用于侧向层析定量分析的便携式等离子体热传感设备

摘要

即时检测(POCT)广泛用于疾病早期诊断和监测。侧向层析分析(LFA)是成功商业化的POCT工具。但LFA常缺乏定量能力和分析灵敏度。为解决这些缺陷，我们之前开发了利用等离子体金纳米颗粒产生热对比度的热学LFA并集成至便携设备。虽显著提高分析灵敏度，但定量问题仍存。本研究优化设备传导和辐射热传感模式操作条件，实现LFA定量。仅含纳米颗粒的试纸条检测限较传统目视检测降低5倍(传导模式)和12倍(辐射模式)。研究环境温度对两种检测方法影响，辐射模式受环境温度影响大于传导模式。为验证热传感法，利用LFA试纸条定量人绒毛膜促性腺激素(HCG)生物标志物，辐射检测法检测限达2.8 mIU/mL。

引言

早期检测和快速诊断对疾病筛查治疗至关重要。大多数医学检测耗时、需复杂临床样品制备、大型仪器和专业人员[1]，严重阻碍资源匮乏地区医疗。POCT利用简单设备缩短获取临床相关结果时间，助临床医生和患者快速决策。POCT优势明显：检测时间短、样品处理快、仪器简单、操作要求低[2,3]。POCT有助于疾病早期快速诊断，特别是资源匮乏地区，改善医疗条件。但低分析灵敏度、复杂操作、高设备成本常阻碍应用。急需寻找具备理想特性且最小化缺陷的POCT应用。

为解决上述问题，LFA是POCT检测工具优秀候选。LFA是基于纸的即时检测条带生物传感器，用于识别给定样品中靶标分析物[4,5]。LFA在纸基条带(方案1b)进行，包含样品垫、结合垫、吸收垫、检测发生的硝酸纤维素膜。LFA优势包括：快速单步检测、成本效益高、操作简便、样品量少、不同环境条件下长保质期[6,7]。常规LFA通过肉眼观察检测线颜色变化给出"是/否"结果，最流行检测法，但缺乏准确性和主观判断[8]。不过LFA易与电子设备集成，开发条带读取器获取准确定量结果可行。电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器常用于条带读取器捕获图像。图像处理软件常用于定量分析。这些光学读取器记录外部光源反射、透射或散射光学信息以实现定量[9-12]。比色读取器从检测线和对照线收集颜色强度(灰度值或RGB坐标)分析LFA条带[13-17]。缺点是染料可能因光损伤、机械或其他降解过程褪色，导致重复性和准确性差。荧光读取器[18,19]中有机荧光团暴露于特定激发波长诱导发射，收集发射光定量检测。不可忽视的问题是有机荧光团常受光漂白和化学降解影响，信号随时间衰减，需特殊处理和储存[7]。

近期热传感逐渐应用于LFA检测。热传感利用热转换器，分析物存在时产热增加，通过转换器检测热信号。Polo等[20]探索等离子体加热驱动传感概念，用近红外(NIR)光源诱导各向异性金纳米颗粒等离子体特性产热，检测癌症生物标志物癌胚抗原(CEA)。Qin等[21]提出用绿激光光源热对比度定量LFA，分析灵敏度提升32倍。2016年Wang开发类似热对比度读取器[22]，LFA定量灵敏度增强8倍。诱导换能器产热的光源可调谐至特定波长，避免不吸收该波长其他分子干扰，保证检测特异性。使用电磁波谱NIR区光源可防止生物源分子(特别是血液)吸收光[23]。这些优势显示NIR光源等离子体热传感是极具前景的LFA检测方法。但先前研究未开发结合LFA条带和NIR光源的POCT设备。

本研究开发基于等离子体热传感的便携设备(方案1a)，无需额外修饰条带即提高LFA分析灵敏度。NIR激光照射使局域表面等离子体共振(LSPR)峰值充分发挥放大信号。原型激光波长位于纳米颗粒(作为光-热转换器)LSPR峰值内，在检测线产生热量。设备内热传感器测量检测线产生的热量，通过红外辐射(辐射模式)或热传导(传导模式)检测。产生热量与检测线纳米颗粒数量和照射功率成正比[24]。无需额外操作。

热传递三种主要形式：传导、对流、辐射。为研究不同热传递形式检测性能，用两种传感器测试传导模式(接触)和辐射模式(非接触)(方案1a和附件1:图S1)。原型紧凑，采用嵌入式系统技术和表面贴装元件。研究影响检测能力主要因素优化操作条件。验证便携设备检测能力，直接负载纳米颗粒于膜的LFA条带定量并与常规目视检测比较。因检测方法温度依赖，研究环境温度对热信号检测影响并获传导模式标定曲线。最后以HCG生物标志物定量验证热传感检测能力。

材料与方法

材料与试剂

磷酸盐缓冲液(PBS)购自Lonza®。EDC和双功能聚乙二醇(HS-PEG-COOH, MW=5000 g/mol)购自SIGMA®。Tween 20、Triton X100、牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(S-NHS)、氢氧化钠、氯化钠、氯金酸、HCG激素购自Aladdin®。蔗糖、四硼酸钠十水合物、硼酸、碘化钾、硫代硫酸钠五水合物购自国药集团化学试剂有限公司。硼氢化钠购自上海凌峰化学试剂有限公司。抗-αHCG、抗-βHCG和抗小鼠二抗、硝酸纤维素膜(NC-a110)、样品垫(玻璃纤维BX108)、结合垫(玻璃纤维BX101)、聚氯乙烯(PVC)表面购自JieyYiBiotech™。4-吗啉乙磺酸(MES)购自上海美卜。无水乙醇购自常熟扬元化工有限公司。

纳米颗粒合成(金纳米棱柱, AuNPrs)

本研究纳米颗粒采用前文报道方案变体[25]后改进[26]制备。简述：220 mL 0.5 mM Na₂S₂O₃补充20 μL 0.1 M KI。将上述溶液110 mL逐渐加入2 mM HAuCl₄溶液中(30 s)，室温孵育至总计4 min，再补充剩余110 mL Na₂S₂O₃+KI溶液(30 s)，再孵育4 min。最后加入100 mL无KI Na₂S₂O₃，室温孵育60 min得最终棱柱形纳米颗粒。所有孵育步骤无振荡。合成后纳米颗粒PEG化稳定。PEG添加量按总金重量1:2比例(NPs:PEG)。PEG稀释于1 mL Milli-Q水，加入定量NaBH₄达PEG:NaBH₄ 1:1摩尔比。全部PEG-NaBH₄溶液加入AuNPrs，2 M NaOH调节pH 12温和混合。60°C超声60 min，室温4400 G离心15 min分离AuNPrs与过量PEG和未反应物。沉淀重悬Milli-Q水，室温4400 G离心9 min重复三次。最终样品稀释至原始体积1/4，室温静置数周沉淀。移除上层含较小较轻纳米金副产物的溶液，底部沉淀AuNPrs。测定400 nm吸光度(OD)经UV-Vis光谱并应用转换因子(ε)11.3 mL·mg⁻¹·cm⁻¹得纳米颗粒浓度。该值通过ICP测得金浓度与UV-Vis 400 nm OD关联实验获得。

纳米颗粒与抗HCG抗体偶联

简述：3 mL 0.5 mg/mL PEG化纳米颗粒溶液用0.1 M MES缓冲液pH 5.5离心洗涤三次(9 min, 6000 rpm, 室温)。最终洗涤纳米颗粒重悬于1 mL同缓冲液，加入4 mg EDC和S-NHS，温和混合孵育20 min，9 min 6000 rpm离心，MES缓冲液洗涤。加入20 μL抗体储存液(200 μg)，37°C孵育3 h后4°C过夜孵育(无振荡)。次日共轭纳米颗粒离心(9 min, 6000 rpm)，硼酸缓冲液5 mM pH 9洗涤两次。加入25 mg BSA，室温温和振荡孵育1 h，硼酸缓冲液含Tween 20(5 mM pH 9)洗涤(9 min, 6000 rpm)，最终4°C保存不超过4-5天待用。纳米颗粒制备后组装测试条(附件ESI描述)。

条带膜负载纳米颗粒

为负载纳米颗粒于条带膜，获取PEG化纳米颗粒原始储存液浓度(无抗体)，Milli-Q水系列稀释得0(纯Milli-Q水无纳米颗粒)至10 OD/mL最大浓度(对应0.9 mg/mL，按ICP-AES前表征转换因子)。为简化外推，优先用OD值而非重量浓度。各稀释液2 μL用微量移液器直接加于条带硝酸纤维素膜上，室温干燥~2 h。干燥条带室温保存待照射测试。

HCG抗原检测条带，PBS中HCG系列稀释。每条条带加载5 μL抗HCG抗体共轭AuNPrs至结合垫，50 μL所需稀释液含HCG。条带干燥方式同前测试。

便携设备开发

便携设备(图1a和附件1:图S1)采用嵌入式系统技术和表面贴装元件组装，因体积小、成本效益高。原型组成见图1b。主板(附件1:图S1)为核心模块，功能为数据处理和控制其余组件。主要由MCU STM32F407组成，具大内存和低功耗运行。主板设计电压转换电路为各模块提供正确电压供应。

主板五接口连接其他模块。温度传感器通过IIC接口连接主板接收传感器传输温度信号。为精确测温选用数字输出温度传感器。传导模式传感器为半导体传感器(ADT7420, Analog Devices)，16位温度分辨率(0.0078°C)，低功耗(700 μW)。辐射模式用红外测温仪(MLX90614, Melexis)，17位温度分辨率，3.9 mW功耗。激光控制模块与主板接口为继电器控制电路，确保精准管理激光二极管并保护主板免受大电流冲击。激光模块含三组件：(1)激光控制组件(附件1:图S1)，(2)激光二极管(Thorlabs, M9-A64-0200)提供1064 nm波长、200 mW最大光功率输出光源，(3)非球面透镜(Thorlabs, 354330-C)安装激光模块聚焦激光二极管发射光至1 mm×2.5 mm区域。这些组件实现精准照亮条带检测线。LCD触摸屏(TaoJinChi TJC4827K043_01RN, 480×272像素)提供图形用户界面。接口4留作程序下载调试。USB接口作电池充电口和设备与可选外部计算机通信口。原型由10,000 mAh锂电池供电。MCU程序用IAR软件(7.50.2.10505版)编译。图形用户界面用USART HMI软件设计。

原型外壳与测试条盒设计

为确保设备用户友好和便携，设计3D打印外壳和盒体，提高抗干扰能力和稳定性。外壳和盒体材料均用白色树脂。Solidworks 2018软件设计。

按内部组件形状设计长方体外壳(附件1:图S2a)和长方形底板(附件1:图S2b)。长方体外壳为LCD屏幕和激光二极管控制模块提供固定安装位。外壳侧面长方形槽插入测试条盒。底板设电池和主板安装座，组件固定不动。所有检测部件固定底板。传感器和条带盒支撑框架固定底板，使其紧密接触。激光二极管和透镜微调移动轨道用于固定和调节距离。整机尺寸133 mm×108 mm×73 mm。

设计专用盒体(图1c, 15 mm×4 mm×70 mm)保护测试条。盒体三窗口：一供样品加载，二供检测线和对照线可视化。检测线窗口设计略窄于测试条宽度，确保激光无法穿透测试条影响传感器检测。盒背面开背槽，确保传导传感器完全接触条带背面检测线位置，同时辐射传感器能正常检测温度。

热传感算法与参数计算

激光照射纳米颗粒在检测线产生热量，引起可检测温度变化。热生成量(Q, W/m³)取决于纳米颗粒浓度(C, OD/mL)、照射面积(A, m²)、激光强度(I, W/m²)[22]，公式(1)：Q=CIA。激光照射条带时采集热信号(温度)。照射面积和激光强度恒定时，热信号随检测线结合纳米颗粒量变化。量化热生成比较两法。第一法用温度变化(附件1:图S3)量化热信号。温度变化(ΔT)计算公式(2)：ΔT=Tend−T0。Tend为照射结束达到最终(最大)温度，T0为照射开始前传感器记录初始环境温度。第二法用曲线下面积定量计算(AUC, 附件1:图S3)。按10 Hz采样频率将曲线分割成梯形，计算所有梯形面积之和。热信号为面积除以检测时间(tdet)：AUC=Σ(ΔTi+ΔTi-1)×0.1÷2 (3)；Tauc=AUC÷tdet (4)。两法检测中AUC分析给出更好定量重复性(附件1:图S4)，故选AUC分析作最终热量化。

评估不同检测方法性能，考察定量检测限(LOD)。每实验测一浓度四样本(四条带, n=4)。考虑空白组标准差(σ₀)和灵敏度(S, 标准曲线线性范围斜率)，按公式(5)评估LOD：LOD=3σ₀/S。

实验步骤

整个实验步骤含三主步：(1)数据采集，(2)检测获取结果，(3)结果显示存储。首先测试条装入盒体插入设备。轻触检测按钮输入患者信息(可选匿名代码)即可测量。信息传输至单片机(MCU)存储。MCU激活温度传感器和激光二极管开始测试。同时MCU接收温度数据发送至LCD实时显示绘图。检测后MCU计算AUC值并在屏幕显示结果。

结果与讨论

纳米颗粒表征

共轭纳米棱柱UV-Vis光谱(图2a)显示最大峰1130 nm。AuNPr在激光波长1064 nm处吸光度为1130 nm最大吸光度92%。SEM和TEM图像(图2b,c)观察纳米颗粒形貌，确认多为三角形。

设备测量条件优化

热传感中检测时间和激光二极管至检测线距离是影响信号响应主要因素[27,28]。研究两因素优化测量条件。辐照时间优化：条带照射10 min分别记录两传感器温度变化。图3a显示温度10 min持续上升，但120 s后升温开始达平台期。符合前人研究热信号随时间变化趋势[28]。考虑POCT要求和功耗，设备检测时间设120 s。

距离优化：图3b显示热信号随激光二极管至检测线距离增加而减弱。原因可能是距离增加有效照射面积导致到达检测线激光功率衰减。为获最大信号响应，距离设7 mm。

环境温度对热传感影响

热传感与温度密切相关，需研究环境温度影响。用培养箱环境温度范围27.5–40°C，间隔2.5°C每温度点测4样本。空白和1 OD/mL条带分别用两热传感法测环境温度-热信号曲线。环境温度拟合曲线参数见表1。图4a显示传导模式下不同浓度曲线斜率总体一致，表明环境温度变化对不同浓度影响相同，故环境影响曲线可校准定量结果。辐射模式下两浓度曲线斜率一致但均呈下降趋势(图4b)。结果提示传导模式在高温度变异条件下测量样品更可靠。

纳米颗粒定量

热传感检测

获标准定量曲线，用两热传感法(附件1:图S5)分别检测0–10 OD/mL纳米颗粒条带。条带(附件1:图S6a)含不同浓度纳米颗粒经便携设备检测(见"材料与方法")。设备两传感器设置见附件1:图S5a、S5b。环境温度27.5°C下每浓度测4样本。设备用AUC法计算检测线热信号。热信号定量与检测线纳米颗粒量成正比。线性回归热信号对纳米颗粒浓度数据生成定量曲线(图5a)，公式见表2。

表2显示辐射模式灵敏度比传导模式高15倍。传导和辐射模式LOD分别为0.053和0.023 OD/mL。热传感中辐射模式比传导模式LOD提升2倍。LFA条带稳定性测试见附件1:图S7。传导热传感模式需两固体间传热。检测线温度快速升高时，传感器需时间(弛豫时间)达同温度。故检测结束时传感器温度低于检测线实际温度。辐射模式无需传热至传感器，直接检测检测线辐射红外波获当前温度。传导检测中部分热因良好热导体作散热器而耗散；辐射检测仅空气和条带本身参与散热。这些原因解释传导法灵敏度低于辐射法。

测试10 OD/mL条带时，辐射(非接触)模式发现烧焦痕迹。可能原因：非接触测量中空气低热导率致热量滞留检测线散热低效，局部有效温度升高最终导致膜燃烧。接触模式下大热导率传感器作介质和散热器，热量传导至传感器，检测线未燃烧。

热传感与目视检测比较

因目视检测普及便携设备广泛使用，比较热传感与目视检测检测能力。目视检测用常规显微镜数码相机拍摄条带图像。条带装入盒体确保图像分析位置一致性，类似热传感。Image J软件分析不同浓度纳米颗粒检测线灰度值。绘制目视检测标准曲线(图5a)。灰度值与纳米颗粒浓度线性范围0.2–10 OD/mL(0–0.2 OD/mL R²=0.770，舍弃)。检测限0.268 OD/mL。结果显示热传感较目视检测LOD降低5-12倍。Qin研究发现目视分析LOD比热对比高100倍[21]，因其用高激光功率和红外相机获更大LOD差异。合理解释：热传感能测量膜表面上下纳米颗粒。热传感稳定性高于目视检测。热传感由整个检测线纳米颗粒产热；目视检测仅依赖检测线表面纳米颗粒比色反应。即使两条带分析物浓度相同，纳米颗粒在T线切平面分布不同，目视检测结果差异，热传感更稳定可重复。相反目视检测灵敏度比热传感高2倍。目视检测是纳米颗粒直接定量法，热传感通过测温间接测量纳米颗粒浓度，部分解释灵敏度不足。图5b显示热传感线性检测范围低至0 OD/mL，R²分别0.972(传导)和0.987(辐射)，提示热传感在POCT早期检测应用潜力优于比色定量，因靶标分析物浓度更低。

HCG定量检测

最后用本系统定量生物标志物HCG验证热传感。传导和辐射模式均用于HCG定量。光功率降至150 mW防条带烧焦。测试四浓度条带(附件1:图S6b)。图6a,b显示热信号与HCG浓度35–700 mIU/mL线性相关。浓度扩展至35–7000 mIU/mL时，热信号与HCG浓度对数线性相关(图6c,d)。传导模式LOD 64.2 mIU/mL，与目视检测相近。辐射模式理想LOD 2.8 mIU/mL。数据与纳米颗粒定量吻合。相比应用光热效应设备(LOD=5.5 mIU/mL)[27]，辐射模式LOD降低近2倍。结果证明热传感是LFA检测定量有效途径。

结论

建立基于等离子体热传感的LFA检测方法。开发应用不同温度传感器(传导和辐射模式)的便携设备。环境温度影响研究表明其对热传感有负面影响，传导模式受影响小于辐射模式。辐射模式高浓度下影响更显著。两模式均测试定量能力。与传统目视检测比较，纳米颗粒定量热传感法LOD提升5-12倍。辐射模式在灵敏度和LOD上均优于传导模式。验证热传感时测试HCG LFA条带，结果显辐射模式比传导模式灵敏得多。证明热传感是LFA平台早期检测可行有效方法。

总之，等离子体热传感真正提高分析灵敏度，在LFA早期诊断应用前景广阔。本文描述的便携设备提供两种传感方案满足不同需求。