先进沸石-氧化铁纳米复合电容生物传感器：快速检测 IL-3 诊断脓毒症

摘要

脓毒症是机体对严重微生物感染的极端反应，引发致命且危及生命的问题。脓毒症发生时，免疫系统释放化学物质进入血液对抗感染，导致炎症并引发医疗急症。本研究从煤矿飞灰中提取纵向沸石和氧化铁纳米复合物，用于改善电容生物传感器表面特性以识别脓毒症发作。抗白细胞介素-3（抗 IL-3）抗体通过胺连接子固定在沸石-氧化铁复合电容电极表面，与脓毒症生物标志物 IL-3 相互作用。通过场发射扫描电镜（FESEM）、场发射透射电镜（FETEM）和能谱（EDX）表征纳米复合物的形貌和化学成分。约 30 nm 的纵向沸石-氧化铁纳米复合物使 IL-3 检测限达 3 pg/mL（线性范围，回归系数 R²=0.9673，y=1.638x−1.1847）。在剂量依赖范围（3–100 pg/mL）内实现更低检测限，归因于纳米材料带来的更高抗体固定量和表面电流改善。对照实验显示相关生物分子不引起电容变化，人血清中加标 IL-3 电容增加，表明对 IL-3 的特异性和选择性检测。该研究通过潜在有用方法识别和量化 IL-3，有助于诊断脓毒症发作。

引言

脓毒症是机体对感染产生严重反应时发生的致命状况。脓毒症发作时，机体产生更高水平的信号生物分子“细胞因子”，吸引免疫细胞。这些细胞增多并分泌更多细胞因子，细胞因子风暴招募更多免疫细胞。免疫因子不再控制初始感染，转而攻击机体器官和组织。此外，感染在全身引发连锁反应导致器官衰竭和组织损伤。脓毒症特别起始于肺、皮肤、泌尿道和胃肠道，扩散至其他器官导致器官损伤。因此，需尽早阻断这一过程以防止攻击其他器官。利用合适生物标志物在早期识别脓毒症，有助于及时治疗挽救生命。研究发现白细胞介素-3（IL-3）炎症因子是脓毒症发作和死亡的独立预测指标，由先天反应激活（IRA）B 细胞在 Toll 样受体激活后产生。更高 IL-3 水平与脓毒症患者更高死亡率相关，确认 IL-3 在免疫调节和脓毒症期间皮质类固醇高反应中起主要作用。本研究旨在利用沸石-氧化铁（沸石-铁）纳米复合物改性电容电化学传感器量化 IL-3 水平。

生物分子检测高度依赖靶标或检测分子在换能器电极表面的固定化。更多固定化捕获探针且取向适当可降低靶标检测限。常见固定化方式包括物理吸附、静电相互作用、共价连接、聚合物包埋生物分子。上述方法难以实现固定化生物分子的重现性和生物相容性。特别是将 RNA、DNA、适配体、肽等小分子捕获分子固定在传感表面较为复杂。各类研究者采用不同技术实现高效固定化。近年纳米材料在生物分子固定化过程中极具吸引力。金纳米颗粒高效固定在聚苯乙烯 ELISA 底物和铝电极等传感表面，捕获抗体、蛋白、DNA、适配体等潜在分子。除二氧化硅、铝和石墨烯外，常用于生物分子固定化。这些纳米材料提高捕获分子数量，赋予生物相容性和稳定性，改善检测策略。近期无机材料如沸石、粘土、溶胶-凝胶引起研究者关注以解决上述问题。此外，绿色合成纳米材料因不涉及有害物质、成本较低等优势备受鼓励。定制化方法可实现纳米材料所需尺寸和形貌。本研究顺应此思路，制备沸石纳米材料结合分离铁制成纳米复合物。

沸石是由 TO₄ 四面体和 O 原子组成的晶体微孔铝硅酸盐。因其较大比表面积、离子交换能力、可控疏水/亲水性、高机械和热导率，是生物分子固定化的有前景材料。多项生物传感器研究利用沸石材料固定化生物分子，达到更低检测限，开发葡萄糖传感器、尿素传感器等。同样，铁纳米材料改善阳离子交换性能，对生物分子相互作用产生的电流变化响应快速。本研究使用的沸石-氧化铁纳米复合物因其独特组成增强传感器高性能，进一步因导电性改善提供更高灵敏度。本研究聚焦从煤矿飞灰提取沸石-铁纳米材料，作为电容电极基底固定化捕获探针抗 IL-3 抗体。与前人利用纳米材料检测不同白细胞介素 [20-22] 相比，当前传感系统在多方面改进：更适合电化学传感器（实验步骤更少）、适合表面化学官能化、高抗污染能力。

电容生物传感器是通过记录探针与靶标在电极表面相互作用的吸引力而创建的电化学传感器。当靶标生物分子与传感表面固定化探针结合时，电容生物传感器帮助测量电极界面介电层的变化。电极与电解质间电容由 C=(2nε₀εA)/d 描述，其中 ε：介电常数，A：极板表面积，ε₀：真空介电常数，n：重复指状电极数，d：绝缘层厚度。非法拉第电容生物传感器避免金属化导致的蛋白质变性，改善靶标-探针结合相互作用。多项研究利用电容生物传感器识别核苷酸、重金属、蛋白质、有机分子等靶标分子。本研究在沸石-铁改性电极表面进行非法拉第电容生物传感器实验。沸石-铁通过（3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（APTMS）作为胺连接子连接电容电极，抗 IL-3 通过胺表面与抗体羧基（COOH）吸引力连接表面。抗 IL-3 抗体改性电极用于量化 IL-3 诊断脓毒症。

材料与方法

仪器与试剂

飞灰来自印度热电厂。氢氧化钠和硫酸购自 Sigma Aldrich（美国密苏里）。（3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（APTMS）购自 Merck（美国新泽西）。Whatman 滤纸购自 Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞）。IL-3 和抗 IL-3 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯）。场发射扫描电镜（FESEM；Hitachi S-4300 SE，日本）和场发射透射电镜（FETEM；JEM-2100F，JEOL，日本）按先前方法 [32] 分析沸石-铁纳米材料。

沸石-铁纳米材料合成

从飞灰提取铁、硅、铝合成沸石-铁纳米材料，分三步：(1) 分离铁颗粒；(2) 提取偏铝酸钠；(3) 溶胶-凝胶法制备沸石-铁纳米颗粒。

从飞灰分离铁

25 g 飞灰加 500 μL 蒸馏水，磁力搅拌 30 min。吸附在磁力搅拌子上的铁颗粒分离，取 1 g 混入 25% 硫酸，50 °C 搅拌 1 h。Whatman 滤纸分离含铁溶液和铁颗粒，作为合成沸石-铁纳米材料的氧化铁基底。

从飞灰提取偏铝酸钠

碱提取法提取偏铝酸钠 [33]。25 g 除铁飞灰加 500 μL 2 M NaOH，100 °C 搅拌加热 6 h。冷却后 Whatman 滤纸分离偏铝酸钠（混合液中的溶液），作为合成沸石的基底。

溶胶-凝胶法合成沸石-铁纳米材料

提取的铁和偏铝酸钠为基底，溶胶-凝胶法合成沸石-铁纳米材料。第一步：盛 200 mL pH 12 偏铝酸钠的烧杯置磁力加热搅拌器上。滴加 pH 1 铁溶液滴定至 pH 7。pH 7 形成白色凝胶，过夜持续搅拌获均匀分布沸石-铁纳米颗粒。次日离心（10,000×g，10 min）分离凝胶，25% 乙醇和蒸馏水洗涤。100 °C 干燥 1 h 得沸石-铁纳米材料粉末。FETEM 和 FESEM 表征表面形貌，EDX 分析元素组成。

沸石-铁胺修饰及电容电极表面官能化

硅烷偶联剂 APTMS 在沸石-铁表面包覆胺。1 g 沸石-铁混 1% KOH 10 min，蒸馏水除去多余 KOH。KOH 处理后的沸石-铁混 1% APTMS，加热搅拌过夜。次日乙醇洗涤，离心（10,000×g，10 min）分离。APTMS-沸石-铁滴加于羟基化电极，室温放置 3 h。沸石-铁氧化物纳米复合物、APTMS 和传感表面间通过生成的氧化基团发生硅烷偶联。硅烷偶联有多臂可用氧化基团，形成纳米复合物、APTMS 和传感表面间的多重连接，在传感表面形成空间排列。乙醇和水洗涤表面后，进行抗 IL-3 抗体固定化以与 IL-3 相互作用。

抗 IL-3 改性电容电极表面测定 IL-3

上述表面由胺系绳形成，允许抗体连接时与可用 COOH 基团反应。在抗 IL-3 固定化电容电极表面测定 IL-3。100 pg/mL IL-3 用 PBS 稀释滴加于抗体改性电极表面。抗体固定化后，PEG-COOH（1 mg/ml）封闭剩余未结合表面。PEG-COOH 连接反应类似抗体-APTMS。记录 IL-3 相互作用前后电容值，差值视为 IL-3 与抗体结合。为计算检测限，IL-3 从 3 至 50 pg/mL 滴定，独立滴加于抗体改性表面。按前述流程实验。计算各 IL-3 浓度电容差值并绘图，用 R² 计算 IL-3 检测。IL-3 与固定化抗体表面结合时发生真实相互作用。

沸石-铁改性电容电极表面生物污染与 IL-3 选择性测定

生物污染实验在三种生物分子条件下进行：存在非免疫抗体或对照蛋白、无 IL-3 抗体。情况一：用非免疫抗体替代 IL-3 抗体；情况二：用对照蛋白替代 IL-3；情况三：无 IL-3 抗体。比较电容值确认 IL-3 抗体与 IL-3 特异性相互作用。选择性实验：IL-3 在 1:100 稀释人血清中加标，滴加于抗 IL-3 改性电极表面。记录各 IL-3 浓度电容变化识别 IL-3 选择性鉴定。用同批制造的相似器件重复三次（三重复）确认重现性。也测定了探针固定化表面的储存寿命和稳定性。

结果与讨论

脓毒症是免疫系统释放大量化学物质、引发广泛炎症最终损伤器官的状况。图 1a 示意抗 IL-3 改性电容电极表面识别 IL-3 确定脓毒症相关状况。APTMS 改性沸石-铁用于连接捕获抗体至传感电极表面。APTMS 表面胺与电极表面 OH 基团相互作用将沸石-铁固定电极。抗体通过 COOH 与沸石-铁胺连接表面。沸石-铁帮助在传感电极固定更多 APTMS，从而在电容电极表面捕获更多抗体。多项研究表明捕获探针在传感表面固定化对降低靶标分子检测限至关重要。本研究利用沸石-铁纳米材料固定抗 IL-3 抗体至传感电极表面。更高量、适当取向的抗 IL-3 抗体固定化有助于达到更低 IL-3 检测限。

图 1b 高倍显微镜下确认电容传感器电极表面完好。图 1c FESEM 显示沸石-铁纳米材料形貌：纳米材料光滑、均匀分布，呈密集堆叠纵向纳米结构，尺寸 ~30 nm，纳米复合物排列均匀、间距适当。图 1d EDX 分析确认主要元素 Si、Al、Fe、O 存在。FETEM 图像（图 2a、b）也证明沸石-铁纳米复合物形成均匀分布、形状相似。EDX 确认合成纳米复合物含 Fe、Al、Si、C、O（图 2c、d）。Si、Al、Fe、O 原子百分比分别为 3.46%、0.78%、2.13%、24.39%。FESEM 和 EDX 确认沸石-铁纳米材料形成。

IL-3 测定传感电极制备

通过各生物分子固定化后电容变化确认抗 IL-3 抗体在电容生物传感器上的固定化。图 3a 显示抗体连接至沸石-铁改性表面过程中的电容变化。KOH 系绳电容电极表面电容 1.74×10⁰⁹ nF，滴加 APTMS-沸石-铁后增至 2.02×10⁰⁹ nF，确认纳米材料连接传感电极。加抗 IL-3 抗体后电容大幅增至 3.42×10⁰⁹ nF，因 APTMS 改性沸石-铁固定了更多抗体。纳米材料在传感电极表面适当排列、更多 APTMS 最终吸引更多抗体。最后加 PEG-COOH 封闭，电容增至 3.64×10⁰⁹ nF。传感器基于表面电荷变化进而电容变化工作。表面电荷随分子连接/相互作用变化，每种分子携带不同电荷影响传感器电容。故以电容差值测量。抗 IL-3 抗体在传感电极表面高占有率导致电容变化更大（图 3b）。PEG-COOH 减少 IL-3 在传感电极表面非特异性结合，消除假阳性。多项研究证明 PEG 基聚合物改善生物相容性、降低信噪比、提供固定化生物分子适当取向，降低传感器检测限 [34-37]。因 APTMS 表面静电吸引其他生物分子，用 PEG-COOH 覆盖沸石-铁纳米材料多余 APTMS 表面减少生物污染。此抗 IL-3 改性表面用于识别 IL-3。

抗 IL-3 抗体表面 IL-3 测定与定量

在抗 IL-3 改性电容电极传感表面定量 IL-3。初测 100 pg/mL IL-3，电容从 3.74×10¹⁰ nF 增至 13×10¹⁰ nF，确认 IL-3 与抗 IL-3 抗体相互作用（图 4a）。同法测 3–50 pg/mL IL-3（图 4b），电容分别增至 4.56、5.84、6.64、8.39、12×10¹⁰ nF。IL-3 浓度增加电容逐渐升高（图 5a）。电容差值计算绘图，IL-3 检测限 3 pg/mL，R²=0.9673（图 5b）。IL-3 与抗 IL-3 相互作用呈线性剂量依赖响应（3–100 pg/mL），更高浓度饱和。

APTES-沸石-铁改性电容电极生物污染/抗污染

生物污染是生物传感器最大问题，导致靶标假阳性识别。BSA、乙醇胺、PEG 基聚合物等封闭剂常用于减少传感表面生物污染。本研究用 PEG-COOH 封闭，三对照实验确认生物污染效应：无 IL-3 抗体、非免疫抗体、对照蛋白（IL-8）。图 6a 显示三对照均未增强电容值，表明 IL-3 特异性识别无生物污染。

人血清中 IL-3 加标实验与稳定性

不同浓度 IL-3 在人血清中加标，同实验流程鉴定真实场景 IL-3。图 6b 显示加标 IL-3 血清随浓度增加电容明显升高，确认抗 IL-3 改性电容电极选择性识别 IL-3。

重现性方面，传感表面表现良好，误差极小。制造传感表面连接纳米材料在干燥器妥善保存可稳定三个月。但固定化探针后表面稳定 2 周，损失 19% 稳定性，第 3 周起稳定性下降陡峭。为证明当前传感器高性能，与现有传感器对比（表 1），结果显示可比且多方面表现更优。

结论

脓毒症危及生命，涉及压倒性免疫反应，极度危险且影响全身。本研究在电容电极上演示脓毒症生物标志物（IL-3）识别。从煤飞灰提取沸石-铁纳米材料改性电容电极，增加生物分子结合传感电极时的电流流动。胺修饰连接抗 IL-3 抗体至沸石-铁。抗体改性电极上 IL-3 检测达 3 pg/mL 检测限。对照实验未显示电容增加，确认 IL-3 特异性检测；人血清加标 IL-3 选择性实验显示电容明显增加。该实验方法量化 IL-3 水平，有助于诊断脓毒症发作。