用于光热疗法的聚多巴胺碳点的简便一锅法合成

背景

作为低维碳材料的一员，浩瀚的混合SP ² 和 SP ³ 碳点 (CD) 中的原子和 π 电子显着增加了光敏系统的缺陷和杂原子，从而触发吸收的光能转化为热量或释放受激光子。 CDs因其荧光可调、光热转换特性和优异的生物相容性而被广泛应用于生物成像、光热疗法（PTT）和生物传感器。之前报道的通过水热处理和交联反应合成的载药磁荧光碳量子点（MCQDs），通过构建高效的化学光癌症治疗平台，实现了PTT和光动力治疗（PDT）的结合[1]。迄今为止，自 2004 年在电弧放电单壁碳纳米管 (SWCNTs) 的纯化过程中首次发现以来，已经探索了广泛的方法来增强 CDs 的荧光强度 [2]，尽管合成路线可以实现一定程度的氧化一般复杂。自上而下和自下而上的处理是合成 CDs 的两种常见途径，包括激光烧蚀 [3, 4]、氧化酸处理 [5, 6]、水热处理 [7, 8]、微波辅助热解 [9, 10,11]、电化学氧化[12, 13]、超声辐照[14]和等离子体处理[15]。

研究表明，N 原子的掺杂对于 CD 的荧光增强具有重要意义 [16,17,18]。刘等人。使用聚乙烯亚胺 (PEI) 提供 N 原子，通过一步微波辅助 (700 W) 甘油和支化 PEI 热解来制造 PEI 功能化的 CD；该系统的量子产率 (QY) 高达 15.3%，可用于细胞成像和基因传递 [19]。周等人。报道了通过在 180°C 下对核苷酸腺苷-5'-三磷酸 (ATP) 进行水热处理 10 小时，开发了用于生物成像的磷和氮共掺杂碳点（N-P 掺杂 CD）。通常，ATP 是掺杂 N 和 P 原子以增强系统表面缺陷的唯一材料来源，从而导致 N-P 掺杂 CD 的 QY 增加（计算为 9.8%）[20]。此外，据报道，酚类化合物可以作为碳点生长的催化种子。李等人。发现加入微量阿魏酸后碳点显着增加[21]。

聚多巴胺 (PDA) 是一种由多巴胺 (DA) 单体聚合而成的类黑色素聚合物，自首次作为粘合剂表面改性剂被研究以来，已广泛应用于各种材料的表面改性 [22]。众所周知，PDA中含有大量的富氮和酚羟基官能团，如儿茶酚胺，使其成为一种潜在的优良CDs钝化剂和催化剂。

受此启发，我们报告了一种简便高效的单锅微波辅助热解途径，可在 5 分钟内合成 PDA 功能化 CD。动态光散射 (DLS)、傅里叶变换红外光谱 (FT-IR)、透射电子显微镜 (TEM)、紫外和可见光谱 (UV-Vis) 和荧光光谱用于定义聚多巴胺碳点 (CD- PDA) 及其可调光致发光 (PL)。用标准的 3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基四唑溴化物 (MTT) 法测定 CD-PDA 处理和不使用 NIR 照射的 HeLa 细胞的相对细胞活力。

结果与讨论

CD-PDA的合成与表征

在这项研究中，我们通过甘油和 PDA 的一锅微波辅助热解合成了聚多巴胺 (PDA) 功能化碳点 (CD-PDA)。将通过相同的微波辅助热解方法制造的碳点（CD）不添加 PDA 设置为对照组。 CD-PDA 合成过程的示意图在方案 1 中进行了概念性描述。CD-PDA 的产率是 CDs 的近 1.5 倍，这是由于由掌上电脑[21]。

CD-PDA合成过程示意图

动态光散射 (DLS) 曲线揭示了 CD-PDA 的粒径和 zeta 电位。 CD-PDA 的流体动力学粒径为 51.5 ± 19.5 nm（图 1a 的插图），zeta 电位确定为 - 27.5 ± 0.4 mV，表明纳米点表面带有负电荷基团，这进一步证明了表面PDA 修改。分散在去离子水中的 CD 的流体动力学粒径为 5.5 ± 2.5 nm（图 1b 的插图）。透射电子显微镜 (TEM) 图像表征了单分散球形和尺寸分布均匀的纳米粒子（图 1a、b）； CD-PDA 的直径为 ~ 25 nm（图 1c），CD 的直径（图 1d）在 ~ 5 nm 处测量。 PDA表面改性后，CD-PDA的直径比CDs增长了20 nm左右。

CD-PDA 和 CD 的形态学、FT-IR 光谱和 UV-Vis 光谱。 一 CD-PDA 的 TEM 图像（比例尺 100 nm，插图：由 DLS 确定的尺寸分布）。 b CD 的 TEM 图像（比例尺 100 nm，插图：由 DLS 确定的尺寸分布）。 c 单个 CD-PDA 的放大图像（比例尺 50 纳米）。 d 单个 CD 的放大图像（比例尺 20 纳米）。 e CD-PDA、CDs 和 PDA 的 FT-IR 光谱。 f CD-PDA、CDs 和 PDA 的 UV-Vis 光谱（插图：600 到 900 nm 的吸光度）

碳点上PDA的钝化通过FT-IR光谱记录。在这里，PDA 是通过 20 毫克 DA 盐酸盐在 10 毫升 Tris 缓冲液（pH 8.5，10 mM）中在室温下聚合 12 小时合成的，然后在 23,294 rcf 下离心。如图 1e 中观察到的 CD-PDA、CDs 和 PDA 特征峰的光谱信息，3400 cm ^-1 和 1600 厘米 ⁻¹ 提出了 PDA 的儿茶酚 -OH 基团和芳环，它们也存在于 CD-PDA 中 [23, 24]。出现在 1642 cm ⁻¹ 的新峰 , 1588 厘米 ⁻¹ , 和 1640 cm ⁻¹ 指的是 C=O、N–H 和 C–N，而峰值在 3400 cm ^-1 表明体系中存在-OH和N-H，这进一步说明了PDA在CDs上的表面改性。微波辅助氧化过程中碳点中出现的 N-H、C=O 和 C-N 证明了纳米点表面钝化的机制：在 5 分钟的微波辅助氧化过程中，多巴胺和体系脱水形成纳米点的核心，之后是碳点的生长。

具有相同浓度的 CD-PDA、CD 和 PDA 的 UV-Vis 吸收光谱如图 1f 所示（图 1f 中样品插图的浓度，12.5 μg/mL）。作为系统的表面钝化剂，PDA 表现出 200 至 900 nm 的广谱吸收，尤其是在近红外区域，这对于 CD-PDA 优异的光热转换性能至关重要。在 220 nm 和 280 nm 处的吸收代表了苯环作为共轭系统的强 π-堆积之间的电子跃迁，验证了 PDA 的修饰。特别是，在 280 nm 处吸收的明显减少表明在 PDA 钝化后共轭体系中强 π 堆积相互作用之间存在空间势垒 [25]，而 CD-PDA 的紫外-可见吸收光谱显示出在周围的特征峰274 纳米和 370 纳米，CD 的测量在 260 纳米和 330 纳米。从 330 nm 到 370 nm 的红移归因于从 PDA 引入酰胺基原，其特征还在于甘油和 PDA 的螯合 [26, 27]。插图是 CD-PDA、CDs 和 PDA 在 600 到 900 nm 波长范围内的吸光度。

CD-PDA 的光致发光

如前所述，碳点的表面改性可以在很大程度上影响其光子转换过程，从而导致荧光光谱的巨大多样性 [28, 29]。在我们的研究中，CD-PDA 的发射峰从 450 nm 红移到 500 nm，激发波长从 350 nm 变为 420 nm（图 2a）。因此，我们通过将液滴浸在载玻片上来观察红色、蓝色和绿色荧光显微镜图像，进一步阐明了 CD-PDA 荧光的巨大多样性（图 2a 的插图）。此外，我们在紫外光照射（365 nm）下检测到 CD-PDA、CD 和去离子水的宏观图像，证实 CD-PDA 的荧光强度比 CD 强得多（图 2b）。图2c进一步说明了PDA表面改性后荧光强度的增强； CD-PDA 的量子产率 (QY) 几乎是 CDs 的三倍（选择硫酸奎宁作为标准样品 [19]），验证了从 PDA 中掺杂 N 原子的效果。我们测试了CD-PDA荧光强度的稳定性；在2100-s照射（365 nm）下没有表现出明显的变化，因此表现出稳定的光致发光特性（图2d）。

CD-PDA 和 CD 的光学特性。 一 CD-PDA 的光致发光光谱（激发波长范围为 350 至 420 nm，增量为 10，插图：CD-PDA 的荧光显微镜图像）。 b 从左到右：在紫外光照射 (365 nm) 下的 CD、CD-PDA 和去离子水。 c CD-PDA、CDs 和去离子水的光致发光光谱。 d CD-PDA荧光强度稳定性曲线

为了进一步研究PDA对CD-PDA荧光强度增强的影响，我们首先测量了Tris缓冲液中多巴胺聚合时间的荧光强度。图 3a 中的光致发光梯度说明含有多巴胺的 CD-PDA 在 Tris 缓冲液中聚合 2 小时表现出最高的荧光强度，表明多巴胺预聚合程度的影响。我们进一步研究了在 Tris 缓冲液（3、5、7 和 9 mg/mL）中具有各种原始 PDA 浓度的 CD-PDA 的荧光强度。随着原始DA浓度从3到9 mg/mL变化，CD-PDA的荧光呈现先增加后减小的趋势（图3b）。

CD-PDA 的光致发光光谱。 一 在 Tris 缓冲液中不同多巴胺聚合持续时间的 CD-PDA 的荧光强度。 b 具有各种原始多巴胺浓度的 CD-PDA 的荧光强度。 c 微波辅助热解前不同pH值的CD-PDA荧光强度。 d 微波辅助热解后不同pH值的CD-PDA荧光强度

此外，我们研究了不同初始 pH 值下 CD-PDA 的荧光强度；随着 Tris 缓冲液的 pH 从 5 增加到 11，荧光强度降低（图 3c）。图 3d 展示了微波辅助氧化后 pH 值的影响。微波辅助氧化后体系的pH介导为5~11，比较了CD-PDA的荧光强度；酸性介质（pH 5.0）导致荧光更强，这也表明CD-PDA在酸性肿瘤微环境中的荧光更强。

CD-PDA 的光热性能和细胞毒性

光热效率的测量

为了区分 CD-PDA 和 CD 的光热转换效率的分析，我们定量评估了辐照下随时间变化的温度增量； PDA被选为额外的对照组。在 10 分钟照射下（808 纳米，2 W/cm ² )，在 200 μg/mL 时，CD-PDA 的温度增量为 27°C，而 PDA 的温度增量约为 30°C。同时，在 10 分钟内照射下 CDs (200 μg/mL) 的温度增量约为 7.5°C，去离子水的温度增量不超过 5°C（图 4a）。此外，我们在 2 W/cm ² 的功率密度下测量了不同浓度的 CD-PDA 温度随时间的升高 NIR 激光照射 10 分钟。总体而言，温度的升高随着 CD-PDA 浓度的增加而增加，并且随着 CD-PDA 浓度从 25 μg/mL 增加到 200 μg/mL，温度升高得更快（图 4b）。因此，我们绘制了不同浓度CD-PDA的温度增量曲线，其中CD-PDA在200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL时的温度增量约为分别为 27°C、18°C、13°C 和 10°C（图 4d）。通常，为了研究在 Tris 缓冲液中不同初始浓度的 DA 对 CD-PDA 光热转换效率的影响，我们测量了 CD-PDA (200 μg/mL) 与 Tris 中不同初始浓度的 DA 的温度变化缓冲区（图 4c）。随着 DA 的浓度从 3 毫克/毫升提高到 9 毫克/毫升，温度升高。当 DA 的原始浓度为 9 mg/mL 时，温度升高 27 °C，而当 DA 的原始浓度为 3 mg/mL 时，温度升高仅为 10 °C。 CD-PDA 的自然冷却曲线如图 4e 所示（200 μg/mL，808 nm，2 W/cm ² ，20 分钟），从冷却期计算出的 - lnθ 的更稀薄数据在图 4f 中观察到。 CD-PDA的光热转换效率为35%，高于之前报道的Au纳米棒（文献值为22% [30]）。

CD-PDA和CD的光热转换特性。 一 CD-PDA、CDs、PDA和去离子水在2W/cm功率密度下的光热加热曲线 ² 近红外激光照射 10 分钟。 b 10 分钟内不同浓度的 CD-PDA 的光热加热曲线。 c CD-PDA (200 μg/mL) 在 Tris 缓冲液中具有各种原始 DA 浓度的光热加热曲线。 d 不同浓度下 CD-PDA 的温度增量。 e CD-PDA 的冷却曲线（功率密度为 2 W/cm ² 在前 10 分钟内进行 NIR 照射并自然冷却至室温）。 f 根据CD-PDA冷却曲线计算出的精益时间数据与− lnθ的对比

体外细胞活力

CD-PDA、CD 和 PDA 的细胞毒性通过标准 MTT 测定进行分析。为了评估 CD-PDA、CD 和 PDA 之间细胞活力的差异，将 HeLa 细胞与每组中相同浓度的这些纳米颗粒一起孵育。 MTT 结果（图 5a）显示 HeLa 细胞的细胞活力与 CD-PDA、CD 和 PDA 呈剂量依赖性关系。据报道，富含醌的 PDA 修饰表面在细胞增殖活性中具有活力 [31]。在我们的研究中值得注意的是，由于 PDA 的表面修饰，CD-PDA 即使在 50 μg/mL 的浓度下也能明显促进 HeLa 细胞的细胞活力，并且细胞活力在 100 μg/mL 时没有显着抑制，与PDA的结果基本相同，而与CDs一起孵育的HeLa细胞的活力在100 μg/mL和200 μg/mL时分别降低到80%和70%。

对 HeLa 细胞的体外细胞毒性。 一 HeLa 细胞与不同浓度的 CD-PDA、CD 和 PDA 孵育 24 小时的体外细胞活力。 b HeLa 细胞与不同浓度的 CD-PDA、CD 和 PDA 在辐照（808 nm，2 W/cm ² ， 5分钟;均值 ± SD, n =6)。 *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001

在 HeLa 细胞上进一步评估标准 MTT 测定以确定 CD-PDA、CD 和 PDA 的光热杀伤效率，HeLa 细胞与每组中相同浓度的这些纳米颗粒一起孵育。在照射下 (808 nm, 2 W/cm ² ，5 分钟），MTT 测定（图 5b）显示 CD-PDA、CD 和 PDA 的光热杀伤功效随其浓度而增强。总体而言，与 CD-PDA 一起孵育的 HeLa 细胞的细胞活力在 200 μg/mL 时降低至 30%，表明该系统的光热杀伤功效。同时，值得注意的是，CD-PDA和PDA之间的细胞活力差异随着浓度从25增加到200μg/mL而逐渐减小，这是由于CD-PDA在NIR照射下随着其浓度的提高而出现明显的温度升高（图 4b、4d）。此外，在 NIR 照射下与 CD 孵育的 HeLa 细胞的细胞活力在 200 μg/mL 时为 68%，由于其在近红外区域的光吸收较弱，因此与未使用 NIR 激光的相同浓度下的细胞活力相比没有显着变化（图 1e）。

结论

在这项工作中，我们报告了在 5 分钟内通过一锅微波辅助热解合成荧光聚多巴胺 (PDA) 钝化碳点 (CD-PDA)，大大简化了反应过程，由于掺杂了PDA 中的 N 原子，并且由于 PDA 提供的酚基增强了碳点形成的成核位点，从而提高了其产率。 PDA钝化后，CD-PDA的产量是CDs的近1.5倍； CD-PDA 的量子产率为 ~ 5%，是原始 CD 的三倍。该系统的光热转换效率为 35%，高于之前报道的金纳米棒 (22%)。在体外试验中，CD-PDA表现出优异的生物相容性和PTT性能；当浓度达到 50 μg/mL 时，它甚至可以促进 HeLa 细胞的细胞活力。在照射下，HeLa 细胞的细胞活力降低到 30%。更重要的是，PDA的钝化使系统兼容通过迈克尔加成或席夫碱反应进一步修饰。

方法/实验

材料

除非另有说明，所有化学试剂均为分析纯，无需进一步纯化即可使用。多巴胺盐酸盐（DA）购自Sigma-Aldrich（美国）；硫酸奎宁（98%，适合荧光）购自 Fluka（美国）；甘油（> 99%）、Tris、二甲基亚砜（DMSO，> 99.8%）和透析膜（MWCO 1000 Da）由 Sangon Biotech（中国上海）提供。 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)、胰蛋白酶和青霉素-链霉素溶液购自 Beyotime Biotechnology（中国上海）。 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 购自 Hyclone (USA)。胎牛血清 (FBS) 购自 Biological Industries (Israel)。 HeLa细胞由美国典型培养物保藏中心（ATCC）提供。

检测和表征

通过在 Nicolet 380 光谱仪（FT-IR，Thermo Nicollet，Instruments，Ltd.，美国）上进行的傅里叶变换红外光谱确认元素组成。 UV-Vis 光谱由 Perkin Elmer Lambda 750 UV-vis 近红外分光光度计 (UV-vis-NIR, Perkin-Elmer, Norwalk, CT) 表征。光致发光 (PL) 光谱由 Infinite 200PRO 荧光计 (Tecan, Instruments, Ltd., Switzerland) 测量。直径分布和 zeta 电位由 Mastersizer2000 (DLS, Nano-ZS, Malvern, Instruments, Ltd., UK) 进行。形态和直径由透射电子显微镜（TEM，Tecnai G，Spirit，FEI，香港）表示。家用微波炉作为微波源（500 W）和反应釜（格兰仕仪器有限公司，中国）。

准备 CD-PDA 和 CD

首先，将 50 毫克多巴胺盐酸盐完全溶解在 10 毫升 Tris 缓冲液（10 mM，pH 8.5）中，并在室温下在磁力搅拌下自聚合 2 小时。然后，在 5 分钟微波辅助 (500 W) 氧化和后续纯化步骤之前，通过直接混合上述 6 mL 预聚合 PDA 溶液和 20 mL 甘油 (> 99%) 来合成 CD-PDA。虽然 CD 是通过 5 分钟微波辅助 (500 W) 氧化 20 mL 甘油制备的，但它被设置为对照组。此后，通过对去离子水透析 48 小时（MWCO 1000 Da）纯化 CD-PDA 和 CD，最后通过离心（23,294 rcf，10 分钟）和冻干收集。

荧光量子产率的测量

CD-PDA 的量子产率 (QY) 通过之前报道的比色法测量 [19]，选择硫酸奎宁（在 0.1 M H2SO4 中）作为标准样品（文献 QY 54%），光致发光 (PL) 发射为由 Infinite 200PRO 荧光计测量。总体而言，CD-PDA 和奎宁的荧光强度比值代表 CD-PDA 的 QY（激发波长 350 nm），条件是它们具有相同的光密度（OD）值，小于 0.02（波长 350 nm）。积分荧光强度是 PL 曲线下方的区域，波长范围为 380 至 700 nm。基本上，溶解在 0.1 M H2SO4 中的硫酸奎宁作为标准样品（OD 值 0.02，波长 350 nm）； CD-PDA 分散在去离子水中，我们将其 OD 值调节为 0.02，以排除光吸收的影响。然后，我们测量了 CD-PDA 和奎宁的荧光强度以计算 PL 曲线的面积。 CDs被设置为对照组。 QY的绝对值按以下公式计算：

其中，F 是 QY，Grad 是 PL 曲线的梯度，ST 和 X 分别代表标准和测试组，R 是溶剂的折射率。

光热性能测量

CD-PDA、CD 和 PDA 均分散在去离子水中，它们的浓度均介导为 200 μg/mL。然后，我们分别在标准石英池中加入上述 1 mL 溶液，并将激光二极管光源（STL 808CFS-10W，中国）设置在液面上方约 1 cm 处，以完全覆盖溶液。我们在 2 W/cm ² 的功率密度下每分钟测量 CD-PDA 和 CD 的温度变化 近红外激光照射； PDA和去离子水均设为对照组。然后，我们结束照射并记录CD-PDA自然冷却至室温时的温度变化以绘制冷却曲线。 CD-PDA的光热转换效率根据[30]之前报道的公式计算。

细胞培养

HeLa 细胞在含有高葡萄糖和 10% 胎牛血清 (FBS)、青霉素 (100 U/mL) 和链霉素 (100 μg/mL) 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，HyClone）中在 37°C 的温度下培养和 5% CO2 加湿气氛。我们每天更换一次培养基。

细胞活力测定

CD-PDA 的细胞毒性通过标准 MTT 测定进行测量。 HeLa细胞接种于96孔板中，密度为2 × 10 ⁴ 细胞每孔并在 37°C、5% CO2 加湿气氛下培养 24 小时。然后，我们用新鲜的 PBS 清洗 HeLa 细胞 3 次，然后将分散在 DMEM 中的 CD-PDA 以不同的重量比（10、25、50 和 100 μg/mL）加入每个孔中。之后，将其在 37°C、5% CO2 加湿的气氛中再培养 24 小时。将培养基替换为含有 20 μL MTT（5 mg/mL PBS）的 200 μL DMEM，并在 37°C、5% CO2 加湿气氛下再孵育 4 小时。最后，我们彻底去除培养基并在每个孔中加入 200 μL DMSO，再摇晃 15 分钟。在 490 nm 处测量每个孔的吸光度。未处理的 HeLa 细胞（在 DMEM 中培养）设置为对照组。根据公式 Abssample/Abscontrol × 100% 计算 HeLa 细胞的相对细胞活力。其中，Abssample为CD-PDA处理的HeLa细胞的吸光度，Abscontrol为未处理的HeLa细胞的吸光度。

缩写

CD-PDA：

聚多巴胺碳点

CD：

碳点

DA：

多巴胺

DLS：

动态光散射

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

DMSO：

二甲亚砜

FBS：

胎牛血清

FT-IR：

傅里叶变换红外光谱

MTT：

3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-二苯基溴化四唑

近红外：

近红外区

OD：

光密度

PDA：

聚多巴胺

PEI：

聚乙烯亚胺

PL：

光致发光

PTT：

光热疗法

QY：

量子产率

SWCNTs：

单壁碳纳米管

TEM：

透射电子显微镜

紫外可见光：

紫外可见光谱