壳聚糖封端、酶响应的空心介孔二氧化硅纳米平台用于靶向结肠药物递送

摘要

基于空心介孔二氧化硅球（HMSS）开发了酶响应结肠特异性递送系统，通过可裂解偶氮键将可生物降解壳聚糖（CS）连接于HMSS（HMSS–N=N–CS）。多柔比星（DOX）以非晶态封装在HMSS空腔和介孔中，载药量高达35.2%。体外药物释放证明HMSS–N=N–CS/DOX具有酶响应释放行为。接枝CS可提高生物相容性和稳定性，减少HMSS蛋白吸附。胃肠道黏膜刺激和细胞毒性结果显示HMSS和HMSS–N=N–CS生物相容性良好。细胞摄取结果显示，HMSS–N=N–CS/DOX与结肠酶混合物预孵育后DOX摄取显著增加。经结肠酶孵育的HMSS–N=N–CS/DOX细胞毒性增强，IC₅₀值比无酶组低三倍。本工作为介孔载体用于口服结肠特异性药物递送的后续研究奠定基础。

引言

近年来，刺激响应药物递送系统（DDSs）因能高效载药和在靶向病变组织选择性释药而受广泛关注。设计的刺激响应系统可递送至病变部位并实现按需释药，改善疗效并避免早期泄漏副作用。所有内外部刺激如氧化还原电位、pH、酶、温度和光均被用于设计刺激响应DDSs。其中酶作为内源性刺激，因其在不同组织中浓度差异明显而受广泛关注。

过去二十年，孔径2–50 nm的介孔二氧化硅球（MSSs）已确立为刺激响应药物载体，因其拥有巨大孔容和高比表面积实现高载药量、有序孔结构、易功能化表面和良好生物相容性。此外，具有介孔壳结构和空心腔的空心介孔二氧化硅球（HMSS）纳米颗粒优于常规MSSs，因空心结构能更高效容纳更多药物、存储容量更高。基于MSSs的各类刺激响应纳米载体利用各种门控剂（如聚合物、无机纳米颗粒、树枝状分子、生物大分子、大环化合物肽、脂质）载载药物。尽管许多基于功能化MSSs的DDSs可响应各种内外刺激释药，但鲜有用于结肠特异性靶向给药。

口服给药是最受青睐且简便的给药途径。结肠特异性靶向给药对治疗结肠疾病（克罗恩病、结直肠癌、溃疡性结肠炎）极具吸引力。但结肠特异性给药面临诸多困境：结肠水分少、口服吸收表面积相对较小；口服DDSs还面临胃部强酸环境，可能加速胃肠道中载药降解，失去结肠靶向递送能力。因此设计多种pH依赖性DDSs在胃肠道近中性pH（6–7）触发释药、耐受胃部强酸。但肠道（pH 6.8）和结肠（pH 7.4）酸度差异微小，pH响应DDSs难以实现结肠特异性释放。

壳聚糖（CS）为阳离子可生物降解天然多糖，由β-(1-4)连接的葡糖胺和N-乙酰-D-葡糖胺单元组成。CS因其生物降解性、生物相容性、粘膜粘附性和抗菌活性在生物医学受关注。与复杂合成的聚合物、聚电解质和超分子相比，CS通过甲壳素彻底脱乙酰制得，相对廉价易得。此外报道CS可打开细胞紧密连接，增加药物吸收。因此选择聚合物CS作为封端剂，因其良好生物相容性和适宜尺寸可覆盖HMSS介孔阻挡药物释放。

本工作首次设计基于HMSS材料的结肠特异性酶响应DDS（HMSS–N=N–CS），如方案1所示。HMSS载体通过选择性蚀刻策略制备。聚合物CS通过偶氮键连接HMSS表面作为门控剂封堵HMSS开口。HMSS与CS间偶氮键可被结肠部位酶裂解，导致CS从HMSS开口分离。DOX作为模型药物嵌入HMSS空腔，体外释药实验评估结肠酶存在下的酶响应释放。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术（FCM）研究Caco-2细胞摄取。最后测定HMSS–N=N–CS/DOX对Caco-2细胞细胞毒性。

材料与方法

材料

正硅酸乙酯（TEOS）；N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）；壳聚糖（DAC≥95%）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）；偶氮苯-3,3'-二甲酸；溴化钾（光谱纯，≥99.5%）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和DOX购自阿拉丁化学（上海）。偶氮苯-3,3'-二甲酸由Inno-chem Technology（北京）提供。细胞培养基DMEM、青霉素-链霉素、胎牛血清（FBS）由GIBCO Invitrogen（Carlsbad，USA）提供。所有分析试剂未经进一步纯化直接使用。

HMSS–N=N–CS制备

HMSS–NH₂制备

HMSS纳米颗粒基于文献选择性蚀刻法制备。首先改良Stöber法合成固体二氧化硅球。简述：6 mL TEOS倒入10 mL去离子水、74 mL乙醇、3 mL浓氨水混合液，室温搅拌60 min得胶体二氧化硅悬浮液。固体球离心、洗涤、干燥备用。随后在固体二氧化硅球表面包覆介孔二氧化硅壳。300 mg固体二氧化硅经超声45 min分散于50 mL去离子水，倒入60 mL乙醇、450 mg CTAB、90 mL水、1.7 mL氨水混合液。搅拌60 min后加入TEOS（0.75 mL），继续搅拌6 h离心收集样品，重新分散于40 mL水中。加入约1.2 g Na₂CO₃剧烈搅拌，55 °C维持12 h，收集洗涤得HMSS纳米颗粒。以HMSS与APTES质量体积比4:1在N₂条件下80 °C后接枝法制备HMSS–NH₂ 8 h，回流除去CTAB。

HMSS–N=N–COOH制备

偶氮苯-3,3'-二甲酸（50 mg）溶于pH 5.8 PBS。加入EDC（5 mg/mL）和NHS（3 mg/mL）在30 °C活化1 h。加入含15 mg/mL HMSS–NH₂的10 mL PBS，搅拌24 h。离心分离、乙醇洗涤得HMSS–N=N–COOH。

HMSS–N=N–CS制备

0.15 g CS和0.5 mL乙酸加入50 mL水配制CS溶液。100 mg HMSS–N=N–COOH分散于25 mL pH 5.0 PBS，经EDC和NHS活化0.5 h。注入CS溶液（10 mL）连续搅拌1天。离心洗涤收集合成HMSS–N=N–CS样品。

结肠酶混合物提取

按文献收集结肠微菌群。37 °C接种培养获结肠微菌群分泌酶混合物。模拟结肠培养基含酶混合物经0.22 μm滤膜过滤除去细胞碎片。滤液冻干得酶混合物粉末供后续研究。

载药过程与酶响应释放

25 mg DOX溶于5 mL pH 3.5 HCl溶液。加入100 mg HMSS–N=N–CS于DOX溶液室温搅拌12 h。用0.2 M NaOH调节混合液pH至7.0，继续搅拌12 h。离心洗涤除去HMSS–N=N–CS表面吸附DOX，得DOX负载HMSS–N=N–CS（称HMSS–N=N–CS/DOX）。各步骤收集上清液在480 nm紫外分光光度法测定DOX载药效率（LE）。HMSS/DOX作为对照用HMSS为初始载体制备。LE计算公式：LE(%) = (m_A - m_B) / (m_A - m_B + m_C) × 100，其中m_A为加入DOX质量，m_B为上清液DOX质量，m_C为HMSS–N=N–CS总质量。

体外酶响应释放评价：2 mg HMSS–N=N–CS/DOX和HMSS/DOX纳米颗粒分散于pH 7.4 PBS，125 rpm振荡，加入不同浓度结肠酶混合物（0、0.3、1 mg/mL）。定时取1 mL释放介质测定吸光度，480 nm测DOX释放。HMSS/DOX作对照。

BSA吸附

BSA吸附量按文献评价。BSA加入pH 7.4 PBS（0.5 mg/mL）。5 mg HMSS、HMSS–NH₂、HMSS–N=N–CS分别加入2.5 mL pH 7.4 PBS，加等体积BSA溶液，100 rpm振荡6 h。离心取上清，考马斯亮蓝染色后595 nm测BSA浓度。

表征

HMSS纳米颗粒介孔网络结构和形貌用透射电镜（TEM，EM-208S，CSIS，USA）评价。比表面积和孔径分布用氮吸附分析仪（V-Sorb 2800P，Gold APP，中国）表征。ζ电位和粒径用Nano-z90纳米粒度仪（Malvern，英国）测定。热重分析（TGA）用TGA-50（Shimadzu，日本）10 °C/min升温速率氮气流下测定。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）用Bruker Tensor27（瑞士）400–4000 cm⁻¹ KBr压片法测定。XRD用Siemens D5005（德国）Cu-Kα辐射（λ=1.5418 Å）测定。

细胞培养与细胞摄取实验

Caco-2细胞培养基含10% FBS、1%非必需氨基酸、1%吡鲁酸钠、1%链霉素。NIH-3T3细胞用含1%链霉素、10% FBS的DMEM培养。纳米载体Caco-2细胞摄取用FCM和CLSM表征。Caco-2细胞接种24孔板，过夜培养后加入游离DOX、HMSS–N=N–CS/DOX、经结肠酶预孵育HMSS–N=N–CS/DOX纳米颗粒（DOX浓度相当5 μg/mL），继续孵育2 h。去培养基用PBS彻底洗涤，4%甲醛固定，Hoechst 33258染色CLSM观察。FCM定量评价摄取：Caco-2细胞接种6孔板培养24 h，洗涤后用无血清DMEM孵育上述样品2 h，冷PBS洗涤、胰蛋白酶消化、0.5 mL PBS重悬，用FACS Canto流式细胞仪（Becton Dickinson，USA）测细胞内DOX荧光。

体外细胞增殖实验

HMSS和HMSS–N=N–CS空白载体对NIH-3T3和Caco-2细胞细胞毒性用MTT法检测。Caco-2和NIH-3T3细胞分别接种96孔板过夜。旧培养基替换为含不同浓度纳米颗粒的无血清培养基。孵育2天，加入50 μL MTT溶液（2 mg/mL）孵育4 h测活细胞。移除MTT，加150 μL DMSO溶解甲臜，微孔板读数仪（Tecan，瑞士）570 nm测吸光度。游离DOX、HMSS–N=N–CS/DOX、经结肠微菌群提取酶混合物预孵育HMSS–N=N–CS/DOX对Caco-2细胞细胞毒性测定，DOX浓度分别为0.1、1、5、10、20 μg/mL，孵育48 h，其他过程同上。

毒性研究

胃肠道黏膜刺激试验对口服给药体内生物安全评价至关重要。雄性SD大鼠（180±10 g）随机分三组（每组3只），分别灌胃生理盐水、HMSS、HMSS–N=N–CS纳米颗粒，剂量100 mg/kg/天。7天后处死大鼠，取组织病理切片（H&E）检查。评价HMSS和HMSS–N=N–CS纳米颗粒生物安全性，记录BALB/c小鼠（18–20 g）口服给药100 mg/kg/隔天体重变化。所有实验符合齐齐哈尔医学院实验动物护理使用指南，经伦理委员会批准。

统计学

数据用SPSS软件双尾Student t检验分析。误差棒为SD。p<0.05为统计学显著差异。

结果与讨论

HMSS–N=N–CS制备与表征

HMSS制备参考前人工作微调。首先生成固体SiO₂纳米球，含CTAB模板的固体二氧化硅纳米球表面包覆介孔壳。用Na₂CO₃选择性蚀刻固体SiO₂纳米球，CTAB模板保护介孔壳。HMSS–N=N–CS制备如图1a：先用APTES烷基偶联试剂后修饰法将HMSS纳米颗粒表面氨基功能化得HMSS–NH₂。随后HMSS–NH₂氨基与偶氮苯-3,3'-二甲酸羧基经酰胺化反应得HMSS–N=N–COOH。最后CS羧基与HMSS–N=N–COOH氨基经酰胺化反应共价修饰CS于HMSS纳米颗粒表面。

TEM图（图1a）显示HMSS平均直径280 nm，均匀空心结构和高度有序介孔壳，平均介孔壳厚度约90 nm。相比HMSS光滑表面，接枝聚合物HMSS–N=N–CS表面粗糙（图1b），表明CS覆盖HMSS载体。

介孔材料比表面积和孔分布对载药和控释至关重要。N₂吸附解析等温线和孔径分布曲线见图2，详细参数见表1。纯HMSS BET比表面积（S_BET）810.7 m²/g，总孔容（V_P）0.969 cm³/g，孔径分布（D_P）约3.8 nm。HMSS–NH₂氨基化后D_P几乎不变，表明介孔未被堵塞。HMSS–N=N–CS经偶氮化合物修饰和CS包覆后S_BET和V_P显著下降，表明CS包覆HMSS表面。

HMSS–N=N–CS成功接枝经多种方法验证。HMSS–NH₂ ζ电位经功能化从-27.9 mV变至+31.4 mV（图3a），归因于表面氨基引入。HMSS–NH₂与偶氮苯-3,3'-二甲酸反应生成HMSS–N=N–COOH后ζ电位降至-2.0 mV，因表面羧基。进一步接枝CS聚合物生成HMSS–N=N–CS后ζ电位回升至+32.4 mV，归因于氨基丰富正电荷CS包覆。热重分析（TGA）曲线见图3b。与HMSS–N=N–COOH相比，HMSS–N=N–CS额外失重约19%，因CS链去除。偶氮键接枝在HMSS表面也由HMSS–N=N–COOH制备过程颜色变化证实（图3b插图）：反应物HMSS–NH₂为白色，产物HMSS–N=N–COOH经偶氮苯-3,3'-二甲酸与氨基反应变为黄褐色。HMSS、HMSS–NH₂、HMSS–N=N–CS水动力学直径（D_H）和多分散指数（PDI）见图3c。HMSS直径309 nm，PDI 0.190。氨基修饰后HMSS–NH₂ D_H增至324 nm。HMSS–N=N–CS直径342 nm，大于HMSS–NH₂因接枝CS链。HMSS–N=N–CS PDI（0.177）小于HMSS–NH₂，表明接枝CS后粒径分布更均一。与TEM直径比较，DLS测得直径较大，因水合层存在。FT-IR谱（图3d）显示：与HMSN–NH₂相比，2853和2925 cm⁻¹吸收峰增强归因于接枝羧基末端偶氮键-CH₂-振动；CS加入后1660 cm⁻¹和3435 cm⁻¹吸收峰增强分别归因于酰胺带υ(C=O)和CS中N-H振动。所有结果证明HMSS–N=N–CS成功制备。

药物状态与载药效率

DOX用于考察HMSS–N=N–CS载药释放行为。HMSS–N=N–CS纳米颗粒悬浮液pH调至3.5时，CS生物聚合物因酸性环境质子化氨基变为正电荷（CS pKa 6.3）。CS聚合物带正电荷膨胀，因电荷排斥打开HMSS介孔，DOX扩散进入HMSS–N=N–CS介孔。药物负载混合液调至pH 7.4后，CS链去质子化坍塌阻碍DOX过早释放。

HMSS–N=N–CS/DOX LE为35.2%，远高于其他DOX负载介孔二氧化硅递送系统。高载药量归因于空心腔、大比表面积和介孔网络可作为药物储库。HMSS–N=N–CS/DOX中DOX物理状态用XRD评价。图4 XRD谱显示：原始DOX呈特征强烈晶体衍射峰。HMSS–N=N–CS与DOX物理混合物（PM）也显明显晶体衍射峰。但HMSS–N=N–CS/DOX无明显晶体峰，证明DOX在HMSS–N=N–CS/DOX中因介孔结构限制呈非晶态。

模拟结肠环境体外酶响应释放

考察HMSS–N=N–CS酶响应释放，HMSS–N=N–CS/DOX和HMSS/DOX纳米颗粒加入含不同浓度结肠酶混合物的pH 7.4 PBS。图5a显示：HMSS–N=N–CS/DOX在pH 7.4 PBS中DOX缓慢释放，24 h累积释放仅约10%，表明CS聚合物和偶氮键封堵能力良好。稀酶存在下累积释放提升至20%以上。浓酶存在下DOX释放量显著增加至近40%。对比HMSS/DOX，无论是否有浓酶，DOX释放趋势相似。较低释放百分比归因于负电荷HMSS与正电荷DOX间静电相互作用。上述结果证明HMSS–N=N–CS/DOX中DOX释放被结肠微菌群酶显著加速。酶响应释放机制可能是酶降解HMSS–N=N–CS中偶氮键，导致CS从HMSS表面脱离，HMSS快速释药。偶氮键可被结肠微菌群分泌酶裂解。

进一步评价模拟胃肠道环境中HMSS–N=N–CS/DOX酶响应释放：HMSS–N=N–CS/DOX纳米平台先分散于模拟胃液（SGF）2 h，再分散于模拟肠液（SIF）6 h，最后加入含1 mg/mL提取酶的pH 7.4 PBS。图5b显示：模拟胃液中DOX释放较快，2 h累积达15%，因酸性条件下HMSS–N=N–CS与DOX相互作用较弱。随后SIF中2–8 h释放减缓。但经提取酶孵育后DOX释放持续显著增加，24 h累积释放超50%。DOX未完全释放因正电荷DOX与负电荷HMSS强相互作用。

HMSS–N=N–CS蛋白吸附与稳定性

口服给药中纳米载体表面性质不可避免影响药物释放和生物吸附。BSA吸附实验评价接枝CS对HMSS表面影响。图6a显示：裸HMSS纳米载体BSA吸附高达16.5%，归因于大比表面积和空心腔、强吸附能力、HMSS硅醇基与BSA非特异性相互作用。HMSS–NH₂同样吸附BSA量较高（10.2%）。但聚合物CS包覆后表面吸附BSA百分比显著降至2.5%，大幅降低对HMSS–N=N–CS体内行为影响。进一步观察HMSS–N=N–CS和HMSS稳定性：20 mg样品分别加入pH 7.4 PBS和去离子水。图6b显示：虽两者在水中相对稳定，但HMSS在pH 7.4 PBS中快速絮聚。相反，CS接枝后HMSS–N=N–CS分散性明显增强，在pH 7.4 PBS中可稳定>12 h无沉淀。证明亲水性CS聚合物包覆可提高HMSS–N=N–CS分散性、减少表面蛋白吸附。

细胞摄取

Caco-2细胞作为人上皮结直肠腺癌细胞，广泛用作口服给药模型细胞。图7a显示：游离DOX组Caco-2细胞荧光信号较强，因正电荷DOX易进入细胞和细胞核。相比游离DOX组，HMSS–N=N–CS/DOX组荧光较弱，因药物未完全释放。但HMSS–N=N–CS/DOX经结肠酶混合物预孵育1 h后荧光显著增强。归因于酶混合物裂解偶氮键，导致CS从HMSS表面脱落，显著加速DOX释放。FCM定量评价摄取差异。图7b显示：HMSS–N=N–CS/DOX组平均荧光强度（MFI）124.7，弱于游离DOX组（p<0.001）。激动人心的是，经酶预孵育1 h后MFI显著增至357，甚至超过游离DOX组，因偶氮键断裂加速药物释放。所有结果表明HMSS–N=N–CS/DOX中偶氮键可在结肠酶存在下裂解，导致CS脱落、加速DOX释放。

体外细胞活力评价

为证明HMSS–N=N–CS/DOX模拟结肠条件下酶响应释放效应，用Caco-2细胞进行体外细胞活力实验。经典抗癌药DOX用于细胞活力测定。实验前，不同浓度空白HMSS和HMSS–N=N–CS用MTT法检测纳米平台对Caco-2和正常NIH-3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞生物相容性，浓度10–250 μg/mL。图8a、b显示：HMSS和HMSS–N=N–CS不同浓度孵育Caco-2或NIH-3T3细胞后细胞毒性可忽略，100 μg/mL高浓度下Caco-2细胞活力分别为87.9%和88.3%，足够高供临床应用因HMSS高载药量。NIH-3T3细胞孵育48 h在100 μg/mL较高浓度下活力仍>80%。表明HMSS和HMSS–N=N–CS细胞相容，可用于口服递送。

DOX负载纳米载体HMSS–N=N–CS/DOX对Caco-2细胞活力影响见图8c。游离DOX对4T1细胞显强浓度依赖性细胞毒性，因正电荷游离DOX易透过细胞膜。游离DOX组IC₅₀经SPSS软件确定为10.18 μg/mL。相比游离DOX，HMSS–N=N–CS/DOX同DOX浓度下细胞活力更高，因负电荷HMSS载体与正电荷DOX强静电相互作用导致DOX不完全释放。HMSS–N=N–CS/DOX组IC₅₀为32.22 μg/mL，远高于游离DOX。但经浓结肠酶预孵育HMSS–N=N–CS/DOX显示明显浓度依赖性细胞毒性，IC₅₀计算为9.41 μg/mL，远低于HMSS–N=N–CS/DOX组。原因归因于结肠酶降解HMSS–N=N–CS偶氮键，导致接枝CS从HMSS表面脱离，引起HMSS载体快速释药。

毒性研究

HMSS–N=N–CS危害性是未来临床应用前必须考虑的关键因素。H&E染色胃肠道黏膜刺激评价口服递送系统体内生物安全性（图9a）。相比生理盐水组，HMSS和HMSS–N=N–CS组口服给药一周（剂量100 mg/kg）后均无明显病理改变或充血。实验过程中未观察到大鼠死亡或异常行为。体重下降被广泛视为体内全身毒性重要简易指标。图9b显示：HMSS和HMSS–N=N–CS组小鼠体重轻微增加，与生理盐水组相似。上述结果表明HMSS和HMSS–N=N–CS作为口服药物载体显示良好生物相容性。

结论

总之，可生物降解CS通过偶氮键封端HMSS开口实现酶响应结肠特异性药物递送。DOX以非晶态负载于HMSS空心腔和介孔中，载药效率高达35.2%。稳定性和BSA吸附结果表明CS封端可提高HMSS生物相容性和稳定性。体外释放结果证明HMSS–N=N–CS/DOX在结肠酶存在下表现出酶响应释放行为。CLSM摄取和FCM结果表明经结肠酶混合物孵育后HMSS–N=N–CS/DOX中DOX细胞摄取显著增加。细胞活力结果表明经结肠酶孵育HMSS–N=N–CS/DOX细胞毒性增强，IC₅₀值从32.22 μg/mL明显降至9.41 μg/mL。