用于脓毒症检测中白细胞介素-3 的纵向沸石-氧化铁纳米复合沉积电容生物传感器

介绍

脓毒症是一种致命的疾病，当身体对感染产生严重反应时就会发生 [1]。由于败血症发作，身体会产生更高水平的信号生物分子，称为“细胞因子”，可吸引免疫细胞。越来越多的这些细胞会分泌更多的细胞因子，细胞因子风暴会招募更多的免疫细胞。免疫因子不是控制最初的感染，而是攻击身体器官和组织。此外，这种感染会引发全身的连锁反应并导致器官衰竭和组织损伤 [2]。尤其是败血症开始于肺、皮肤、泌尿道和胃肠道，并广泛传播。

其他器官，从而导致器官损伤。因此，有必要尽早停止该过程，以防止对其他器官的攻击。使用合适的生物标志物在早期阶段识别脓毒症有助于为患者提供及时的治疗并挽救生命。研究人员发现，白细胞介素 3 (IL-3) 炎症因子是先天反应激活剂 (IRA) B 细胞在 Toll 样受体激活后产生的败血症发作和死亡的独立预测因子。此外，发现较高水平的 IL-3 与脓毒症患者的死亡率较高有关，并证实 IL-3 在免疫调节和脓毒症期间对皮质类固醇的更高反应中起主要作用。本研究旨在使用沸石-氧化铁（沸石-铁）纳米复合材料修饰的电容电化学传感器来量化IL-3的水平。

用生物传感器检测生物分子高度依赖于目标或检测分子在换能器电极表面上的固定[3]。具有适当方向的固定捕获探针数量越多，目标检测限越低 [4]。在大多数情况下，捕获探针的固定是通过物理吸附、静电相互作用、共价连接和生物分子与聚合物的结合进行的 [5, 6]。通过上述固定化方法可能难以实现固定化生物分子的重现性和生物相容性。特别是，较小的捕获分子（如 RNA、DNA、适体和肽）与传感表面的连接非常复杂 [7, 8]。不同的研究人员使用了不同的技术来有效固定。最近，纳米材料在传感表面的生物分子固定过程中具有很高的吸引力 [9,10,11]。金纳米粒子已被有效地固定在各种传感表面，如聚苯乙烯 ELISA 基板和铝电极，并已捕获潜在分子，包括抗体、蛋白质、DNA 和适体。除了二氧化硅之外，铝和石墨烯也是常用的生物分子固定材料。这些纳米材料增加了捕获分子的数量，并提高了传感表面上生物分子的生物相容性和稳定性，这有助于改进检测策略。近年来，沸石、粘土和溶胶-凝胶等无机材料为解决这些问题引起了研究人员的关注。此外，由于相关的巨大优势，例如不涉及危险材料且价格较低，通过更环保的方法合成纳米材料受到高度鼓励[12,13,14,15]。此外，可以使用量身定制的方法来实现所需的纳米材料尺寸和形状。目前的研究与该方法一致，制备了沸石纳米材料与分离的铁结合形成纳米复合材料。

沸石是由 TO4 四面体和 O 原子组成的结晶微孔铝硅酸盐 [16]。由于其较大的表面积、离子交换能力、可控的疏水性/亲水性以及高机械和导热性，它是一种很有前途的生物分子固定材料。因此，生物传感器领域的各种研究已经建立，使用沸石材料进行生物分子固定过程并达到较低的检测限，以开发葡萄糖传感器和尿素传感器等生物传感器[17,18,19]。同样，铁纳米材料改善了阳离子交换性能的效果，并在与生物分子相互作用时对电流变化做出快速响应。本研究中使用的具有独特成分的沸石-氧化铁纳米复合材料增强了传感器的高性能，由于电导率的提高，进一步提高了灵敏度。本研究的重点是从煤矿粉煤灰中提取的沸石-铁纳米材料，并将其用作电容电极的基材，以固定捕获探针，即抗 IL-3 抗体。与以前纳米材料介导的不同白介素检测 [20,21,22] 相比，当前的传感系统在几个方面提供了改进。例如，它对电化学传感器的更高适用性需要更少的实验步骤，并且它表现出对表面化学功能化的适用性和高防污能力。

电容式生物传感器是一种电化学传感器，通过记录在电极表面上相互作用的探针和目标之间的吸引力而创建。当目标生物分子与传感表面上的固定探针结合时，电容式生物传感器有助于测量电极界面处介电层的变化 [23]。电极和电解质之间的电容由C描述 =(2nε 0εA )/d , 其中 ε ：介电常数，A ：板的表面积，ε 0：自由空间的介电常数，n ：重复手指的数量，以及 d ：绝缘层厚度 [24, 25]。非法拉第电容生物传感器有助于避免由金属化引起的蛋白质变性，并改善目标和探针结合的相互作用 [26, 27]。各种研究利用电容生物传感器来识别各种目标分子，包括核苷酸、重金属、蛋白质和有机分子 [23, 28,29,30,31]。在这项研究中，非法拉第电容生物传感器实验是在沸石-铁修饰的电极表面上进行的。沸石-铁通过（3-氨基丙基）-三甲氧基硅烷作为胺连接体附着在电容电极上，然后通过胺表面与电极的羧基（COOH）基团之间的吸引力将抗IL-3附着在电容电极上。抗体。抗IL-3抗体修饰电极用于定量IL-3和诊断脓毒症。

材料和方法

仪器和试剂

粉煤灰来自印度的一家热电厂。氢氧化钠和硫酸购自 Sigma Aldrich（美国密苏里州）。 (3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷 (APTMS) 购自 Merck (NJ, USA)。 Whatman 滤纸购自 Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, USA)。 IL-3 和抗 IL-3 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology (Texas, USA)。使用场发射扫描电子显微镜（FESEM；Hitachi，S-4300 SE，日本）和场发射透射电子显微镜（FETEM；JEM-2100F，JEOL，日本）通过先前概述的方法分析沸石-铁纳米材料。 32]。

沸石-铁纳米材料的合成

使用从粉煤灰中提取的铁、二氧化硅和氧化铝合成沸石-铁纳米材料。该过程涉及以下三个主要步骤：（1）铁颗粒的分离； (2)铝硅酸钠的萃取； (3)溶胶-凝胶合成法制备沸石-铁纳米粒子。

从粉煤灰中分离铁

将 25 克粉煤灰与 500 微升蒸馏水混合，并使用磁力搅拌器搅拌 30 分钟。将粘在磁力搅拌器上的铁颗粒分离，然后将 1g 分离出的颗粒与 25% 的硫酸混合并在 50°C 下搅拌 1 小时。然后用Whatman滤纸将含铁溶液和铁颗粒分离，作为氧化铁的基础合成沸石-铁纳米材料。

从粉煤灰中提取铝硅酸钠

碱提法是用碱提法从粉煤灰中提取铝硅酸钠[33]。首先，将 25 g 铁分离粉煤灰与 500 µL 2 M 氢氧化钠混合，并在 100 °C 下加热搅拌 6 小时。冷却溶液后，用Whatman滤纸分离铝硅酸钠（混合物中的溶液）。以过滤后的溶液为基础合成沸石。

通过溶胶-凝胶法合成的沸石-铁纳米材料

以提取的铁和铝硅酸钠为基础，通过溶胶-凝胶法合成沸石-铁纳米材料。在第一步中，在搅拌下将含有 200 mL pH 12 的铝硅酸钠的烧杯放置在加热板上。然后，在pH 1下用铁溶液滴定溶液，通过滴加铁溶液直至达到pH 7。在pH 7时，形成白色凝胶，将该凝胶连续搅拌过夜以获得均匀分布的沸石-铁纳米颗粒.第二天，凝胶通过离心分离（10,000×g 10 分钟），然后用 25% 乙醇和蒸馏水洗涤。最终产品在 100°C 下干燥 1 小时以获得由沸石-铁纳米材料组成的粉末。沸石-铁纳米材料的表面通过FETEM和FESEM表征。还进行了能量色散X射线(EDX)分析以鉴定沸石-铁中的元素。

沸石-铁的胺改性和电容电极表面的功能化

通过硅烷偶联剂APTMS将胺包覆在沸石-铁的表面上。为此，将 1 g 沸石-铁与 1% KOH 混合 10 分钟，然后用蒸馏水除去过量的 KOH。然后，将 KOH 处理的沸石-铁与 1% APTMS 混合，并将混合物置于加热搅拌器上过夜。第二天，纳米材料用乙醇洗涤并通过离心分离（10,000×g 10 分钟）。将该 APTMS-沸石-铁附着在电容电极表面以识别 IL-3。对于这种固定，将 APTMS-沸石-铁滴在羟基化电极上并在室温下保持 3 小时。沸石-氧化铁纳米复合材料、APTMS 和传感表面之间的键合是由于硅烷与生成的氧化物基团的偶联。一般而言，硅烷偶联发生时有多个可用于氧化物基团的臂，从而在沸石-氧化铁纳米复合材料、APTMS 和传感表面之间产生连接。由于这些多重联系，在感应面上形成了空间排列。用乙醇和水洗涤表面后，进行抗IL-3抗体固定过程以与IL-3相互作用。

抗IL-3修饰电容电极表面IL-3的测定

上述表面是通过胺系链形成的，当抗体连接时，它允许与可用的 COOH 基团反应。 IL-3 在抗 IL-3 固定的电容电极表面上被鉴定。为此，将 100 pg/mL 的 IL-3 在 PBS 缓冲液中稀释并滴在抗体修饰的电极表面上。抗体固定后，剩余的未结合表面被 PEG-COOH (1 mg/ml) 封闭。当连接 PEG-COOH 时，会发生与抗体-APTMS 类似的反应。在与 IL-3 相互作用之前和之后记录电容值。考虑了IL-3与其抗体结合的价值差异。此外，为了计算检测限，将 IL-3 从 3 滴定到 50 pg/mL 并独立滴到抗体修饰的表面上。如前所述进行其他实验程序。计算各IL-3浓度的电容值差异并作图计算R ² 对IL-3的检测 价值。当IL-3附着在抗体固定化表面时，就会发生真正的相互作用。

生物污垢和 IL-3 在沸石-铁改性电容电极表面的选择性测定

生物污染实验在三种不同的生物分子条件下进行，包括存在非免疫抗体或对照蛋白以及不存在 IL-3 抗体。在第一种情况下，使用非免疫抗体代替 IL-3 抗体；在第二个实验中，使用对照蛋白代替 IL-3；最后一个实验是在没有 IL-3 抗体的情况下进行的。比较了 IL-3 抗体与 IL-3 的特异性相互作用的电容值。通过在 1:100 稀释的人血清中加入 IL-3 并将其滴加到抗 IL-3 修饰的电极表面来进行选择性实验。记录每个IL-3浓度的电容变化以鉴定IL-3的选择性鉴定。通过使用相同批次制造的类似设备重复实验三次（一式三份）来确认可重复性。还测定了探针固定表面的寿命和稳定性。

结果与讨论

败血症是免疫系统中释放大量化学物质的病症，会引发广泛的炎症，最终损害器官。图 1a 显示了在抗 IL-3 修饰的电容电极表面上识别 IL-3 的示意图，用于确定与败血症相关的状况。 APTMS 修饰的沸石-铁用于将捕获抗体连接到传感电极表面。通过纳米材料上的胺与电极表面的OH基团之间的相互作用，沸石-铁表面的APTMS被固定在电极表面。图 1b 确认了电容传感器表面电极的完整性，如在高倍显微镜下捕获的。抗体通过 COOH 和沸石-铁的胺连接到表面。沸石-铁有助于在感应电极上附着更多的 APTMS，这有助于在电容电极表面捕获更多抗体。各种研究表明，捕获探针固定在传感表面对降低目标分子的检测限起着至关重要的作用。在这项研究中，沸石-铁纳米材料用于将抗 IL-3 抗体连接到传感电极表面。抗IL-3抗体在适当方向上的更高固定化有助于达到IL-3的检测下限。

一 在抗 IL-3 修饰的电容传感表面上识别 IL-3 的示意图。 APTMS 修饰的沸石-铁用于连接捕获抗体，然后与 IL-3 相互作用。 PEG-COOH用作封闭剂。 b 通过高倍显微镜对电容传感表面进行形态分析。 c 沸石-铁的 FESEM 形貌分析。纳米材料以均匀分布和纵向尺寸形成。 d EDX 分析。发现了主要元素 Si、Al、Fe 和 O 的存在。插图由FESEM低倍率获得

FESEM 和 FETEM 对沸石-铁纳米材料的形态分析

图 1c、d（插图）显示了从 FESEM 获得的沸石-铁纳米材料在不同放大倍数和 EDX 元素分析下的形态图像。得到的沸石-铁纳米材料光滑且分布均匀，具有致密堆叠的纵向纳米结构。该纳米结构的尺寸为 ~ 30 nm，所得图像显示纳米复合材料排列整齐，间距适当。 FETEM 图像也证明了与 FESEM 为形成的沸​​石-铁纳米复合材料获得的形状相似的形状（图 2a、b）。 EDX 结果证实合成的沸石-铁纳米复合材料中存在 Fe、Al、Si 和 O（图 2c、d）。发现 Si、Al、Fe 和 O 的主要元素原子百分比分别为 3.46、0.78、2.13 和 24.39%。该FESEM和EDX结果证实了沸石-铁纳米材料的形成。

沸石-铁在 a 处的 FETEM 图像 50 纳米尺度和 b 200 纳米尺度。形成具有均匀分布的纳米材料。 c EDX 分析证实了主要元素 Si、Al、Fe、C 和 O 的存在

IL-3 测定的传感电极制备

通过在每次生物分子固定后改变电容水平来确认电容生物传感器上的抗 IL-3 抗体固定。图 3a 显示了在抗体附着到沸石-铁改性表面的过程中的电容变化。如图 3a 所示，KOH 系留电容电极表面的电容值为 1.74 × 10 ⁰⁹ nF，滴加APTMS-沸石-铁后，增加到2.02 × 10 ⁰⁹ nF。电容的这种增加证实了纳米材料与传感电极的连接。此外，加入抗IL-3抗体后，电容值急剧增加至3.42 × 10 ⁰⁹ nF。由于在 APTMS 改性的沸石-铁上的抗体固定量更高，因此注意到这种更高的增量。此外，纳米材料显示出适当的排列，在感应电极表面上有更多的 APTMS，最终吸引了更多的抗体。最后，加入PEG-COOH进行封闭，发现电容增加到3.64 × 10 ⁰⁹ nF。传感器根据表面电荷的变化以及最终电容的变化工作。表面电荷的变化随分子的附着/相互作用而变化。每个分子携带不同的电荷并影响传感器的电容。因此，在测量中考虑了电容的差异。由于感应电极表面上 IL-3 抗体的占用率更高，因此注意到电容的更高变化（图 3b）。 PEG-COOH 有助于减少 IL-3 在传感电极表面的非特异性结合，并消除假阳性结果。各种研究已经证明，传感表面上的基于 PEG 的聚合物提高了生物相容性，降低了信噪比，并为传感表面上的固定生物分子提供了适当的取向，从而降低了传感器的检测限 [34,35, 36,37]。由于 APTMS 表面静电吸引其他生物分子，因此使用 PEG-COOH 覆盖沸石-铁纳米材料上多余的 APTMS 表面，这有助于减少生物污垢。该抗IL-3修饰表面用于鉴定IL-3。

一 抗体附着到沸石铁改性表面的过程。每个分子固定后电容值增加。 b 电容的差异。抗 IL-3 抗体固定显示电容值变化较大。使用三个读数对这些值进行平均，一式三份。 [沸石-IO-沸石-氧化铁]

抗IL-3抗体表面IL-3的测定和定量

在抗 IL-3 修饰的电容电极感应表面上对 IL-3 进行量化。最初，在抗体修饰的表面上测试了更高浓度的 IL-3 (100 pg/mL)，电容值从 3.74 × 10 ¹⁰ nF 至 13 × 10 ¹⁰ nF。这种增加证实了 IL-3 与抗 IL-3 抗体的相互作用（图 4a）。用 3 至 50 pg/mL 的 IL-3 浓度进行了类似的实验。如图 4b 所示，电容值增加到 4.56 × 10 ¹⁰ nF，5.84 × 10 ¹⁰ nF，6.64 × 10 ¹⁰ nF，8.39 × 10 ¹⁰ nF 和 12 × 10 ¹⁰ nF。注意到随着 Il-3 浓度的增加，电容值逐渐增加（图 5a）。计算电容值的差异并将其绘制在 Excel 表格中，IL-3 的检测计算为 3 pg/mL，R2 值为 0.9673（图 5b）。当与抗 IL-3 相互作用时，发现对不同浓度 IL-3 (3–100 pg/mL) 的线性剂量依赖性反应。然而，当进一步滴定时，样品已饱和。

抗 IL-3 修饰表面上 IL-3 的测定。 一 鉴定 100 pg/mL 的 IL-3。在逐滴添加 IL-3 后注意到电容的明显变化。插图插图显示原理图。 b 将不同 IL-3 浓度滴定到抗 IL-3 抗体上。对于所有浓度的 IL-3，均注意到电容变化

一 每个 IL-3 浓度的电容值。增加 IL-3 浓度导致电容值逐渐增加。 b 每个 IL-3 浓度的电容值差异。这些值绘制在 Excel 表格中，IL-3 的检测限计算为 3 pg/mL。使用三个读数对这些值进行平均，一式三份

APTES-沸石-铁改性电容电极上的生物污垢/非污垢

生物污染是任何类型生物传感器中最大的问题，这会导致对传感表面上目标的误报识别。 BSA、乙醇胺和基于 PEG 的聚合物等封闭剂是减少传感表面生物污垢的常见分子。在本文中，使用 PEG-COOH 作为封闭剂，在三个不同的对照实验中证实了生物污染效应，即没有 IL-3 抗体、有非免疫抗体和有对照蛋白 (IL-8)。如图 6a 所示，三个对照实验均未能提高电容值，表明 IL-3 的特异性识别，没有任何生物污染。

一 IL-3的特异性检测。对照分子没有表现出电容值的增加，表明对IL-3的特异性检测。 b 人血清中 IL-3 的加标。随着 IL-3 浓度的增加，人血清中的加标增加了电容。该结果证实了 IL-3 的选择性检测。使用三个读数对这些值进行平均，一式三份

人血清中 IL-3 的峰值和稳定性

将不同浓度的 IL-3 添加到人血清中，并进行相同的实验程序以在现实生活中识别 IL-3。如图 6b 所示，人血清中掺入的 IL-3 显然会随着 IL-3 浓度的增加而产生增加的电容值。该结果证实了抗IL-3修饰的电容电极对IL-3的选择性识别。

考虑到可重复性，传感表面表现良好，误差值最小。通过在干燥器中适当储存，制造的传感表面附着纳米材料的使用寿命可以延长三个月。然而，在连接探头后，表面稳定了 2 周，并趋于失去 19% 的稳定性，并且从第 3 周开始，稳定性的损失变得陡峭。为了证明该电流传感器的高性能，与现有传感器进行了对比研究，结果表明其具有可比性，并且在多种情况下表现更好（表1）。

结论

败血症会危及生命，涉及强烈的免疫反应，极其危险，会影响全身。该研究证明了在电容电极上鉴定了败血症生物标志物 (IL-3)。从煤粉改性的电容电极中提取沸石-铁纳米材料，以增加生物分子与传感电极结合后的电流。进行胺修饰以将抗IL-3抗体连接到沸石-铁上。 IL-3 检测是在抗体修饰的电极上进行的，达到了 IL-3 的检测限为 3 pg/mL。进一步的对照实验未能显示电容值的增加，证实了 IL-3 的特异性检测，并且在人血清中加入 IL-3 的选择性实验显示电容值明显增加。该实验方法可量化 IL-3 水平并有助于诊断败血症发作。

数据和材料的可用性

所有的数据都是完全可用的，没有限制。

缩写

IL-3：

白细胞介素-3

pg:

象形图

mL：

毫升

µL：

微升

M:

摩尔

FESEM：

场发射透射电子显微镜

FETEM：

场发射扫描电子显微镜

EDX：

能量色散X射线

爱尔兰共和军：

先天反应激活剂

COOH：

羧基

DNA：

脱氧核糖核酸

RNA：

核糖核酸

ELISA：

酶联免疫吸附试验

APTMS：

(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷

KOH：

氢氧化钾

PEG：

聚乙二醇