荧光纳米生物质点：超声波辅助提取及其作为 Fe3+ 检测纳米探针的应用

背景

发光纳米材料由于其独特的光学特性而获得了广泛的应用，特别是在发光二极管、检测器、生物成像和金属离子检测中 [1,2,3,4,5,6]。迄今为止，已经报道了各种发光纳米材料，如半导体量子点（QDs）、碳纳米点和硫量子点，它们在许多领域取得了很多进展[7,8,9,10,11,12] .量子点作为发光纳米材料的极好代表，由于其优异的光学和电学性能，已被应用于许多领域。尽管如此，量子点的毒性仍然极大地限制了它们的应用[13, 14]。寻找更绿色、更可持续的发光纳米材料始终是非常重要的。生物质是一种可以通过光合作用产生的原始有机物质，因其可持续和可再生的特性而备受瞩目。具体而言，生物质被定义为生物体的产品、废物和残留物的可生物降解部分 [15, 16]。在纳米技术的背景下，生物质通常被用作前驱体，经过特殊处理后可以变成具有一定光学特性的纳米点。与化学前体相比，生物质尤其是可食用生物质的主要成分是糖类和蛋白质，在后续处理中是无害的。因此，纳米生物质点（NBDs）应具有较高的生物相容性，以保证其在生物和环境领域的应用，且不产生有害物质。

迄今为止，仅报道了生物质衍生的荧光碳纳米点。基本上，一些天然生物质如树叶、蛋清和柠檬汁通过水热法处理合成荧光碳纳米粒子 [17,18,19]。还有另一种碳纳米点存在于可食用食品中，它们是在天然生物质的进一步加工过程中产生的 [20, 21]。无一例外，它们都涉及典型的高温碳化过程。该过程可能涉及时间长、温度高，难以实现大规模批量生产[22]。与高温相比，常温或低温条件更容易进行并保持生物质本身的原始性质。

纳米探针是发光纳米材料的重要应用之一[23]。 NBDs具有明亮的荧光和高生物相容性，可作为一种纳米探针用于生物学和环境领域。 Fe ³⁺ 是人体内重要的金属离子，在血红蛋白和肌红蛋白的合成中起着重要作用[24]。但过量的Fe ³⁺ 在体内积累会导致组织损伤和器官衰竭。开发用于定性和定量测定 Fe ³⁺ 的有效和更环保的传感系统 对临床、医学和环境问题具有重要意义。这使我们能够考虑是否可以将生物质直接从天然可食用生物质中定制成具有理想特性的纳米点，而无需任何加工。然而，据我们所知，还没有任何此类发光 NBD 被报道过。因此，寻找更多的天然生物质前体以获得具有理想特性和高生物相容性的 NBD 可能朝着更绿色的发光纳米材料和 Fe ³⁺ 迈出一步。 检测。

在此，首次通过超声波提取策略 (UES) 从大豆中证明了发光纳米生物质点 (NBD)。所制备的 NBDs 的光致发光 (PL) 量子产率 (QY) 可达到 16.7%，并且 NBDs 在固态下显示出明亮的发射。细胞毒性试验表明，NBDs具有较高的生物相容性。此外，NBD 已用于 Fe ³⁺ 检测其荧光强度与 Fe ³⁺ 的线性关系 浓度，检测限(LOD)可达2.9 μM。

方法

材料

符合中华人民共和国国家标准（GB1352-2009）的东北大豆品种 ) 购自当地超市，使用前用蒸馏水清洗数次。氯化钙 (CaCl2)、氯化锰 (MnCl2)、氯化铜 (CuCl2)、氯化钴 (CoCl2)、硝酸铅 (Pb (NO3)2) 和硝酸铬 (Cr(NO3)3) 购自阿拉丁有限公司。 （上海，中国）。氯化铁 (FeCl3)、氯化亚铁 (FeCl2)、氯化镉 (CdCl2)、二氯化汞 (HgCl2)、氯化钠 (NaCl) 和氯化锌 (ZnCl2) 购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。所有化学品均为分析纯试剂（纯度> 99.0%），无需进一步纯化即可直接使用。

NBDs 的合成

首先将100粒大豆用酒精和蒸馏水的混合液洗涤3次以去除杂质。然后将大豆放入装有 50 ml 蒸馏水的烧杯中，然后超声 2 小时。在此过程中，溶液的颜色从透明变为深黄色，表明大豆皮被裁剪成纳米尺寸以形成 NBD。然后，将深黄色溶液转移到离心管中，以7000 rpm离心3 分钟两次以去除大颗粒，然后将上清液通过0.22-μM膜过滤以进一步去除大颗粒或团聚颗粒。之后，将溶液置于冰箱中，然后在- 5 ^° 冷冻处理 C 6 小时。然后，将其转移到- 50 ^° 的冻干机中 C 12 h，得到粉末。将冷冻粉末分散到水中形成NBDs以备进一步应用。

特征化

NBD 的 X 射线衍射 (XRD) 图案使用 X' Pert Pro 衍射仪记录，其中 X 射线由 Cu-Kα 源产生。使用 JEM-2010 透射电子显微镜 (TEM) 来表征 NBD 的尺寸和结晶度。 NBD 的荧光光谱是用 F-7000 荧光分光光度计获得的。使用 UH4150 分光光度计获得 NBD 的 UV-Vis 吸收光谱。样品的傅立叶变换红外 (FTIR) 光谱由 Thermo Scientific Nicolet iS10 FTIR 光谱仪记录。样品的X射线光电子能谱(XPS)谱由配备Al-Kα X射线源的Thermo Fisher Scientific ESCALAB 250Xi光谱仪采集。

光致发光量子产率测量

PL QY 使用带积分球的 F-9000 分光光度计进行测试。首先将NBD水溶液稀释到0.1以下的吸收强度。然后，将该水溶液加入荧光比色皿中，置于积分球中，用 370 nm 单色光激发。在430-450 nm范围内收集荧光光谱。同时，在相同条件下也记录了纯水的相同荧光光谱。最后，根据样品和水的PL光谱，使用荧光软件计算PL QY。

细胞毒性测试

NBD 的细胞毒性通过 MTT (3-(4,5)-二甲基噻唑 (-z-y1)-3,5-di-phenytetra-zoliu-mromide) 方法进行评估。细胞在正常 RPMI-1640 中培养，含有 10% 胎牛血清，5% CO2 和 95% 空气，37 ^° C 在加湿培养箱中。对于细胞活力测量，将 HeLa 细胞置于 96 孔板中，然后孵育 72 小时。 Hela细胞与不同浓度的NBDs和CDs孵育72 h后，记录细胞活力。

检测Fe ³⁺

1 ml 不同浓度 Fe ³⁺ 的溶液 在 PL 测量之前，将其加入 1 ml 的 NBD 中，溶液浓度为 3 g/l。将溶液充分混合并在室温下反应 1 分钟，然后记录相关的荧光光谱。 PL测量在370 nm激发下进行。

结果与讨论

形态和化学成分

NBDs 是通过 UES 方法制备的；所有过程都在方案 1 中说明。 NBD 的尺寸和形态通过透射电子显微镜 (TEM) 进行表征，如图 1a 和 b 所示。 TEM 图像显示 NBD 的形状接近球形。 NBD 的直径范围为 1 到 3 nm，平均直径为 2.4 nm，相应的尺寸分布如图 1c 所示。从高分辨率 TEM 图像（图 1b 的插图）中无法观察到 NBD 的晶格条纹，表明 NBD 的无定形性质。高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）的图像和 NBD 的相应元素分布（碳、氮和氧）如图 1d-g 所示。可以看出，NBD 的主要元素是碳、氮和氧。此外，固态 ¹³ NBD 的 C 核磁共振 (NMR) 测量结果如图 1h 所示。信号范围为160-180 ppm，164 ppm和170 ppm处的峰对应于C=O键，表示sp ² 碳原子 [25, 26]。

大豆NBDs制备工艺示意图

NBD 的 TEM 图像 (a ) 和 (b ）。 c NBD 的粒径分布。 HAADF 图像 (d ) 和相应的碳元素分布图 (e ), 氮 (f ) 和氧气 (g )

为了进一步研究 NBD 的结构特征，记录了 X 射线衍射 (XRD) 图案。如图 2a 所示，典型的 XRD 图案显示位于 21.5 ^o 附近的宽峰 以及在 41.0 ^o 附近的肩峰 ，这可归因于无定形碳相 [27]。此外，通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱研究了大豆和 NBD 的特征吸收峰，如图 2（b）所示。 3380 cm ^-1 附近的吸收带 可以归为 O–H/–N–H 的伸缩振动，在 2906 cm ⁻¹ 附近的波段 到 C–H 伸缩振动，以及在 1650 cm ⁻¹ 附近的带 到 C=O 伸缩振动。 1400 cm ⁻¹ 处的峰值 和 1071 cm ⁻¹ 分别对应于 C-H 和 C-O 弯曲振动 [28]。 1750 cm ⁻¹ 附近大豆和NBDs的光谱有明显差异 ，属于大豆脂质中 C=O 键的伸缩振动 [29, 30]。水溶液中的不溶性脂质在浸泡在水中时与样品分离，导致 NBD 的 FTIR 光谱中的键消失。样品中还原的 C=O 键来自蛋白质中的羧基。峰值集中在大约 1543 cm ^-1 也消失了，这可以归因于大豆浸泡过程中的蛋白水解。在比较超声处理前后的所有峰时，可以看到在 NBD 表面形成 –OH、–C=O（酰胺 I）和 –NH 基团 [31]。上述结果表明NBDs表面存在羟基、氨基和羧基，这些官能团对NBDs在水溶液中的亲水性和稳定性起着重要作用。进行 X 射线光电子能谱 (XPS) 光谱以进一步阐明 NBD 的成分，如图 2c 所示。 XPS 光谱在 532.0、401.1 和 286.1 eV 处显示了三个强峰，这可以分别归因于 O 1s、N 1s（图 2d）和 C 1s（图 2e）[32]。这些结果表明NBDs主要含有C（64.33%）、O（32.34%）和N（2.72%），以及少量的P，P元素可能来自大豆的磷脂[33] .在高分辨率 XPS 谱中，C 1s 谱在 287.6、285.8 和 284.6 eV 处显示了三个峰，可以将其归属于 C=O、C–O/C–N 和 C–C/C=C组，如图 2c 所示。 C=O 键来自可溶性羧基 [24]。 C–O/C=N 和 C–C/C=C 来自亚氮碳和 sp ² /sp ³ 碳，分别[34]。图 2d 中显示的 N 1s 光谱证实了 399.5 eV 和 401.6 eV 处的两个主要带，揭示了吡啶 N 和吡咯 N 的存在，这与 FTIR 分析一致。图 2f 中的 O 1s 光谱在 531.4 eV 和 533.0 eV 处有两个峰，分别归因于 C-OH/C-O-C 和 C=O 基团 [9]。

一 NBD的XRD图谱。 b 大豆和 NBD 的 FTIR 光谱。 c NBD 的 XPS 测量光谱。 C 1s 的高分辨率 XPS 光谱 (d ), N 1s (e ) 和 O 1s (f )

基于上述分析，提出了大豆形成 NBD 的可能机制。首先，悬浮在溶液中的一些大颗粒生物质被超声波震荡破碎成纳米尺寸。超声提取处理前后溶液的变化见附加文件 1：图 S1。然后，大豆中的蛋白质在上述过程中被水解成小分子肽和氨基酸，大量的小分子肽链附着在纳米级生物质上，形成高度表面功能化的生物质点。生物质点表面的官能团是荧光的主要贡献者。根据该机制，绿豆也被用作前体，并且还获得了蓝色荧光 NBD，如附加文件 1：图 S2 所示。

光学特性

NBDs 显示出依赖于激发的荧光特性，当激发波长从 320 到 520 nm 变化时，发射峰逐渐红移，表明可以通过改变激发波长来调节 NBDs 的发射，如图 3a 所示。 NBD 水溶液在室内照明下是透明的，在紫外线照射下显示蓝色荧光，如图 3b 的插图所示。 NBD 的光致发光激发 (PLE) 光谱显示在附加文件 1：图 S3 中，并且光激发波长在 360 至 420 nm 的范围内。为了探究 NBDs 的 PL 起源，在室温下记录了不同浓度 NBDs 的 UV-Vis 吸收光谱（NBDs 的浓度从下到上依次为 0.03、0.06、0.13、0.25、0.25、0.50、0.50 、0.75、1.00 和 1.50 g/l)，如图 3b 所示。 NBD 的紫外-可见吸收光谱分别在 270 nm 和 330 nm 处显示出两个清晰的吸收峰。前者可归因于 π-π ^* C-C/C=C 键的转变，而后者向 n-π ^* C=O/N 键的转变 [35, 36]。这些官能团是有助于 NBD 荧光的主要显色基团 [37, 38]。大豆在超声波提取过程中的 PL 光谱显示在附加文件 1：图 S4 中，PL 强度随时间增加，然后达到最大值。图 3c 显示了从 80 到 300 K 测量的 NBD 的 PL 光谱。 NBD 表现出典型的热猝灭行为，其中所有峰的强度随着温度的升高而单调降低。这种 PL 行为可归因于非辐射复合的增加和辐射复合随着温度的升高而减少 [39, 40]。为了评估 NBD 的稳定性，对 NBD 的光稳定性和热稳定性进行了表征，如图 3d 所示。对于光稳定性，测量设置图像显示在附加文件 1：图 S5 中。荧光强度值显示在附加文件 1：图 S6 和 S7 中。 NBDs在紫外灯照射下6 h的发光强度保持在90%以上，表明它们具有良好的光稳定性。对于热稳定性，当温度从 20 到 80 ^° 时，NBDs 的荧光强度几乎没有下降 C，显示出它们的高热稳定性。

一 激发波长从 320 到 520 nm 变化的 NBD 的荧光光谱。 b NBD 的紫外-可见吸收光谱。 c NBDs 在不同温度下的荧光光谱，插图是 NBDs 的荧光强度随温度变化的图。 d NBD粉末在365nm灯照射下不同时间和不同测量温度下的荧光强度和图像

细胞毒性评估

MTT测定用于评估NBD的细胞毒性。 HeLa 细胞与 NBDs 和其他两种水热法合成的 CDs 孵育后的存活率，如图 4 所示。如图 4 所示，当 NBD 溶液加入时，即使NBDs 达到 800 μg/ml。 HeLa细胞与其他两种CDs以800 μg/ml的浓度孵育时，细胞存活率分别为70%和67%。显然，NBDs比化学试剂制备的CDs表现出更好的生物相容性。

HeLa细胞与不同浓度NBDs和CDs孵育72 h后的存活率

NBD 对 Fe ³⁺ 的传感特性

有趣的是，Fe ³⁺ 可以有效地淬灭NBDs的荧光 ，如图5a所示，随着Fe ³⁺ 的增加，NBDs的PL强度显着降低 专注。此外，F0/F 与 Fe ³⁺ 之间可以绘制出良好的线性关系 浓度范围从 0 到 30 μM (R ² =0.99)，其中 F0 和 F 是在不存在和存在 Fe ³⁺ 的情况下，NBDs 在 ex/em 为 370/445 nm 处的 PL 强度 ，如图 5b 所示。淬火效率由 Stern-Volmer 方程拟合：

一 NBDs在不同浓度Fe ^{3存在下的PL光谱 +} . b 作为 Fe ^{3 函数的传感器校准曲线 +} 专注。 c NBD 在不同离子存在下的荧光强度。 d 不同金属离子的NBDs溶液在室内和紫外光照射下的照片

其中 K sv 是 Stern-Volmer 淬灭常数和 [Q ] 是 Fe ³⁺ 专注。线性回归方程为 Y =0.0072X + 0.99479, R ² =0.99。所提出的传感器的检测限 (LOD) 被确定为 2.9 μM，低于 Fe ³⁺ 的最大允许水平 (5.37 μM) 在美国环境保护署 (USEPA) [24] 设立的饮用水中。选择性是化学传感器的另一个关键参数。因此，已经研究了传感器对几种干扰金属离子的荧光响应，包括 Ca ²⁺ , Cd ²⁺ , Co ²⁺ , 铜 ²⁺ , Cr ³⁺ , Fe ³⁺ , Fe ²⁺ , 汞 ²⁺ , Mn ²⁺ , Na ⁺ , Pb ²⁺ , 和 Zn ²⁺ .每个金属离子浓度为 10 ^-2 M 以 3 g/l 的浓度加入到 1 ml 的 NBDs 溶液中。在图 5c 中，可以看出 NBDs 的荧光强度对 Fe ³⁺ 的响应更敏感 比其他金属离子。图5d中的照片是在室内和紫外线照射下具有各种离子的NBD图像，金属离子浓度为100 μM。显然，NBDs 在 Fe ³⁺ 存在下淬灭 ，表示它们可以用于视觉检测。

淬火机制

Fe ³⁺ 存在时NBDs的淬火机制 基于 NBD 的 UV-Vis 吸收光谱和荧光寿命进行了讨论。从附加文件 1 中显示的 UV-Vis 吸收光谱：图 S8，随着 Fe ³⁺ 的引入，270 nm 和 340 nm 处的吸收峰没有变化 , 表明 Fe ³⁺ 不影响 NBD 的结构 [41]。除了 UV-Vis 吸收光谱外，Fe ³⁺ 还研究了 NBD 的使用寿命。在图 6a 中，加入 Fe ³⁺ 后荧光寿命变短 ，这可能涉及 NBD 的部分电子转移到 d Fe ³⁺ 的轨道 ，从而减少 NBD 的辐射复合 [42]。 Fe ³⁺ 引起NBDs的荧光猝灭机制 如图 6b 所示。 Fe ³⁺ 存在时NBDs的灵敏荧光猝灭效应 可能源于 Fe ³⁺ 之间的强相互作用 和 NBD 的表面基团。 Fe ³⁺ 与 NBD 表面的氨基和羧基具有更强的结合亲和力和更快的螯合动力学。 Fe ³⁺ 之间的特殊配位 离子和NBDs的酚羟基/胺基已被广泛用于检测Fe ³⁺ 传统有机化学中的离子或有色反应 [43, 44]。此外，Fe ³⁺ 的氧化还原电位 /Fe ²⁺ (Ф =0.77) 位于 NBD 的最低未占分子轨道 (LUMO) 和最高占分子轨道 (HOMO) 之间，导致光诱导电子从 LUMO 转移到 Fe ³⁺ [45]。这些结果表明NBDs对Fe ³⁺ 高度敏感 超过其他金属离子。

一 Fe ^{3存在和不存在时NCDs的荧光衰减痕迹 +} 在 370 nm 激发和 445 nm 发射下。 b Fe ^{3存在下NBDs可能的荧光猝灭机制示意图 +} 离子

结论

总之，已经通过无加热 UES 方法从大豆中制备了发光 NBD。 NBDs显示出明亮的蓝色荧光，PL QY为16.7%，得益于可食用生物质和免加热合成过程，即使NBDs浓度达到800 μg/ml，细胞活力仍保持100%。此外，NBDs 的荧光对 Fe ³⁺ 表现出特殊的敏感性。 ，LOD可达2.9 μM。低毒性和高检测限表明NBDs有望在生物和环境系统中找到潜在的应用。

缩写

FTIR：

傅里叶变换红外

HAADF-STEM：

高角度环形暗场扫描透射电子显微镜

细节层次：

检测限

NBD：

纳米生物质点

核磁共振：

核磁共振

PL：

光致发光

量子点：

量子点

QY：

量子产率

TEM：

透射电子显微镜

UES：

超声波提取策略

美国环保署：

美国环境保护署

XPS：

X射线光电子能谱

XRD：

X射线衍射