用于生物成像和增强细胞内药物递送的绿色荧光碳点的经济高效制备

介绍

多柔比星 (DOX) 是一种蒽环类化疗药物，广泛用于治疗多种癌症，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、甲状腺癌、多发性骨髓瘤、肉瘤和儿科癌症。 DOX 的抗癌作用机制被认为是干扰 DNA 合成和修复过程。因此，在癌症治疗过程中，DOX 需要跨细胞膜运输到细胞核以干扰 DNA 合成。然而，游离DOX不易接近细胞核，在体内会引起严重的心脏毒性，阻碍了其在癌症治疗中的应用[1, 2]。

近年来，多功能纳米载体如脂质体、胶束、纳米乳剂、聚合物纳米颗粒和其他纳米颗粒因其在抗癌药物递送方面的重要性而引起了极大的关注[3]。其中，作为一种新型的量子点家族，碳量子点（CD）自2004年被发现以来就引起了全世界的极大兴趣[4]。特别是荧光CDs已成为细胞成像的首选 ² 由于其具有准零重量和尺寸（<10 nm）、高光稳定性、宽且连续的激发光谱、可调波长、满足生物相容性等优异特性，可用于光催化、药物输送、污染物和重金属离子检测以及光电设备、低毒性和优异的荧光性能 [5,6,7,8,9,10,11,12,13,14]。例如，杨等人。已经成功地将 DOX 与 CDs 偶联以增强抗癌治疗，这意味着 CDs 在核靶向药物递送方面具有重要意义 [1]。

以前，已经提出了各种技术来制备 CD，包括多种生物质材料、碳化、钝化和表面功能化 [14, 15]。详细来说，它可以分为两种主要方法。一种是“自上而下”的方法，电弧放电、激光烧蚀法、电化学蚀刻和氧化法，是指将大规模的碳结构分解成碳纳米颗粒[16,17,18,19,20]。另一种方法是“自下而上”的方法，从分子前体合成碳点，主要包括水热法、超声波法和波辅助合成[21,22,23,24]。徐等人。通过电弧放电、氧化、萃取和凝胶电泳获得碳点。明等人。通过电解获得碳点。杨等人。优化原始水热法合成具有不同荧光的碳点[21]。然而，这些方法由于其复杂的合成过程、耗时的程序、严格的制造要求和昂贵的原材料而受到限制[25]。此外，使用有机溶剂作为反应的钝化剂会增加 CDs 的毒性 [26]。此外，大多数报道的CDs在紫外光激发下发出蓝色荧光，由于强烈的组织自发荧光干扰，严重阻碍了它们在生物医学成像领域的潜力。

在此，我们通过绿色且高效的一步控制柠檬酸钠二水合物和尿素的热解合成了绿色荧光 CD。 DOX通过疏水相互作用和静电相互作用以及π非共价结合在制备的CDs表面用于药物递送 -π 堆叠交互 [27,28,29]。通过透射电子显微镜 (TEM) 和 X 射线衍射分析研究了 CD 的形态和结构。通过紫外可见分光光度计和光致发光 (PL) 发射光谱评估光学特性。缓释药物采用透析法进行。通过荧光显微镜研究了 DOX-CDs 的细胞摄取和细胞内分布。 DOX-CDs 的抗癌作用通过标准 MTS 测定进行评估。 CD 的体内成像是在 Balb/c 裸鼠上进行的。最后，通过组织学分析研究了 CD 的长期毒性。因此，制备的CDs有望成为体内成像和靶向给药的潜在药物。

材料和方法

材料

二水柠檬酸钠、尿素、L-精氨酸、乙二胺丙酮、硫酸奎宁、磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、乙酸、磷酸氢二钠和多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。 MTS 细胞增殖比色分析试剂盒 (MTS)、Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM/高糖）、青霉素-链霉素溶液和胰蛋白酶-EDTA 溶液购自 Beyotime Biotechnology Co. Ltd（中国上海）。胎牛血清（FBS）购自天航生物科技有限公司（中国杭州）。 HO-8910 卵巢癌细胞和 EA.hy926 人脐静脉内皮细胞获自中国科学院上海营养与健康研究所（中国上海）。盐酸多柔比星 (DOX) 购自 Sigma-Aldrich（中国上海）。透析袋（MWCO =1000 Da）购自SpectrumLabs（美国加利福尼亚州洛杉矶）。

CD 和 DOX-CD 的合成

简而言之，首先将脱水柠檬酸钠 (0.2 mmol) 和尿素 (5 mmol) 溶解在 1 mL 去离子水中。然后，将混合物转移到玻璃容器中并在 200°C 下碳化 1 h。然后加入1 mL去离子水和丙酮（v/v，1/3），10000 rpm离心10 分钟3次。

DOX 通过非共价相互作用结合在 CD 上。简而言之，将 DOX·HCl (0.5 mg) 加入到 5 mL CDs (5 mg/mL) 中，然后在黑暗中搅拌 48 小时。将所得溶液在透析袋 (MWCO =1000 Da) 中对去离子水透析 24 h 以获得 DOX-CD。最后，将DOX-CDs冷冻干燥并在4°C下储存。

CD 和 DOX-CD 的特征

CD的尺寸形态通过透射电子显微镜（TEM，FEI Tecnai G2 Spirit）表征。 PL 发射测量是在 LS55 荧光分光光度计（PerkinElmer，W​​altham，MA，USA）上进行的。量子产率 (QY ) 的 CDs 是通过使用硫酸奎宁的 H2SO4 溶液作为参考来确定的。通过 Bruker Tensor27 傅立叶变换红外分光光度计（Pike Corporation，Madison，Wisconsin）观察晶体结构。使用 ESCALAB250Xi 光谱仪（Thermo，美国）进行 X 射线光电子能谱（XPS）。 Zeta 电位使用 Zeta 电位计 (Malvern Panalytical, Malvern, UK) 测量。

体外药物释放研究

使用透析袋研究了 DOX-CD 中 DOX 的体外药物释放。简而言之，将 DOX-CD 装入透析袋并分别浸入 PBS（pH 7.4 和 5.0）中，然后置于振荡培养箱（37 °C，100 rpm）中。在预定时间，取出 0.5 ml 样品并更换为相同体积的 PBS。通过590 nm处的荧光强度记录释放的DOX。

体外细胞毒性试验

DOX-CDs 的细胞毒性通过 MTS 测定法对 HO-8910 卵巢癌细胞和 EA.hy926 脐静脉内皮细胞进行测定 [30, 31]。简而言之，将细胞以 0.5 × 10 ⁵ 的浓度接种于 96 孔板中。 细胞/mL，保持 24 h 以允许细胞附着。然后，将不同浓度的 DOX-CD 添加到每个孔中。培养24 h后，吸出培养基，每孔加入90 μL培养基和10 μL MTS。 4 小时后，使用酶标仪（BioTek Epoch，Service Card）测量490 nm处的吸光度。细胞活力表示为存活细胞的百分比，并报告为三次测量的平均值。

体外细胞成像研究

HO-8910卵巢癌细胞接种于6孔板，37℃孵育24 h进行细胞附着。然后，将细胞与 DOX-CD 一起孵育以允许细胞摄取。孵育4 小时后，除去培养基，用冷PBS洗涤细胞三次，并用4%多聚甲醛固定10 分钟。最后，通过荧光显微镜（Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, German）观察细胞的形态和荧光分布。

体内成像

动物实验经徐州医科大学动物管理委员会批准[32]。 Balb/c 裸鼠用于评估 CD 在荧光成像中的潜力。简言之，Balb/c裸鼠腹腔注射2%戊巴比妥麻醉后，在注射部位皮下注射CDs水溶液（50 μL，6 mg/mL）。此外，还通过尾静脉注射 CDs (5 mg/kg) 研究了 CDs 在小鼠体内的生物分布。收集不同器官（心脏、肾脏、脾脏、肝脏、膀胱）用于不同时间点的荧光评估。动物荧光成像在Tanon-5200Multi Gel成像系统上进行，所有荧光图像的曝光时间为1.0 s。

体内毒性研究

昆明小鼠（雌性，7 周）被用来研究CDs的体内长期毒性。昆明小鼠随机分为2组：CD组和对照组。小鼠通过尾静脉注射PBS和CDs（6 mg/kg）。然后，在注射7天和21天后收集包括心、肺、肾、肝和脾在内的主要器官。此后，将器官用 4% 多聚甲醛固定，切片，并用苏木精和伊红 (H&E) 染色。最后在光学显微镜（Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, German）下观察组织切片。

结果与讨论

CD 和 DOX-CD 的特征

使用脱水柠檬酸钠和尿素（脱水柠檬酸钠/尿素 =1/25）在 200 °C 下通过一步策略制备 CD。 DOX 共价结合在制备的 CD 表面用于药物递送（方案 ​​1）。如 TEM 图像（图 1a）所示，CD 表现出均匀的球形形态，平均直径为 2.75 nm，尺寸分布相对较窄。此外，通过高分辨率TEM图像可以观察到CDs的晶体结构（图1a插图），表明结晶良好，具有明显的晶格条纹。

CD的制备示意图（a ) 和 DOX-CD (b )

CD 的特征。 一 CD 的 TEM 图像（插图，高分辨率 TEM 图像）。 b CD 的大小分布。 c DOX、CD 和 DOX-CD 的紫外-可见吸收和插图显示了自然光和紫外光下的 CD。 d CDs和e的FTIR光谱 激发波长从 340 nm 到 440 nm 的 CD 的 PL 发射，增量为 20 nm。 f CD的XPS光谱

CDs的化学结构通过FTIR光谱表征。如图1d所示，3499 cm ^-1 处的尖峰 和 1729 cm ⁻¹ 分别分配给 –OH 和 –COOH，而那些在 780 cm ^-1 和 1372 cm ⁻¹ 可以归因于 N-H。可以得出结论，碳点表面同时存在羧基和氨基作为官能团，修饰了具有特定功能的生物大分子，为碳点的进一步应用研究提供了可能。

此外，使用紫外-可见光吸收和 PL 光谱研究了 CD 的光学性质。如图 1c 所示，CDs 在 410 nm 处有一个吸收峰，而 DOX 在 500 nm 处有一个吸收峰。然而，DOX-CDs 分别在 410 nm 和 500 nm 处保持了 CDs 和 DOX 的吸收峰，表明 DOX 与 CDs 成功结合。此外，如图1c的插图所示，DOX-CDs水溶液在自然光下呈淡黄色透明，在紫外线激发下坚果变成亮绿色。此外，以硫酸奎宁为参照物计算出的荧光量子产率为93% (QY =54%）。由于 CD 在 340 到 440 nm 的波长处被激发，PL 峰几乎没有显示偏移，表明 CD 的发射特性与激发无关。 CD的最大激发波长和PL峰分别为400和525 nm。与激发无关的PL行为可能是由于CDs的均匀表面状态[33]。

此外，CD 的元素组成由 XPS 确定。如图 1f 所示，XPS 光谱已经确定 CDs 主要由碳（C ), 氮 (N ) 和氧气 (O )，对应的原子比分别为 78.39%、7.52% 和 14.1%。 C的三个典型峰 1S，N 1S 和 O 1S 可以分别在 284.8、399.5 和 532.6 eV 处观察到。具体来说，C 1S 谱在 284.8、286.7 和 288.3 eV 处显示了 3 个峰，分别代表 C-C、C-N、C-O 或 C=O 键的存在（图 S1A）。 N 的高分辨率光谱 1S 显示在 399.5 eV 处有一个峰，该峰归属于 C-N。此外，O 1s光谱也分别证实了C=O和C-O键在531.9和532.6 eV处的存在（图S1B）。

CD 的荧光强度在 4 °C 和室温下均保持极好的稳定性（图 S2A）。 4 °C 下的荧光强度在 2 周内的降低小于 10% 可以忽略不计。因此，该碳点具有长期稳定性，有望用作生物医学显像剂。

图 S2B 说明 CD 的 PL 强度在高 (> 10) 或低 (<3) pH 值的水溶液中降低。尽管如此，PL 强度在 pH 3-10 的水溶液中是稳定的。用于生物标记和生物成像的制备的 CD 需要与细胞共同孵育，其中 pH 条件在中性 (pH =6-8) 附近，这保证了 PL 的稳定性。理论上，表明制备的CDs可以在细胞内发出高稳定性的荧光，用于生物标记和生物成像。

为了阐明CDs的荧光稳定性，进行了荧光抗光漂白试验。如图 S2C 所示，与量子点 (CdTe) 和传统荧光染料 (DAPI) 相比，碳点不仅表现出更高的荧光强度，而且还具有出色的抗光漂白性。此外，CDs在去离子水、PBS、FBS培养基、DMEM培养基、CM1-1培养基等多种溶液中也有很好的分散性，在血液系统中具有良好的稳定性（图S3）。

CD 的 zeta 电位值为 - 31.1 mV（图 S4），这可以归因于这些颗粒表面上存在氧和羧基官能团。潜在的带正电荷的 DOX 可以通过与羧基的静电相互作用和疏水相互作用物理附着在 CD 的表面。 DOX-CD 的 zeta 电位值为 − 9.7 mV，证实了 DOX-CD 复合物的制造。此外，CD 包含一个 sp ² -可以通过强π加载DOX芳香结构的碳网络 -π 相互作用。通过不同浓度的 DOX 研究了最佳包封率和载药率。如图S5所示，在0.1 mg/mL的DOX下，最大包封效率计算为50.82%，相应的加载效率为6.82%。

DOX-CD 的体外药物释放

DOX-CDs 的体外 DOX 释放行为在 PBS 中进行，以研究 pH 敏感的 DOX 释放。为了证明这一点，在不同的 pH 值（pH 7.4、6.0 和 5.0）下孵育 DOX-CD，并监测 DOX 的释放。如图 2 所示，DOX-CDs 在 pH 7.4、6.0 和 5.0 下显示出在休息期间的缓释曲线。结果表明 DOX 的释放是 pH 依赖性的。当 DOX-CD 在 pH 7.4 下温育时，在 8 小时内仅释放 13% 的 DOX。然而，当 pH 值降低到 6.0 或 5.0 时，DOX-CDs 分别释放了超过 35% 或 65% 的 DOX，表明 DOX-CDs 对低 pH 值敏感。结果表明，在较低的 pH 值下释放的 DOX 量增加，这归因于酸性环境中 DOX 上 -NH2 基团的质子化增加。因此，DOX-CDs 可以抑制 DOX 在血液循环过程中的过早渗漏，促进细胞内药物释放。对癌症的有效治疗大有裨益。

DOX-CDs在pH 5.0、6.0和7.4下的体外DOX释放曲线

体外细胞毒性试验

生物相容性问题对于 CD 在生物医学成像和药物输送中的应用至关重要。不同浓度的 CDs 对 HO-8910 卵巢癌细胞和 EA.hy926 脐静脉内皮细胞的细胞毒性进行了研究。如图3a所示，HO-8910和EA.hy926细胞即使在5 mg/mL的高浓度下也能保持85%以上的高活力，表明CDs具有良好的生物相容性和低细胞毒性。

体外细胞毒性。 一 CD 对 HO-8910 和 EA.hy926 细胞的生物相容性。 b DOX-CDs 和 CDs 对 HO-8910 肿瘤细胞的细胞毒性。数值表示为平均值 ± SD，(n =3)

当与 DOX 结合时，DOX-CDs 对 HO-8910 卵巢癌细胞表现出 DOX 浓度依赖性细胞活力。如图 3b 所示，DOX-CDs 的细胞活力明显低于不含 DOX 的 CDs，尤其是当 DOX 浓度高于 0.05 mg/mL 时，表明 DOX-CDs 具有优异的抗癌作用。

体外细胞摄取和标记研究

为了评估 DOX-CDs 的细胞内摄取能力，对 HO-8910 细胞进行了细胞成像研究。如图 4 所示，由于 CD 和 DOX 的存在，分别在癌细胞内观察到鲜艳的绿色和红色荧光。特别是，强烈的绿色荧光信号主要位于细胞质中，表明 CDs 细胞内分布。相反，与细胞质相比，细胞核中的红色信号明显更强，这表明 DOX 可能与 CD 分离并直接移动到细胞核，这归因于它与 DNA 的高亲和力。这可以解释为内体和溶酶体中的低 pH 值 (5.0) 可以帮助 DOX-CDs 释放 DOX。因此，DOX-CDs可能是一种很有前景的细胞标记和细胞内药物递送试剂。

HO-8910 细胞对 DOX-CD 的体外细胞摄取。比例尺 =50 μm

体内动物成像研究

裸鼠皮下注射CDs水溶液（50 μL，6 mg/mL）。然后通过腹腔注射 1% 戊巴比妥麻醉小鼠，并在 488 nm 激发光和 535 nm 发射滤光片下通过 Tanon-5200Multi Gel 成像系统成像。如图5a所示，在给药部位观察到强烈的绿色荧光，表明CDs荧光可以有效地穿透小鼠的皮肤和组织。此外，注射后小鼠保持健康，表明CDs具有良好的生物相容性和对动物的低毒性。综合以上结果，CDs可作为体外和体内生物成像的出色发光探针。

体内动物试验。 一 使用 CD 进行动物荧光成像。 b 不同时间段静脉注射CDs小鼠离体成像

此外，CDs的生物分布和排泄途径是通过尾静脉注射纳米探针进行的。在不同的时间点（0、0.5、1、3 h），解剖各种器官进行荧光成像。如图 5b 所示，注射后肾脏和膀胱显示出比其他器官（包括心脏、脾脏和肝脏）强得多的荧光信号。此外，肾脏荧光信号在注射后0.5 h内显着增加，并在1 h后逐渐减弱。然后，膀胱中的荧光信号从0.5 h逐渐增加到1 h，表明CDs是从肾脏输送到膀胱的。结果表明CDs可以通过肾脏和膀胱系统排泄和清除。

体内长期毒性试验

此外，还进行了体内长期毒性研究，以充分研究在临床研究中使用 CD 的潜力。昆明小鼠尾静脉注射PBS和CDs，7天和21 天后采集主要器官（心、肺、肾、肝、脾）进行组织学分析。随后，组织学组织图通过显微镜成像以评估实验组和对照组之间的病理学差异。如图6所示，在给予CDs的动物的主要器官中未观察到显着的器官损伤和炎症病变，表明所制备的CDs对于临床使用和体内研究是安全的。因此，合成的绿色CDs作为生物标志物和生物成像探针具有生物相容性。

CD 给药 7 天和 21 天后主要器官的组织学分析。比例尺 =100 μm

结论

总之，这项工作证明了具有高QY的绿色荧光CD的成本效益制备 93% 用于生物成像和增强的细胞内药物递送。 DOX 成功地共轭在 CDs 上形成了 DOX-CDs，具有良好的晶体结构、显着的水稳定性和优异的光致发光性能。 DOX-CDs 可以响应细胞内 pH 值环境以促进酸触发的细胞内释放。由于 pH 敏感性，DOX-CDs 显示出对 HO-8910 细胞增殖的有效抑制。 DOX-CDs 表现出优异的细胞标记能力，并响应内/溶酶体 pH 值以在细胞内释放 DOX。 CD 在体外和体内都充当荧光探针。最后，通过组织学分析，CD处理的小鼠没有观察到显着的毒性作用。尽管如此，该工作表明，通过这种具有成本效益的方法制备的CDs在生物医学成像和细胞内药物递送方面具有巨大的潜力。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章及其补充信息文件中。

缩写

CD：

碳点

DOX：

阿霉素

DOX-CD：

阿霉素包裹的碳点

FBS：

胎牛血清

MTS 检测：

MTS细胞增殖比色分析试剂盒

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

QY ：

量子产率

TEM：

透射电子显微镜

XPS：

X射线光电子能谱