用于结肠特异性药物递送的壳聚糖加帽酶响应中空介孔二氧化硅纳米平台

介绍

近年来，刺激响应性药物递送系统（DDS）因其在靶向病变组织中有效装载和选择性释放药物而引起了广泛关注[1]。设计的刺激响应系统可以递送到患病部位并实现按需药物释放，以提高治疗效果并阻止过早泄漏引起的副作用。所有内部和外部刺激，例如氧化还原电位 [2]、pH [1]、酶 [3] 以及温度和光 [4, 5]，都已被用于设计刺激响应 DDS。在这些刺激物中，酶作为内部刺激物，因其在不同组织中的浓度不同而受到广泛关注[6]。

在过去的 20 年中，介孔尺寸范围为 2-50 nm 的介孔二氧化硅球 (MSS) 已被确定为刺激响应药物载体 [7, 8]，因为 MSS 具有非常大的孔体积和高表面积，可用于高载药量、组织良好的孔结构、易于功能化的表面和良好的生物相容性[9]。此外，具有介孔壳结构和空腔的中空介孔二氧化硅球 (HMSS) 纳米粒子优于传统的 MSS，因为中空结构可以有效地容纳更多药物，并且比 MSS 载体具有更高的存储容量 [10, 11]。开发了各种基于 MSS 的刺激响应纳米载体，以使用各种看门人来承载药物分子，例如聚合物 [12]、无机纳米颗粒 [13]、树枝状聚合物、生物大分子 [14]、大环化合物肽 [15] 和脂质 [ 16]。尽管许多基于具有功能性封端的 MSS 的 DDS 可以响应各种外部或内部刺激而实现释放，但很少用于结肠特异性靶向给药。

众所周知，口服给药是最受欢迎且简单的给药方式。结肠特异性靶向药物递送对于结肠疾病的治疗非常有吸引力，包括克罗恩病、结直肠癌和溃疡性结肠炎。然而，结肠特异性药物递送可能会遇到一些问题，包括与胃肠 (GI) 道中的其他部位相比，那里的含水量较少，口腔吸附表面相对较少 [17,18,19]。此外，口服 DDS 还遇到胃中的强酸性环境，这可能会加速胃肠道中负载药物的降解，从而消除实现结肠靶向递送的能力 [19]。出于这个原因，已经设计了几种 pH 依赖性 DDS，以在胃肠道的近中性 pH 值 (6-7) 下实现 pH 触发的药物释放，抵抗胃区的高酸性条件 [20,21,22 ,23]。肠道 (pH 6.8) 和结肠 (pH 7.4) 区域之间的酸度仅存在细微差异；因此，这种pH响应性DDS难以实现结肠特异性释放。

壳聚糖 (CS) 是一种阳离子且可生物降解的天然多糖，由 β-(1-4)-连接的氨基葡萄糖和 N-乙酰基-D-氨基葡萄糖单元构成 [24]。 CS 由于其迷人的特性，包括生物降解性、生物相容性、粘膜粘附性和抗菌活性，在生物医学中受到了极大的关注 [25,26,27,28,29]。与通过复杂过程合成的聚合物、聚电解质和超分子相比，CS 相对便宜，并且可以通过对几丁质进行彻底的脱乙酰作用来获得 [30,31,32]。此外，据报道，CS 可以打开细胞之间的紧密连接，从而增加药物吸收 [33]。因此，选择聚合物CS作为封端剂，因为它具有良好的生物相容性和合适的尺寸，可以覆盖HMSS的介孔以阻断药物释放。

在我们的工作中，首次设计了基于 HMSS 材料（HMSS-N=N-CS）的结肠特异性酶响应 DDS，如方案 1 所示。在该系统中，HMSS 载体是通过选择性的蚀刻策略。聚合物 CS 通过偶氮键附着在 HMSS 的表面，作为守门人来阻止 HMSS 的开口。 HMSS 和 CS 之间的偶氮键可以被结肠位点的酶切割 [34, 35]，导致 CS 与 HMSS 的开口分离。以DOX为模型药物嵌入HMSS腔内，进行体外药物释放实验，评价结肠酶存在下的酶反应性释放。共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 和流式细胞术 (FCM) 用于研究 Caco-2 细胞的细胞摄取。最后，测定了HMSS-N=N-CS/DOX对Caco-2细胞的细胞毒性。

a 的示意图 HMSS-N=N-CS和b的制备过程 HMSS-N=N-CS/DOX响应结肠酶的载药和酶响应释放

材料和方法

材料

四乙氧基硅烷（TEOS）； N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；壳聚糖（DAC ≥ 95%）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）； 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）； 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT)；偶氮苯-3,3'-二羧酸；溴化钾（光谱纯度，≥ 99.5%）； N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 和 DOX 购自阿拉丁化学公司（中国上海）。偶氮苯-3,3'-二羧酸由 Inno-chem Technology Co. Ltd.（中国北京）提供。细胞培养基 DMEM、青霉素-链霉素和胎牛血清 (FBS) 由 GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, USA) 提供。所有分析试剂使用前均未进一步纯化。

准备HMSS–N=N–CS

HMSS–NH2的制备

HMSS 纳米粒子是根据已发表的工作使用选择性蚀刻方法制备的 [36]。固体二氧化硅球首先通过改进的 Stober 方法合成。简而言之，将 6 mL TEOS 倒入 10 mL 去离子水、74 mL 乙醇和 3 mL 浓 NH3·H2O 的混合物中。随后，在环境温度下搅拌混合物60 分钟以获得胶态二氧化硅悬浮液。将固体球离心、洗涤并干燥以备进一步使用。然后，介孔二氧化硅壳被覆盖在固体二氧化硅球上。通过超声处理 45 分钟，将 300 毫克固体二氧化硅分散在 50 mL 去离子水中。将二氧化硅悬浮液倒入 60 mL 乙醇、450 mg CTAB、90 mL 水和 1.7 mL NH3·H2O 的混合物中。混合物搅拌60 分钟后，加入TEOS(0.75 mL)。随后，将纳米颗粒在搅拌 6 h 后离心以收集样品，然后重新分散在 40 mL 水中。在剧烈搅拌下将大约 1.2 g Na2CO3 添加到水悬浮液中。将混合物在55°C下保持12 h后，收集HMSS纳米颗粒的产物并用无水乙醇洗涤。 HMSS和APTES的比例为4：1（m / v）的后接枝方法在80°C和N2条件下制备HMSS-NH 8 h，通过回流去除CTAB [3]。

HMSS-N=N-COOH的制备

将偶氮苯-3,3'-二羧酸(50 mg)加入pH 5.8 PBS中。然后加入 (5 mg/mL)、EDC 和 (3 mg/mL) NHS 以在 30°C 下活化偶氮苯-3,3'-二羧酸 1 小时。加入含有 15 mg/mL HMSS-NH2 的 10 mL PBS，搅拌混合物 24 h。得到的HMSS-N=N-COOH离心分离，乙醇洗涤。

准备HMSS–N=N–CS

在50 mL水中加入0.15g CS和0.5 mL乙酸以制备CS溶液。将 100 mg HMSS-N=N-COOH 分散在 25 mL pH 5.0 PBS 中，并通过 EDC 和 NHS 活化 0.5 小时。然后，将 CS 溶液 (10 mL) 倒入悬浮液中，连续搅拌 1 天。最后将合成的HMSS-N=N-CS离心并洗涤收集样品。

从微生物群中提取结肠酶混合物

根据已发表的工作收集结肠微生物群落 [37]。然后，在37℃下接种培养物以获得结肠微生物群分泌的酶混合物。含有酶混合物的模拟结肠培养基通过 0.22-μm 过滤器过滤，以去除培养液中的所有细胞碎片。随后，将滤液冻干得到粉末状的酶混合物，用于进一步研究。

药物加载过程和酶响应释放

将 25 毫克 DOX 溶解在 5 mL pH 3.5 HCl 溶液中。将 100 mg HMSS-N=N-CS 添加到 DOX 溶液中，并在环境温度下搅拌 12 小时。随后，使用0.2 M NaOH溶液将混合物的pH值调节至7.0，并将该悬浮液再搅拌12 小时。然后，将载有 DOX 的 HMSS-N=N-CS（简称 HMSS-N=N-CS/DOX）离心并洗涤以去除 HMSS-N=N-CS 表面吸附的 DOX。在每一步收集上清液，通过紫外-可见分光光度法测量 480 nm 处的 DOX 加载效率 (LE)。 HMSS–N=N–CS 中加载的 DOX 的总质量是通过从添加的 DOX 的初始质量中减去药物加载过程后未加载的 DOX 来计算的。使用 HMSS 作为初始载体制备 HMSS/DOX 作为对照。 DOX的LE根据下式计算：

其中 m A 是 DOX 的添加质量，m B 为上清液中 DOX 的质量，m C为HMSS-N=N-CS的总质量。

从 HMSS-N=N-CS/DOX 中体外酶反应性释放 DOX 的评估如下。将两毫克 HMSS-N=N-CS/DOX 和 HMSS/DOX 纳米颗粒分散在 pH 7.4 PBS 中，以 125 rpm 的速度与不同浓度的结肠酶混合物（0 mg/mL、0.3 mg/mL 和 1 mg/mL）一起振荡.在指定的时间间隔，取出 1 mL 释放介质测量吸光度。在 480 nm 处测量 DOX 的释放。 HMSS/DOX作为对照。

BSA 吸附

BSA 吸附量是根据已发表的作品 [38, 39] 进行评估的。在 pH 7.4 PBS (0.5 mg/mL) 中加入 BSA。将 5 毫克 HMSS 和 HMSS-NH2 以及 HMSS-N=N-CS 添加到 2.5 mL PBS（pH 7.4）中。加入等体积的BSA溶液，将悬浮液置于100 rpm的振荡器中。 6 h后，离心收集上层溶液。最后用考马斯亮蓝溶液染色后在595 nm处测定BSA浓度。

特征化

通过TEM图像（EM-208S，CSIS，USA）评估HMSS纳米颗粒的介孔网络结构和形态。使用氮吸附分析仪（V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China）表征纳米颗粒的表面积和孔径分布。在 Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) 上表征 ξ 电位和粒径。 TGA 分析是在 TGA-50 设备（Shimadzu，Kyoto，Japan）上在氮气流下以 10°C/min 的加热速率测量的。使用 FT-IR 光谱仪（Bruker Tensor27，瑞士）测量傅里叶变换红外分光光度计 (FT-IR) 光谱。范围从400到4000 cm ^-1 使用 KBr 压片技术。 Power XRD 在西门子 D5005 X 射线衍射仪（德国卡尔斯鲁厄）上进行，使用 Cu-Kα 辐射（λ =1.5418 Å).

细胞培养和细胞摄取实验

Caco-2 细胞在补充有 10% FBS、1% 非必需氨基酸、1% (v/v) 丙酮酸钠和 1% 链霉素的培养基中培养。 NIH-3T3 细胞在含有 1% 链霉素和 10% FBS 的 DMEM 中培养。使用 FCM 和 CLSM 表征纳米载体对 Caco-2 细胞的吸收。 Caco-2 细胞接种到 24 孔板中。培养过夜后，将游离的 DOX、HMSS-N=N-CS/DOX 和 HMSS-N=N-CS/DOX 与结肠酶纳米颗粒（等于 5 μg/mL DOX 的浓度）预孵育到相应的孔中.继续孵育 2 h 后，除去细胞培养基并用 PBS 彻底洗涤。然后用4%甲醛固定细胞，Hoechst 33258染色进行CLSM观察。 FCM 用于获得细胞摄取的定量评估。 Caco-2 细胞接种于 6 孔板中，并进一步培养 24 h。用 PBS 洗涤后，将 Caco-2 细胞与游离 DOX、HMSS-N=N-CS/DOX 和 HMSS-N=N-CS/DOX 与结肠酶纳米颗粒（等于 5 μg/ mL DOX) 在无血清 DMEM 中放置 2 小时。然后，将 Caco-2 细胞用冷 PBS 冲洗、胰蛋白酶消化并重新悬浮在 0.5 mL PBS 中。使用FACS Canto流式细胞仪（Becton，Dickinson，USA）测量细胞中的DOX荧光。

体外细胞增殖试验

HMSS 和 HMSS-N=N-CS 空白载体对 NIH-3T3 和 Caco-2 细胞的细胞毒性通过 MTT 分析得到证实 [40, 41]。简而言之，将 Caco-2 细胞和 NIH-3T3 细胞分别接种在 96 孔板中并进一步孵育过夜。旧的细胞培养基被含有不同浓度纳米颗粒的无血清培养基取代。孵育2 天后，50 μL MTT溶液（2 mg mL ^–1 ) 并孵育 4 h 以测量活细胞。然后除去MTT溶液，加入150 μL DMSO溶解甲臜。随后，在酶标仪（Tecan，Männedorf，瑞士）上在 570 nm 处测量吸光度。游离 DOX、HMSS-N=N-CS/DOX 和 HMSS-N=N-CS/DOX 与从结肠微生物群中提取的酶混合物预孵育的细胞毒性使用 Caco-2 细胞测量，相应的 DOX 浓度为（0.1， 1、5、10 和 20 μg/mL）。孵育时间为48 h，其他实验过程同上。

毒性研究

胃肠道黏膜刺激试验对于评估口服给药的体内生物安全性至关重要。雄性 Sprague-Dawley 大鼠 (180 ± 10 g) 随机分为三组（每组三只大鼠）。每天以 100 mg/kg 的剂量给大鼠注射生理盐水、HMSS 和 HMSS-N=N-CS 纳米颗粒。 7 天后，处死所有大鼠，收集组织并进行组织病理学检查（H&E）。为了评估 HMSS 和 HMSS-N=N-CS 纳米颗粒的生物安全性，每隔一天以 100 mg/kg 的剂量口服给药后记录 BALB/c 小鼠的体重（18-20 g）。所有实验程序均按照齐齐哈尔医科大学实验动物护理和使用指南进行，并经齐齐哈尔医科大学伦理委员会批准。

统计数据

统计数据使用SPSS软件使用两尾Student's t进行分析 -测试。本研究中出现的误差条是 SD。一个 p <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

HMSS–N=N–CS 的制备和表征

HMSS 是根据以前的工作编写的，并进行了细微的更改 [36]。首先，制备固体SiO2纳米球，并在含有CTAB模板的固体二氧化硅纳米球表面包覆介孔壳。然后，使用 Na2CO3 选择性蚀刻固体 SiO2 纳米球，同时介孔壳由模板 CTAB 保护。图 1a 描述了 HMSS-N=N-CS 的制备，其中 CS 通过偶氮键连接作为“看门人”。首先，用APTES作为烷基偶联剂修饰HMSS纳米粒子的表面，通过后修饰方法成为氨基官能化的HMSS（HMSS-NH2）。随后，HMSS-N=N-COOH 通过 HMSS-NH2 的氨基和偶氮苯-3,3'-二羧酸的羧基之间的酰胺化反应制备。然后，通过HMSS-N=N-COOH的羧基与CS中的氨基之间的酰胺化反应，将CS共价修饰到HMSS纳米颗粒表面。

a 的 TEM HMSS 和 b HMSS-N=N-CS

如图1a的透射电子显微镜（TEM）图像所示，HMSS的平均直径为280 nm，并且HMSS具有均匀的中空结构和高度有序的介孔壳。平均介孔壳厚度约为 90 nm。与 HMSS 的光滑表面相比，接枝聚合物 HMSS-N=N-CS 的表面（图 1b）粗糙，表明 CS 覆盖了 HMSS 载体。

介孔材料的表面积和孔分布在负载和递送宿主分子以进行控释方面起着至关重要的作用。孔径分布曲线和等温线通过 N2 吸附和解吸分析测量（图 2）。详细参数（Brunauer-Emmett-Teller (BET) 表面积 (S BET)，总孔体积 (V P) 和孔径分布 (D P)) 显示在表 1 中。 S 下注和V 纯HMSS的P为810.7 m ² /g 和 0.969 cm ³ /g 和 D P约为3.8 nm。 D 氨基化后 HMSS-NH2 的 P 与 HMSS 几乎相同，表明氨基功能化后介孔没有被阻断。 S 下注和V HMSS-N=N-CS的P在偶氮化合物和CS涂层改性后显着降低，表明CS已包覆HMSS表面[1]。

一 氮吸附/解吸等温线和b HMSS、HMSS-NH2和HMSS-N=N-CS的孔径分布

HMSS-N=N-CS 的成功接枝已通过各种方法验证。 HMSS-NH2 的 ξ 电位在功能化后发生了很大的变化，从 - 27.9 到 + 31.4 mV，如图 3a 所示，这归因于在 HMSS 表面添加了胺基团。在 HMSS-NH2 与偶氮苯-3,3'-二羧酸反应形成 HMSS-N=N-COOH 后，由于 HMSS 表面的羧基，ξ 电位进一步降低至 - 2.0 mV。在 CS 聚合物进一步接枝到 HMSS 表面形成 HMSS-N=N-CS 后，ξ 电位恢复到 + 32.4 mV。结果归因于 HMSS 表面上氨基丰富的带正电荷的 CS 涂层 [1]。 HMSS、HMSS-NH2、HMSS-N=N-COOH 和 HMSS-N=N-CS 物质的热重分析（TGA）曲线如图 3b 所示。与 HMSS-N=N-COOH 相比，HMSS-N=N-CS 损失了大约 19% 的额外重量，这是由于 CS 链的去除。 HMSS 表面上偶氮键的接枝也通过 HMSS-N=N-COOH 制备过程中的颜色变化得到证实，如图 3b 中的插图所示。反应物 HMSS-NH2 是白色的，而偶氮苯-3,3'-二羧酸与 HMSS 的氨基反应后，产物 HMSS-N=N-COOH 呈黄褐色。流体力学直径 (D H) 和 HMSS、HMSS-NH2 和 HMSS-N=N-CS 的多分散指数 (PDI) 值在蒸馏水中测定，如图 3c 所示。 HMSS 的直径为 309 nm，PDI 为 0.190。在 HMSS 表面加入胺基形成 HMSS-NH2 后，D H 增加到 324 nm。由于接枝的 CS 链，HMSS-N=N-CS 的直径为 342 nm，比 HMSS-NH2 的直径大。 HMSS-N=N-CS (0.177) 的 PDI 小于 HMSS-NH2，表明接枝 CS 后平均粒径变得更大。与从 TEM 获得的直径相比，通过 DLS 测量的 HMSS 和 HMSS-N=N-CS 的直径更大。 D 纳米颗粒的 H 是在具有水合层的水环境中测量的，而由 TEM 提供的纳米颗粒的尺寸是从干燥的纳米颗粒中获得的 [3]。 HMSS-NH2、HMSS-N=N-COOH、HMSS-N=N-CS 和 CS 的 FT-IR 光谱如图 4d 所示。与 HMSN-NH2 的峰相比，2853 和 2925 cm ^-1 处的吸附峰增加 归因于羧基末端偶氮键接枝中-CH2 的振动。 CS加入HMSS-N=N-COOH表面后，1660 cm ^-1 处的吸附峰增加 和 3435 cm ⁻¹ ，这归因于酰胺带中的 υ(C=O) 和 CS 中 N-H 的振动。结果证明HMSS-N=N-CS制备成功。

一 HMSS、HMSS-NH2、HMSS-N=N-COOH 和 HMSS-N=N-CS 的相应 ξ 势； b HMSS–NH2、HMSS–N=N–COOH 和 HMSS–N=N–CS 的 TGA 曲线（插图：(a ) HMSS–N=N–COOH 和 (b ) HMSS-NH2)； c HMSS、HMSS-NH2 和 HMSS-N=N-CS 的尺寸分布插图：纳米颗粒的相应 PDI 值；和 d HMSS-NH2、HMSS-N=N-COOH、HMSS-N=N-CS和CS的FT-IR光谱

DOX、HMSS-N=N-CS、HMSS-N=N-CS/DOX和PM的XRD图谱

药物状态和加载效率

选择 DOX 来研究 HMSS-N=N-CS 的加载和释放行为。当 HMSS-N=N-CS 纳米颗粒悬浮液的 pH 值调节至 pH 3.5 时，由于酸性环境中的质子化氨基，CS 生物聚合物带正电荷（CS 的 pKa 为 6.3）[24]。 CS 聚合物带正电并膨胀，导致 HMSS 中孔的打开，这归因于 CS 电荷之间的排斥相互作用。因此，DOX 通过扩散进入了 HMSS-N=N-CS 的介孔。然而，当载药混合物调整到7.4后，CS链去质子化并坍塌，阻碍了DOX的过早释放。

HMSS-N=N-CS/DOX 的 LE 为 35.2%，远大于其他负载 DOX 的介孔二氧化硅输送系统 [3, 16]。 HMSS 纳米载体中 DOX 的高 LE 归因于空腔、大表面积和介孔网络，可用作药物储库。 DOX 在 HMSS-N=N-CS/DOX 中的物理状态通过功率 X 射线衍射（XRD）进行评估。如 XRD 谱（图 4）所示，原始 DOX 表现出特征性和强烈的药物结晶衍射峰。 HMSS-N=N-CS 和 DOX 的物理混合物（PM）也显示出明显的结晶衍射峰。然而，HMSS-N=N-CS/DOX 没有表现出明显的结晶峰，这证明 HMSS-N=N-CS/DOX 中 DOX 的物理状态是非结晶的，因为 HMSS 的介孔结构的限制。

模拟结肠环境中的体外酶响应释放

为了研究 HMSS-N=N-CS 的酶反应性释放，将 HMSS-N=N-CS/DOX 和 HMSS/DOX 纳米颗粒添加到 pH 7.4 的 PBS 和不同浓度的结肠酶混合物中。如图 5a 所示，HMSS-N=N-CS/DOX 在 pH 7.4 的 PBS 中表现出 DOX 的缓慢释放，并且在 24 h 内累积释放百分比仅为约 10%，表明 CS 具有良好的封盖能力聚合物和偶氮键。正如预期的那样，在 pH 7.4 的 PBS 中稀释酶的情况下，DOX 的累积释放在同一时期内提高到 20% 以上。此外，在浓缩酶的存在下，DOX 的释放量显着增加到近 40%。与 HMSS-N=N-CS/DOX 的酶响应释放相比，HMSS/DOX 的 DOX 释放在浓缩酶存在或不存在的情况下具有相似的趋势。相对较低的药物释放百分比是由于带负电的 HMSS 和带正电的 DOX 之间的静电相互作用 [42]。上述结果证明，从结肠区域微生物群中提取的酶显着加速了 HMSS-N=N-CS/DOX 中 DOX 的释放。酶响应释放机制可能是 HMSS-N=N-CS 中的偶氮键被酶降解，导致 CS 从 HMSS 表面脱离并从 HMSS 快速释放。据报道，偶氮键可被结肠微生物群分泌的酶裂解 [34, 35]。

一 HMSS/DOX 和 HMSS-N=N-CS/DOX 在 pH 7.4 PBS 中在浓缩和稀释的结肠酶混合物存在下的累积释放曲线；和 b HMSS-N=N-CS中DOX在不同pH值释放介质中的体外pH响应释放行为

此外，为了进一步评估模拟 GIT 环境中 HMSS-N=N-CS/DOX 的酶响应释放，HMSS-N=N-CS/DOX 纳米平台最初分散在 SGF 中 2 h，然后进一步分散在SIF 6 h，最后将载体加入含有1 mg/mL提取酶的pH 7.4 PBS中。如图5b所示，在模拟胃液中，DOX的释放速度较快，2 h内累积量达到15%。相对较快的释放是由于 HMSS-N=N-CS 和 DOX 在酸性条件下的相互作用比在中性条件下弱 [1]。然后，DOX 的释放在 SIF 中减慢了 2-8 h。然而，将HMSS-N=N-CS/DOX与提取的酶在pH 7.4 PBS中孵育后，DOX的释放继续显着增加，24 h内累积释放量达到50%以上。 HMSS-N=N-CS/DOX中DOX的不完全释放是由于带正电的DOX和带负电的HMSS之间的强相互作用。

HMSS–N=N–CS 对蛋白质的吸附和稳定性

对于口服给药，纳米载体的表面特性将不可避免地影响药物释放行为和生物吸附[43]。表面上的蛋白质吸附测定用于评估接枝 CS 对 HMSS 表面的影响。如图 6a 所示，裸露的 HMSS 纳米载体具有高达 16.5% 的显着 BSA 吸附，这归因于 HMSS 的大表面积和空腔、强吸附能力以及 HMSS 和 BSA 的硅烷醇基之间的非特异性相互作用。 38, 39]。此外，HMSS-NH2 同样具有相对较高的 BSA 吸附量，为 10.2%。然而，在添加聚合物 CS 作为覆盖物后，表面吸附 BSA 的百分比显着降低至 2.5%，从而显着降低了对 HMSS-N=N-CS 体内行为的影响。为了进一步观察 HMSS-N=N-CS 和 HMSS 样品的稳定性，将 20 mg HMSS-N=N-CS 和 HMSS 添加到 pH 7.4 的 PBS 和去离子水中。如图 6b 所示，虽然 HMSS-N=N-CS 和 HMSS 在水中相对稳定，但 HMSS 在 pH 7.4 PBS 中迅速絮凝。相比之下，聚合物 CS 接枝到 HMSS 表面后，HMSS-N=N-CS 的分散性明显增强。 Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

一 BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH2 and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0.05)。 b Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

一 CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. b The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0.001)

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. c Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. The IC50 value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. The IC50 value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC50 value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

一 Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. b The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)

结论

In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC50 value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.

数据和材料的可用性

所有数据完全可用，不受限制。

缩写

HMSS:

Hollow mesoporous silica spheres

CS：

壳聚糖

DOX：

阿霉素

DDSs:

Drug delivery systems

MSSs:

Mesoporous silica spheres

CLSM:

共聚焦激光扫描显微镜

FCM:

Flow cytometry

FBS：

胎牛血清

LE:

Loading efficiency