PEG包覆钴铁氧体纳米粒与纳米球比较毒性研究

摘要

本文展示聚乙二醇（PEG）包覆钴铁氧体纳米粒与纳米球毒性比较研究。纳米粒采用水热法制备，纳米球采用溶剂热法制备。纳米材料表面成功经PEG修饰。为研究制备样品形态，采用X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外（FTIR）光谱、拉曼光谱、热重分析（TGA）和电镜技术。结构分析确认形成多晶钴铁氧体纳米粒（直径20-25 nm）和纳米球（直径80-100 nm）。采用昆明SPF小鼠（雌性，6-8周龄）研究钴铁氧体纳米粒和纳米球在小鼠不同器官诱导毒性。通过生物分布研究、生化指标、组织病理学评估、炎症因子、氧化抗氧化水平、细胞毒性测试评估毒性。结果显示钴铁氧体纳米球毒性大于纳米粒，姜黄素被证明是PEG包覆钴铁氧体纳米材料在小鼠诱导毒性的良好修复剂。

引言

近年来磁性纳米材料在基础研究和技术应用受极大关注。应用包括但不限于药物递送载体[1-3]、磁共振成像（MRI）[4-6]、高温热疗[7-9]、生物传感器[10]、细胞分离[11]、蛋白分离[11, 12]、基因磁转染[13-15]、环境污染治理[16, 17]。钴铁氧体作为硬磁材料用作MRI造影剂、靶向药物递送、高温热疗加热介质[18-23]。虽用于生物医学应用，但有局限性：溶液中释放大量钴导致高毒性、溶液中聚集、表面活性剂使用导致表面可及性差。因此通过生物相容、无毒、水稳定分散材料表面修饰克服此问题[24-28]。且钴铁氧体制备简便经济，可按需定制成分、形状、尺寸。合成纳米钴铁氧体技术多样：机械化学[29]、声化学[30]、共沉淀[31, 32]、微乳液[33]等[34-38]。类似地，采用单步环保法利用姜黄素为模板制备定制荧光铜纳米簇[39]。多数技术主要缺点是制备材料结晶度低，导致磁性显著恶化。在这方面，水热[40]和溶剂热[41]技术是合成可控形态和结晶度钴铁氧体最高效技术。

文献报道各种纳米材料如银纳米粒（Ag NPs）用于抗菌治疗相关感染性疾病及作为药物递送纳米载体治疗不同疾病[42]。另一综述报道铁酸盐用于废水中消除多种化学和生物物种[43]。钴铁氧体纳米材料生物医学应用主要问题在于器官积累导致体内毒性，需紧急清除器官积累纳米材料并修复钴铁氧体诱导损伤。多研究者研究抗炎药物发现可减轻纳米材料诱导毒性[44, 45]。姜黄素具抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗致癌特性，可作钴铁氧体纳米材料诱导毒性修复剂[46-48]。其能通过直接结合TNF从体外和体内作为TNF阻断剂[49]。

本工作目标：在实验室制备可控形态PEG包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球。不同剂量纳米材料静脉注射小鼠，进行血液分析、生物分布、HE染色、细胞活力研究评估毒性。比较钴铁氧体纳米粒和纳米球毒性，用姜黄素作钴铁氧体纳米球诱导小鼠毒性修复剂。结果显示钴铁氧体纳米球比纳米粒毒性大，因其表面积增大使其毒性和反应性更高。据我们所知，这是首次此类详细研究。

材料与方法

纳米材料制备

PEG包覆钴铁氧体纳米粒采用水热法[40, 47]。分别配制氯化钴（0.2 M）和硝酸铁（0.4 M）溶液于各25 mL去离子（DI）水中，再分别与聚乙二醇（2.5 mM）和氢氧化钠（3 M）各25 mL水溶液混合。混合物搅拌20 min倒入不锈钢（SS）高压釜，180℃加热6 h。完成后冷却至室温，用DI水和乙醇洗涤2-3次除去杂质。约80℃烘箱过夜干燥研磨成细粉得PEG包覆钴铁氧体纳米粒。

PEG包覆钴铁氧体纳米球采用溶剂热法。六水氯化钴溶于40 mL乙二醇（2.5 mM），加入1.35 g六水氯化铁和1 g聚乙二醇（PEG）。搅拌约30 min后密封于特氟龙内衬SS高压釜。200℃加热8 h，反应结束冷却至室温。用去离子水和乙醇洗涤，80℃烘箱过夜干燥，研磨成细粉得直径80-100 nm PEG包覆钴铁氧体纳米球。制备纳米材料形态用XRD[50]、扫描和透射电镜（SEM和TEM）[50, 51]、室温傅里叶变换红外（FTIR）光谱测定钴铁氧体官能团[51]、拉曼光谱、热重（TGA）分析[52]表征。

纳米材料放射性标记

PEG包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球用^99mTc标记，亚锡氯化物为还原剂[53-55]。新鲜^99mTcO₄发生器洗脱液（50 μL，活度~4 mCi）加入30 μL SnCl₂悬浮液（1 mg/mL于0.5 M HCl中）。用NaHCO₃溶液（1 M）调节悬浮液pH至8-10。含~0.4%wt钴铁氧体的纳米粒和纳米球溶液（各40 μL）与亚锡氯化物悬浮液（50 μg）、抗坏血酸（10 mg/mL）、^99mTcO₄混合。80℃下10,000 rpm搅拌25 min。因^99mTc半衰期短（~6 h），24 h内记录放射性计数以确保准确测量。离心除去上清液，剩余材料鉴定为^99mTc-PEG-钴铁氧体纳米粒和纳米球。纸层析测定标记化合物放射性收率>65%，反映纳米材料小鼠体内真实生物分布。

纳米材料生物分布

如图1所示，昆明SPF小鼠（雌性，6-8周龄，体重18-20 g）来自兰州大学医学科学实验室中心。所有小鼠笼养于温控系统（21-22℃），光照08:00-20:00。自由获取食物和自来水，按国家医学研究学会实验室动物护理规程和美国NIH指南操作。小鼠随机分组，每组5只，静脉注射^99mTc-PEG-钴铁氧体纳米粒和纳米球溶液，分别于1 h、6 h、16 h、24 h处死。立即解剖心、肺、肝、脾、肾组织，箔纸包裹、称重，γ计数器测定各组织^99mTc放射性。纳米材料在小鼠不同器官生物分布以注射剂量百分比每克湿组织重（% ID/g）表示。

苏木素-伊红染色

石蜡切片二甲苯脱蜡重复两次各10 min。通过100%、95%、70%乙醇梯度各2 min水化。流动自来水室温冲洗约2 min。苏木素染色液60℃染核10 s，室温1 min，流水冲洗约5 min。伊红Y工作液染色2 min。95%和100%乙醇各2 min脱水。伊红染色液浸泡15 s染细胞质7 s。去除后流水冲洗，无水乙醇脱水两次各1 min。二甲苯透明15 s，中性树胶封片。奥林巴斯Microphot-CX41显微镜连接数码相机镜检拍照。

生化指标与炎症因子

250 μg PEG包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球静脉注射暴露组小鼠，对照组注射0.9%生理盐水，24 h后处死。采集小鼠血液离心约10 min获血清。用酶联免疫吸附测定（ELISA）和Western blot测定血清TB、ALT、AST、BUN、CREA、Cys-C含量。与肝脏相关酶IL-6、IL-8、TNF-α在坏死诱导炎症反应中起关键作用，器官炎症反应时这些表达水平通常升高。

MTT细胞活力测定

采用MTT比色法测定PEG包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球细胞毒性潜力。上海购买人上皮细胞L-132和人单核细胞THP-1，分别暴露于30-125 μg/mL纳米粒和50-250 μg/mL纳米球不同浓度，UNICO WFZ UV-2000微板分光光度计（上海）在590 nm测定不同实验光密度。选L-132因吸入是纳米材料暴露主要途径；THP-1因其清除异物作用。每次实验未处理细胞作阴性对照。观察细胞酶活性抑制，与未处理（阴性对照）细胞比较，以阴性对照比值绘制随纳米粒和纳米球浓度变化曲线。

统计分析

每个数据点为三重复实验均值（±sem）。用方差分析评价差异显著性，用Origin和Microsoft Excel软件绘制统计图表。

结果与讨论

结构分析

制备纳米材料结构分析（XRD、FTIR、拉曼、TGA）见图2。图2a XRD结果显示包覆和未包覆纳米级钴铁氧体，确认钴铁氧体成功制备。XRD数据所有观测峰位置和相对强度确认钴铁氧体结晶性。无额外峰出现，表明制备钴铁氧体纯度。用Scherrer公式[56]测定钴铁氧体平均结晶尺寸约24 nm。FTIR光谱研究钴铁氧体中阳离子分布（镍、钴、铁）。图2b显示室温FTIR数据。理论上钴铁氧体有两强吸收带（ν₁和ν₂）及400-600 cm⁻¹范围内其他峰。所有峰在图2b数据清晰指示。FTIR中ν₁对应四面体位点金属本征伸缩振动，ν₂对应八面体位点金属离子伸缩振动[57-59]。FTIR 3421 cm⁻¹峰对应聚乙二醇（PEG），表明其成功结合钴铁氧体表面。图2c室温拉曼分析显示5个不同峰。700 cm⁻¹以下峰为钴铁氧体主要特征峰（A_1g模式），对应四面体位点Fe-O键沿氧离子伸缩[60]，其他峰也属钴铁氧体。确认实验成功制备PEG-钴铁氧体。图2d显示50-380℃温度范围TGA结果，表明钴铁氧体不同温度失重。TGA分析显示PEG热稳定性相对低而PEG-钴铁氧体高。

样品电镜分析见图3。图3(a)(b)分别为PEG包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球SEM图像，图3(c)(d)分别为纳米球和纳米粒不同分辨率TEM分析。结果显示纳米粒平均尺寸约25 nm，纳米球80-100 nm。纳米球TEM图像显示由大量较小纳米粒组成，具有大表面积，呈介孔结构，极利于纳米材料作为药物载体医学应用。所有结构分析确认纯相PEG包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球成功形成。

生物分布研究

定量分析PE包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球在血液、心、肝、脾、肺、肾不同时间间隔（1, 6, 16, 24 h）生物分布见图4。静脉注射^99mTc-PEG-钴铁氧体溶液（纳米粒和纳米球）后24 h内评估钴铁氧体在血液和其他器官存在情况。纳米球组（图4a）暴露1 h后血液滞留6.5 ± 0.33% ID/g，随后随时间间隔（6, 16, 24 h）逐渐下降。纳米球主要分布于心、肝、脾、肺、肾，但主要积累于脾脏。各器官纳米球生物分布首小时最高，随后逐渐下降，6 h后维持<30%。纳米粒组暴露1 h后血液滞留约2.8 ± 0.14% ID/g，表明放射性物质从血液库快速清除，随后随时间下降（图4b）。纳米粒分布于心、肝、脾、肺、肾，脾脏和肝脏浓度最高。显然纳米粒在血液和其他器官生物分布首小时最高，6 h后逐渐下降，24 h后达最低值。比较纳米球和纳米粒生物分布结果，PEG包覆钴铁氧体纳米球在小鼠血液和其他器官积累/存在量多于纳米粒。这可能与纳米球较大表面积和高孔隙率相关，是决定纳米材料与生物系统相互作用反应性关键因素。纳米粒非介孔性质、低比表面积使其在相同条件下反应性低于纳米球。这些特性可能降低PEG包覆钴铁氧体纳米粒在小鼠血液和器官中持久滞留。此外，纳米球与生物分子形成复合物导致自由基水平增加、氧化应激水平升高、损伤细胞DNA、脂质过氧化导致氧化应激。

生化指标

为研究PEG-钴铁氧体纳米粒和纳米球小鼠毒性效应，测定生化指标，结果见图5。测定对照组和暴露组小鼠ALT、AST、BUN、CREA、TB、Cys-C等参数。用SPSS软件数据提取，*P < 0.05表示测量显著变化。纳米球和纳米粒暴露组所有生化指标与对照组相比均显示显著变化（*P < 0.05）。钴铁氧体纳米球暴露组ALT、AST、BUN水平与对照组显著差异（*P < 0.05），纳米粒暴露组仅Cys-C与对照组显著差异（*P < 0.05）。主要负责肾功能生物标志物的TB和Cys-C在纳米球组显著下降。提示肾脏受PEG-钴铁氧体纳米球暴露影响大于纳米粒。AST作为肝脏生物标志物，纳米粒和纳米球暴露均影响较大。提示钴铁氧体暴露可不利影响肝功能。所有结果明确显示PEG-钴铁氧体纳米球在小鼠体内造成损伤大于钴铁氧体纳米粒。

组织病理学研究

呈现对照组、纳米粒暴露组、纳米球暴露组、治疗组小鼠组织病理学分析（图6）。比较纳米球和纳米粒暴露组与对照组，PEG-钴铁氧体纳米球在小鼠不同器官（肝、脾、肾、肺）产生损伤大于纳米粒暴露组。肾脏中，与纳米粒暴露和对照组相比，纳米球摄入组见肾小球充血伴轻度水肿和间质炎性细胞。纳米粒暴露组炎症较轻。纳米粒暴露组肺相对少受影响，纳米球暴露组肺泡壁增厚、见轻度纤维化。此外，纳米球暴露组肝细胞肿胀水肿，纳米粒暴露组小鼠肝脏炎症相对较轻。

炎症因子与氧化/抗氧化水平

测定IL-6、IL-8、TNF-α、MDA、T-AOC表达水平，结果见图7。图7a显示对照组、纳米粒暴露组、纳米球暴露组IL-6、IL-8、β-actin Western blot条带。图7b显示三组IL-6、IL-8相对蛋白水平。图7c-e显示TNF-α、MDA、T-AOC含量，*P < 0.05暴露组对对照组±sem。结果显示钴铁氧体纳米球暴露组小鼠IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平高于纳米粒暴露组，两者均高于对照组。T-AOC方面，纳米球水平低于纳米粒暴露组和对照组。所有结果表明纳米粒和纳米球均致小鼠炎症，尤其肝脏。但纳米球影响器官大于纳米粒。众所周知体内纳米材料产生活性氧（ROS），导致抗氧化剂系列定性还原，引起生物组织氧化损伤，不利影响细胞生物[61, 62]。此外，比较纳米粒暴露和纳米球暴露小鼠IL-6、IL-8、TNF-α、MDA、T-AOC水平，发现钴铁氧体纳米球导致炎症大于纳米粒暴露组小鼠。

细胞毒性评估

不同浓度PEG包覆钴铁氧体纳米球和纳米粒细胞毒性研究结果见图8。图8(a)显示L-132细胞存活百分比，图8(b)显示THP-1细胞存活百分比。浓度>100 μg/mL时两种细胞活力均有显著变化，PEG纳米球更明显。确认钴铁氧体纳米球产生损伤大于纳米粒。且随纳米粒和纳米球浓度增加细胞活力下降，表明PEG包覆钴铁氧体两种形式随浓度增加产生更多毒性。因两种不同细胞靶点（L-132和THP-1），细胞反应可能不完全相同，取决于细胞死亡机制[63]。即使粒子尺寸相似，细胞靶点特异性可能归因于吞噬功能，单核细胞（THP-1）具有吞噬功能但肺上皮细胞无[64]。单个纳米球由大量小纳米粒组成，故具较大表面积，比纳米粒反应性更高、与生物系统（组织）相互作用机会更多。且因纳米球尺寸较大，一旦进入器官不易经血液或尿液循环排出，故在体内（器官）滞留时间相对较长，进而不利影响组织。此外纳米球导致巨噬细胞功能降低、纳米球自身吞噬减少、巨噬细胞运动能力下降和细胞骨架功能障碍。

姜黄素对毒性影响

研究纳米球暴露组和姜黄素治疗组血清生化指标并与对照组比较，结果见图9。发现治疗组小鼠所有指标给予姜黄素后显著改善，与纳米球暴露组和对照组比较。图中可见ALT、AST、BUN、CREA、CYS-C、TB表达水平给予姜黄素后趋向正常值。这归因于姜黄素强抗氧化特性减少钴铁氧体毒性产生的氧化应激[47]。也有报道TNF-α和IL-1在肝坏死诱导中起重要作用，姜黄素通过抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1减轻毒性效应[48]，类似文献[65]早期报道。

结论

本工作成功通过水热法和溶剂热法制备PEG包覆钴铁氧体纳米粒和纳米球。结构分析显示制备纳米材料高纯度、高结晶、生物相容性，源于PEG成功连接。钴铁氧体纳米球和纳米粒均对生物系统有毒性。进一步显示钴铁氧体纳米球因大表面积和与生物组织高反应性毒性大于纳米粒。给予姜黄素后生化指标监测到积极变化，姜黄素为无副作用天然化学物质，确认可作钴铁氧体纳米球诱导毒性修复剂。