡。不同时间点（0.2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h）取2 mL释放介质，补充同等新鲜介质保持体积不变。用HPLC测定收集液中CUR浓度。

细胞培养

人肺癌A549细胞在含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中培养，37℃、5% CO₂条件下孵育[31, 32]。

体外细胞增殖抑制

采用标准MTT法评价游离CUR、BCSC胶束（BCSCs）、CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs对A549细胞系的细胞毒性[33]。A549细胞接种于96孔板（5000细胞/孔）贴壁24 h。弃去原培养基，加入含游离CUR、BCSCs、CUR-BCSCs、CUR-BCSC@PCs（按CUR计0.1, 1, 5, 10, 15, 20 μg/mL）的新鲜培养基100 μL，培养24 h。未给药孔作空白对照。移除培养基加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37℃、5% CO₂孵育4 h。用150 μL DMSO溶解紫色甲臜，酶标仪（Thermo Fisher Scientific）在570 nm测定吸光度。

体外细胞摄取与定位

在荧光显微镜（FM, Eclipse E400；尼康，东京，日本）下研究CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs细胞摄取能力。A549细胞接种于24孔板（4×10⁴细胞/孔），与CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs（CUR浓度：20 μg/mL）共孵育1, 2, 4 h。去除含药培养基后用PBS洗涤三次，加入4%多聚甲醛PBS固定20 min，再洗三次。Hoechst 33342染色细胞核15 min，倒置荧光显微镜观察。

统计分析

所有实验至少重复三次，数据以均值±SD表示。采用Student's t检验，P < 0.05为显著差异，P < 0.01为极显著差异。

结果与讨论

COS、COS-S-S-CUR、生物素-COS和BCSC表征

COS-S-S-CUR的¹H-NMR谱图出现CUR和CH₂-S-S-CH₂特征共振峰，证明CUR成功连接到COS链上。与图3(A)COS峰相比，图3(B)中CUR特征信号出现在6.7-7.5 ppm区域及3.75 ppm（-OCH₃），CH₂-S-S-CH₂共振峰在2.5 ppm保持不变。图3(C)中生物素-COS的¹H-NMR谱图上生物素峰位于0.99 ppm（-CH₂–）和3.39 ppm（-CH–S–）。图3(D)展示BCSC的¹H-NMR谱图，CUR共振峰（图3(D), a, e）出现在对应位置，CH₂-S-S-CH₂特征峰（图3(D), b）仍在2.5 ppm。此外，0.09 ppm和3.39 ppm处信号峰（图3(D), c, d）出现，证实生物素连接在COS-S-S-CUR链上。图3(D)中CUR、CH₂-S-S-CH₂和生物素特征共振峰与图3(B)和图3(C)一致，表明两亲性材料BCSC合成成功。

CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs表征

透射电镜（TEM）研究CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs形态（图4(A, B)）。CUR-BCSCs呈光滑球形（图4(A), a），CUR-BCSC@PCs呈近球形且周围有绽放层（图4(B), b），表明PC在CUR-BCSCs表面形成蛋白冠结构。观察到明显丁达尔效应（图4(C)），证实存在大量纳米粒。CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs的粒径、PI、Zeta电位、DL（%）、EE（%）见表1。图5显示CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs平均粒径分别为97.8 ± 4.2 nm和160.3 ± 9.0 nm。PI值分别为0.181 ± 0.014和0.114 ± 0.024，均小于0.2，表明粒径分布均一。Zeta电位分别为21.57 ± 0.53和12.90 ± 1.93 mV。因带电PC包覆，CUR-BCSCs Zeta电位高于CUR-BCSC@PCs。CUR-BCSC@PCs EE高于CUR-BCSCs。

CUR-BCSC@PCs稳定性

如图6a所示，因二硫键还原性，在含10 mM GSH的PBS中二硫键断裂，CUR-BCSC@PCs解体为聚合物片段并聚集导致粒径增大。而在含20 μM GSH的PBS中，粒径变化微小，与无GSH的PBS结果相似。图6b测定不同时间点PBS中CUR-BCSC@PCs粒径，结果显示粒径随时间缓慢增加[14]。

CUR-BCSC@PCs还原响应

二硫键在肿瘤还原环境中不稳定，研究者利用二硫键连接亲水聚合物和疏水药物制备两亲性片段，可在水中自组装成纳米胶束，随生理环境与肿瘤环境差异在肿瘤部位断裂释放药物[34]。本研究通过体外释药实验验证CUR-BCSC@PCs是否呈现预期释放性质。研究含二硫键连接的CUR-BCSC@PCs经GSH激活后的还原响应能力。图7显示，模拟细胞外环境的20 μM GSH（pH 7.4）中CUR释放极慢，而10 mM GSH（pH 7.4）环境中释放显著加快。与20 μM GSH相比，1, 5, 10 mM GSH释放行为差异显著。随GSH浓度升高，CUR从CUR-BCSC@PCs释放增强，表明药物释放响应GSH浓度。

体外细胞毒性

MTT法研究游离CUR、BCSCs、CUR-BCSCs、CUR-BCSC@PCs对A549细胞系细胞毒性[35]。细胞活力数据汇总见图8。所有CUR制剂均呈剂量依赖性增殖抑制。图8显示，24 h孵育后游离CUR对A549细胞增殖抑制能力略低于CUR-BCSC@PCs和CUR-BCSCs。对A549细胞，CUR-BCSC@PCs抗癌活性优于BCSCs和CUR-BCSCs，可能归因于优异的细胞摄取。此外，CUR-BCSC@PCs细胞毒性高于CUR-BCSCs，提示PC对A549细胞增殖有潜在抑制作用。

体外细胞摄取研究

图9显示，在倒置荧光显微镜下观察到用CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs（CUR: 20 μg/mL）处理的A549细胞在1, 2, 4 h时的CUR荧光信号。CUR作为绿色荧光探针兼抗癌药，常作为疏水模型药物开发新型高效递送系统。图9a显示，CUR-BCSCs和CUR-BCSC@PCs均被A549细胞摄取，摄取效率随时间增加。因癌细胞表面过表达生物素受体，生物素负载纳米胶束对A549细胞有亲和力。4 h时CUR-BCSC@PCs荧光信号强，表明摄取率高。4 h荧光信号强于1 h和2 h，证明摄取呈时间依赖性。

用Hoechst 33342染色A549细胞核。图9b显示，CUR-BCSC@PCs 1 h组绿色荧光信号见于细胞质，4 h组荧光逐渐出现在细胞核，提示通过小窝介导的内吞作用实现细胞摄取。

结论

本研究通过缩合反应、自组装行为及PC与CUR-BCSCs相互作用制备了一种蛋白质功能化COS纳米粒。初步研究表明，具有氧化还原敏感性的两亲性载体材料（BCSCs）合成成功并经¹H-NMR验证。CUR-BCSCs表面修饰藻蓝蛋白冠层，可提高细胞摄取效率并保护CUR-BCSC@PCs免受血浆蛋白吸附。细胞毒性和摄取分析表明，CUR-BCSC@PCs可将CUR转运入A549细胞并具有优异抗增殖特性。考虑到PC和CUR的PDT效应，下一阶段将评价光疗条件下CUR-BCSC@PCs光动力特性和抗癌活性。本研究为提高抗癌药疗效和引入功能性蛋白冠铺平道路。总之，基于COS的多功能纳米药物载体生物材料CUR-BCSC@PCs为肿瘤治疗提供新策略，展现广阔应用前景。