用于单链 DNA 检测的磁性石墨烯场效应晶体管生物传感器

介绍

DNA的检测对于分子生物学的研究和遗传病的诊断具有重要意义[1,2,3]。迄今为止，已经开发了各种用于 DNA 检测的生物传感器，包括荧光生物传感器 [4, 5]、电化学生物传感器 [6,7,8,9] 和场效应晶体管 (FET) 生物传感器 [10,11,12,13 ]，后者因其高灵敏度和特异性而受到广泛关注。凯斯蒂等人。 [12] 开发了一种 FET 生物传感器，使用肽核酸探针检测未标记的单链 DNA。金等人。 [13] 基于标准互补金属氧化物半导体技术制作了FET型DNA电荷传感器。

由于其高比表面积、高电导率和优异的电子迁移率，石墨烯被认为是制造 FET 生物传感器的理想材料 [14,15,16]。蔡等人。 [15] 开发了一种石墨烯 FET (GFET) 生物传感器，用于通过肽核酸 DNA 杂交对 DNA 进行超灵敏检测。我们课题组还提出了一种多通道GFET生物传感器，用于测定DNA杂交和单碱基错配的结合动力学和亲和力[16]。

在传统的 GFET 中，外部栅电极电场在石墨烯薄膜和溶液电解质之间的界面处产生双导电层 [17,18,19]。基于 GFET 的俘获模型 [16]，栅电极通过电解质对双导电层进行充电和放电，从而调节 GFET 的电导率。因此，GFET的电导率与外电场强度和电解液中的离子浓度有关。

在研究过程中发现，对GFETs灵敏度的研究已经达到了fM级别。例如，平等人。 [20]和郑等人。 [21] 报道了传统 GFET 生物传感器的检测极限在 fM 水平。然而，上述文献通过半导体分析仪检测实现了极高的灵敏度，价格昂贵且不利于实际应用。此外，Ag/AgCl电极通常用作外栅电极，由于其尺寸和可重复使用性，不适合构建集成生物传感器。

在此，开发了一种磁性 GFET (MGFET) 生物传感器，其中利用磁场而不是电场来调节 GFET 电导率。导电通道是使用化学气相沉积 (CVD) 石墨烯薄膜转移到具有两个氧化铟锡 (ITO) 电极的玻璃基板上实现的。石墨烯薄膜用 1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯 (PBASE) 进行功能化，以允许连接探针适体以捕获互补的磁性标记单链 DNA (cDNA) 并与之杂交。在 MGFET 的背面施加周期性磁场，实现了周期性 MGFET 电阻抗。此外，周期性磁场中MGFET的电阻抗波动与cDNA的浓度有关。构建了相应的实验室制造的检测装置来实时检测 MGFET 阻抗。由于磁场不直接与 MGFET 接触，因此本文制备的 MGFET 比传统的 GFET 生物传感器更容易集成和应用。本文详细介绍了MGFETs的制备、实验室自制检测系统的构建以及检测原理。

方法

材料和仪器

带有 ITO 电极的玻璃基板购自华南祥诚有限公司（中国）。探针适体、cDNA 和错配 DNA 购自 Sangon Biotech Inc.（中国上海）。探针适体序列为(5'-NH2-TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3')，互补DNA序列为(5'-NH2-GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA -3')，完全错配的DNA序列为(5'-NH2-TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3')，单碱基错配DNA的序列为(5'-NH2-GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3')。 PBASE 和二甲基亚砜 (DMSO) 购自 Sigma-Aldrich（中国上海）。用羧基（10 mg/mL）修饰的磁性纳米珠（MB）购自咸丰纳米材料科技有限公司（中国南京）。 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、十二烷基苯磺酸钠 (SDS) 和十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲盐水（PBS，P5368-10PAK；pH 7.4）购自 Sigma-Aldrich（上海） , 中国).

拉曼显微系统（SPEX-1403，SPEX）用于表征石墨烯的质量以及验证 MGFET 的功能化。荧光光度计（LS55，PerkinElmer）用于表征磁性纳米颗粒与 cDNA 的偶联。利用实验室自制的数据采集系统实时记录MGFETs的阻抗。

将 cDNA 与 MB 偶联

超声均匀分散 20 min 后，将 20 μL 羧基修饰 MBs 悬浮液与 200 μL 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（2 mg/mL）和 200 μL N-羟基琥珀酰亚胺 (2 mg/mL) 保持 15 分钟以获得活化的 MB [22, 23]。然后，将 20 μL cDNA 溶液加入 MBs 溶液中，并在室温下持续轻轻摇动孵育 2 小时。然后引入磁场以通过 MB 富集 cDNA 样品。磁性纳米珠/DNA（MB/cDNA）偶联物用PBS洗涤3次，分散在PBS中备用。

MGFET 的制造

下面详细描述MGFET的制备。首先，将 CVD 石墨烯薄膜转移到玻璃板上，作为两个 ITO 电极之间的导电通道（图 1a），如前所述 [18, 19]。其次，将溶解在 DMSO 中的 PBASE（10 mM）在室温下注入 MGFET 12 小时，并通过 π-π 堆积与石墨烯完全反应（图 1b）。然后用 DMSO 和 PBS 连续洗涤 MGFET，以去除任何未反应的 PBASE。第三，将 2 μM 的探针适体引入 MGFET，并在室温下与 PBASE 一起孵育 4 h，使探针适体与 PBASE 充分反应（图 1c）。 MGFETs分别用0.2% SDS洗涤3次，去除未结合的探针适体。

MGFET 的功能化和检测原理。 一 通过化学气相沉积生长的石墨烯薄膜。 b PBASE 对石墨烯的功能化。 c 通过 PBASE 固定探针适体。 d 探针适体与 cDNA 的杂交。 e 检测装置照片

结果与讨论

MGFET 的特征

通过 CVD 方法生产的石墨烯薄膜被转移到玻璃基板上作为两个 ITO 电极之间的导电通道（图 1a）。转移的石墨烯薄膜用拉曼光谱表征（图 2）。石墨烯的三个特征峰的出现证明了石墨烯薄膜成功转移到玻璃基板上 [24, 25]。 2D 带和 G 带之间的强度比 (I2D/IG) 表明转移的石墨烯是多层膜 [26]。此外，D带和G带之间的强度比（ID/IG）很小，表明缺陷密度非常低。

拉曼光谱

由于缺乏官能团，适配体链很难在 CVD 石墨烯薄膜上进行修饰。因此，基于其芳香芘基，PBASE 通过 π-π 堆积作为连接体在石墨烯薄膜上进行了修饰。在 PBASE 的另一端，PBASE 的琥珀酰亚胺部分可以基于 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 交联反应与 5'-NH2 标记的探针适体偶联（图 1c）。为了评估探针适体在石墨烯薄膜上的结合，探针适体的 3'-末端使用 FAM 荧光团标记（序列：5'-NH2-TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3 ')。适体引入后，荧光强度立即明显增强，表明其在石墨烯表面成功修饰（图 3）。增加探针适体浓度导致荧光强度增加，达到恒定值，因此表明探针适体在 MGFET 上饱和，约为 2 μM。因此，后续实验均以2 μM的探针适体浓度进行。

探针适体对 MGFET 修饰的表征。误差棒代表5次独立分析的标准偏差

MB/cDNA 的特征

MB 和 MB/cDNA 缀合物的形态通过透射电子显微镜 (TEM) 进行表征（图 4a、b）。 MB 的粒径分布显示平均粒径约为 7 nm（图 4c）。为了确保 cDNA 生物传感的灵敏度和准确性，对于 cDNA 的 MBs 应该过多，以完全捕获 cDNA。激活浓度为 4 mg/mL 的 MB，以确保与本文使用的 cDNA 样品结合。通过 FAM 标记 cDNA，利用荧光强度来表征偶联效率并优化 cDNA 浓度（图 4d）。事实上，在将 MB 引入 cDNA 溶液后，上清液的荧光强度明显降低，表明 cDNA 被 MB 捕获并富集。 MBs对cDNA的成功捕获证实了在cDNA浓度为10 nM时，上清液的荧光强度与PBS相当，表明所有的cDNA都被MBs捕获并富集了（图4d） ).

MB/cDNA偶联的表征。 一 MB 的 TEM。 b MB/cDNA 偶联物的 TEM。 c MB 的粒径分布。 d MB/cDNA (FAM) 偶联的表征。误差棒代表5次独立分析的标准偏差

磁场强度分析

将 MB/cDNA 偶联物加入 MGFET 中 10 分钟，以允许 cDNA 与探针适体完全杂交。由于探针适体不能与没有修饰氨基的 MBs 偶联，因此可以通过用 PBS 清洗 MGFETs 3 次来去除多余的 MBs。因此，MGFET 上只剩下 MB/cDNA 偶联物（图 1d）。永磁体安装在旋转电机上，以向 MGFET 施加周期性磁场（图 1e）。使用实验室自制的检测装置记录MGFETs的阻抗波动。

由于 MGFET 的阻抗由作为背栅的磁场调制，因此研究了磁场强度与 MGFET 阻抗之间的相关性以优化磁场强度参数（图 5）。一般认为，石墨烯和电解质之间形成的双导电层受到外部电场的调节，从而调节了 GFET 的电导率 [19, 27, 28]。在 MGFETs 中，通过 MBs 和磁场之间的磁力，MB/cDNA 偶联物与石墨烯薄膜之间的距离受到机械控制，从而调节 MGFETs 的双导电层 [29, 30]。 MGFET 生物传感器的阻抗随着磁场强度的增加分三个阶段变化，这可以通过将 MB/cDNA 链作为弹性细棒来解释 [31]。在这项工作中，第一阶段发生在磁场强度小于 100 mT 的情况下。基于DNA链的弹性细棒模型，由于磁场力小于DNA链的径向支撑力，磁场力难以引起DNA链弯曲；因此，MGFET 对磁场不敏感。在磁场强度为 100 到 200 mT 的第二阶段，磁场强度足以克服 DNA 弹性细杆的径向支撑力，导致 MB/cDNA 快速弯曲，然后敏感响应MGFET 到磁场。最后，在磁场强度超过 220 mT 的第三阶段，DNA 弹性杆的弯曲达到极限；因此，MGFET 不会响应磁场的变化，导致 MGFET 的阻抗稳定，如图 5b 所示。

磁场强度对 MGFET 阻抗的影响。 一 MGFET 在时域中变化的磁场强度下的阻抗。 b MGFET 的阻抗与磁场强度之间的关系。误差棒代表5次独立分析的标准偏差

检测cDNA

在 240 mT 的固定磁场强度下测量了不同 MB/cDNA 偶联物浓度下 MGFET 阻抗的变化，以确定 cDNA 检测的可行性和灵敏度。

实时记录每个 cDNA 浓度下的 MGFET 阻抗（图 6a）。当永磁体加载到 MGFET 的背面时，阻抗迅速增加。相反，当施加周期性磁场时，会观察到阻抗的周期性变化。基于此阻抗周期性，使用样本积分算法 (SIA) 来提高 MGFET 的信噪比。假设不施加磁场的周期为 T0，施加磁场的周期为 TM（图 6a），SIA 可以用以下步骤描述：（1）在 T0 期间，所有由噪声产生的数据点为归一化为零，(2) 在每个 TM 期间获得的数据点按顺序采样和平均。经过四个周期的 SIA 处理后，获得了 MGFET 中的周期性阻抗变化，如图 6b 所示。理论上，足够长的采样时间可以有效提高MGFET的信噪比。

一 不同 cDNA 浓度下阻抗波动的时域。 b MGFETs的阻抗随cDNA浓度的变化

MGFET 中的阻抗变化与 cDNA 浓度呈正相关（图 6b）。评估了 MGFET 的阻抗变化与 cDNA 浓度之间的相关性（图 7）。 MGFET生物传感器在这项工作中的高灵敏度主要基于以下两个方面：首先，与单独使用DNA的情况相比，MB/cDNA偶联物的机械运动可以增强对双导电层的调节作用，其次，由于可以施加周期性磁场，使MGFET的阻抗产生周期性变化，因此基于采样积分原理，仅对MGFET阻抗与磁场进行采样积分，以降低噪声。因此，通过增加外磁场周期数可以极大地优化系统信噪比。

MGFETs 阻抗与靶 DNA 浓度的关系。误差棒代表5次独立分析的标准偏差

MGFET 的选择性

通过检测两种不同的靶 DNA 序列来评估 MGFET 的特异性，包括完全错配的 DNA 链和单碱基错配的 DNA 链。与上述程序类似，完全错配的 DNA（序列：5'-NH2-TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3'）和单碱基错配的 DNA（序列：5'-NH2-GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3') 分别与 MB 偶联。将溶解在PBS溶液中的错配MB/DNA加入MGFET生物传感器中10 min，与适配体充分反应。 MGFETs 用 PBS 洗涤 3 次以去除错配的 DNA。对于完全错配的 DNA 链，由于 MB/DNA 偶联物不能与适体杂交，几乎所有的 MB/DNA 偶联物都被去除。因此，添加完全错配的 MB/DNA 对石墨烯的电导率几乎没有影响，如图 8 所示，这表明生物传感器的高选择性。此外，我们还通过单碱基错配 DNA 链研究了生物传感器的选择性，如图 7 所示。可以发现，单碱基错配链的 MGFET 阻抗变化略低于互补链，高于每个特定浓度的非互补目标链。因此，在这项工作中可以检测到单碱基错配链。尽管适体和互补DNA链都是主要决定生物传感器选择性的商业产品，但MGFETs及其检测系统也为DNA检测的高灵敏度做出了贡献。

MGFET 的阻抗与完全错配的 DNA 浓度之间的关系。误差棒代表5次独立分析的标准偏差

结论

在此，提出了一种基于石墨烯和磁性纳米颗粒的 MGFET 生物传感器来检测 cDNA。在 MGFET 中，磁性纳米颗粒被修饰到 cDNA 序列的末端。通过MBs和磁场之间的磁力，MB/cDNA偶联物与石墨烯薄膜之间的距离受到机械控制，从而调节MGFETs的双导电层。此外，我们还可以得出结论，对于特定的 DNA 链，MGFET 的阻抗将反映 DNA 链的应力，进而反映 DNA 链的弯曲（插图，图 5b）。因此，目前的 MGFET 有可能用于研究 DNA 链的机械参数。因此，MGFETs不仅可以作为检测cDNA的生物传感器，还可以潜在地检测DNA链的力学参数。

数据和材料的可用性

本研究中生成或分析的所有数据均包含在本文中。

缩写

cDNA：

互补磁性标记单链DNA

CVD：

化学气相沉积

DMSO：

二甲亚砜

FET：

场效应晶体管

GFET：

石墨烯场效应晶体管

MB：

磁性纳米珠

MGFET：

磁性石墨烯场效应晶体管

NHS：

N-羟基琥珀酰亚胺

PBASE：

1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯

PBS：

十二烷基硫酸钠磷酸缓冲盐水

SDS：

十二烷基苯磺酸钠

SIA：

样本积分算法

TEM：

透射电子显微镜

ITO：

氧化铟锡