低成本绿色荧光碳点：增强生物成像与靶向药物递送

摘要

制备多柔比星包裹碳点（DOX-CDs）用于生物成像和增强细胞内药物递送。采用水热法以柠檬酸钠和尿素为前驱体，200°C反应1 h合成CDs。随后通过物理化学相互作用将DOX成功结合在CDs表面。DOX-CDs表现出良好晶体结构、优异水溶稳定性、优秀光致发光性能和高达93%的量子产率。荧光成像显示DOX-CDs易被癌细胞摄取用于细胞标记。观察到内溶酶体pH辅助的DOX释放行为，MTS实验证实DOX-CDs对HO-8910卵巢癌细胞的细胞毒性。此外，CDs在动物成像中显示明亮荧光信号，给药7天和21天后组织学分析显示低毒性。因此，制备的CDs可作为生物医学成像和细胞内药物递送的有前景成像探针。

引言

多柔比星（DOX）是广泛用于治疗乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、甲状腺癌、多发性骨髓瘤、肉瘤和儿童癌症等多种癌症的蒽环类化疗药物。其抗癌机制被认为是干扰DNA合成和修复过程。因此癌症治疗中DOX需穿越细胞膜到达细胞核干扰DNA合成。然而游离DOX难以接近细胞核，且诱导严重体内心脏毒性，阻碍其作为癌症疗法的应用。

近年多功能纳米载体如脂质体、胶束、纳米乳液、聚合物纳米颗粒等因在抗癌药物递送中的重要性备受关注。其中，作为量子点家族新成员，碳量子点（CDs）自2004年发现以来引起全球极大兴趣。特别是荧光CDs因准零重量尺寸（<10 nm）、高光稳定性、宽连续激发谱、可调波长、良好生物相容性、低毒性和优异荧光性能，成为细胞成像、光催化、药物递送、污染物和重金属离子检测、光电设备等领域的首选。例如，Yang等人成功将DOX偶联CDs用于增强抗癌治疗，表明CDs在细胞核靶向药物递送中具有重要意义。

此前提出多种制备CDs方法，包括生物质材料、碳化、钝化、表面官能化等。主要分两类："自上而下"法包括电弧放电、激光烧蚀、电化学刻蚀、氧化法，即将大尺度碳结构破碎为碳纳米颗粒；"自下而上"法从分子前驱体合成CDs，主要包括水热法、超声波法、微波辅助合成等。Xu等人通过电弧放电、氧化、提取、凝胶电泳获得CDs。Ming等人通过电解法获得CDs。Yang等人优化原始水热法合成不同荧光CDs。但这些方法受限于合成过程复杂、耗时、制备要求严、原料昂贵。且使用有机溶剂作为钝化剂会增加CDs毒性。此外，大多数报道CDs在紫外光激发下发蓝光，严重受限于生物医学成像应用，因强组织自身荧光干扰。

本文通过一步可控热解析析柠檬酸钠二水合物和尿素，绿色高效合成绿色荧光CDs。DOX通过疏水相互作用、静电相互作用和π-π堆积作用非共价结合在制备CDs表面用于药物递透射电镜（TEM）和X射线衍射分析形貌结构。紫外-可见光谱仪和光致发光（PL）发射光谱评估光学性质。透析法考察持续释药。荧光显微镜研究细胞摄取和细胞内分布。标准MTS法评估抗癌效果。BALB/c裸鼠进行体内成像。组织学分析考察长期毒性。制备的CDs有望成为体内成像和靶向药物递送的潜在药剂。

材料与方法

材料

柠檬酸钠二水合物、尿素、L-精氨酸、乙二胺、丙酮、奎宁硫酸盐、磷酸缓冲液（PBS）、乙酸、氢磷酸二钠、聚甲醛从国药集团化学试剂有限公司购买。MTS细胞增殖比色分析试剂盒、DMEM/高糖、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA溶液从上海贝时生物技术购买。胎牛血清（FBS）从天航生物技术购买。HO-8910卵巢癌细胞和EA.hy926人脐静脉内皮细胞从中国科学院上海营养与健康研究所获取。盐酸多柔比星（DOX）从Sigma-Aldrich购买。透析袋（MWCO=1000 Da）从SpectrumLabs购买。

CDs和DOX-CDs合成

简述：柠檬酸钠二水合物（0.2 mmol）和尿素（5 mmol）溶于1 mL去离子水。混合液转入玻璃容器，200°C碳化1 h。此后加入1 mL去离子水和丙酮（体积比1/3），10000 rpm离心10 min，重复三次。

DOX通过非共价相互作用结合CDs：DOX·HCl（0.5 mg）加入5 mL CDs（5 mg/mL），避光搅拌48 h。所得溶液用透析袋（MWCO=1000 Da）对去离子水透析24 h得DOX-CDs。最后冻干，4°C保存。

CDs和DOX-CDs表征

TEM（FEI Tecnai G2 Spirit）表征CDs尺寸形貌。LS55荧光分光光度计（PerkinElmer）测PL发射。以硫酸中奎宁硫酸盐溶液为参比测定CDs量子产率（QY）。布鲁克Tensor27傅里叶变换红外分光光度计（Pike Corporation）观察晶体结构。ESCALAB250Xi光电子能谱仪（Thermo）做X射线光电子能谱（XPS）。Malvern Panalytical ζ电位仪测ζ电位。

体外药物释放研究

透析袋法研究DOX-CDs体外药物释放。DOX-CDs装入透析袋，分别浸入pH 7.4和5.0 PBS，置于振荡培养箱（37°C，100 rpm）。定时取0.5 mL样品，等体积PBS补充。荧光强度在590 nm记录释放DOX。

体外细胞毒性测试

MTS法测定DOX-CDs对HO-8910卵巢癌细胞和EA.hy926脐静脉内皮细胞细胞毒性。细胞接种96孔板（0.5×10⁵ cells/mL），贴壁24 h后加入不同浓度DOX-CDs。再孵育24 h，吸除培养基，每孔加90 μL培养基和10 μL MTS。4 h后BioTek Epoch酶标仪测490 nm吸光度。细胞活力以存活细胞百分比表示，报告三次测定平均值。

体外细胞成像研究

HO-8910细胞接种6孔板，37°C贴壁24 h。孵育DOX-CDs允许细胞摄取。4 h后除去培养基，冷PBS洗涤三次，4%多聚甲醛固定10 min。荧光显微镜（Leica Microsystems）观察细胞形态和荧光分布。

体内成像

动物实验经徐州医科大学动物护理委员会批准。BALB/c裸鼠评估CDs荧光成像潜力。皮下注射CDs水溶液（50 μL，6 mg/mL），腹腔注射2%戊巴比妥麻醉。Tanon-5200Multi Gel成像系统成像，激发光488 nm，发射滤光片535 nm，曝光1.0 s。另注射CDs（5 mg/kg）经尾静脉考察小鼠体内生物分布。不同时间点收集心、肾、脾、肝、膀胱等器官进行荧光评估。

体内毒性研究

昆明小鼠（雌性，7周）研究CDs体内长期毒性。随机分CDs组和对照组。尾静脉注射PBS和CDs（6 mg/kg）。注射7天和21天后收集心、肺、肾、肝、脾主要器官。4%多聚甲醛固定、切片、苏木精-伊红（H&E）染色。光学显微镜（Leica Microsystems）观察组织学切片。

结果与讨论

CDs和DOX-CDs表征

一步法以柠檬酸钠二水合物和尿素（摩尔比1:25）为前驱体，200°C反应1 h制备CDs。DOX通过非共价相互作用结合CDs表面用于药物递送（示意图1）。TEM图（图1a）显示CDs呈均一球形，平均直径2.75 nm，粒径分布窄。高分辨TEM图（图1a插图）显示晶体结构，具有明显晶格条纹，表明结晶良好。

FT-IR表征CDs化学结构（图1d）。3499 cm⁻¹和1729 cm⁻¹尖峰分别归属-OH和-COOH；780 cm⁻¹和1372 cm⁻¹可归属N-H。结论：CDs表面同时存在羧基和氨基官能团，可修饰具有特定功能的生物大分子，为CDs进一步应用研究提供可能性。

UV-Vis吸收和PL光谱研究CDs光学性质（图1c）。CDs在410 nm有吸收峰，DOX在500 nm有吸收峰。DOX-CDs同时保持CDs和DOX在410 nm和500 nm吸收峰，表明DOX成功结合CDs。此外（图1c插图），DOX-CDs水溶液自然光下呈淡黄透明，紫外激发下变亮绿色。以奎宁硫酸盐（QY=54%）为参比，荧光量子产率计算为93%。CDs在340-440 nm激发下PL峰几乎无位移，显示激发无关发射特性。最大激发波长400 nm，PL峰525 nm。激发无关PL行为可能源于CDs均一表面态。

XPS测定CDs元素组成（图1f）。CDs主要由碳（C）、氮（N）、氧（O）组成，原子比例分别为78.39%、7.52%、14.1%。C₁s、N₁s、O₁s三个典型峰分别位于284.8、399.5、532.6 eV。具体：C₁s谱显示284.8、286.7、288.3 eV三峰，分别代表C-C、C-N、C-O或C=O键（图S1A）。N₁s高分辨谱显示399.5 eV峰，归属C-N。O₁s谱在531.9和532.6 eV确证C=O和C-O键存在（图S1B）。

CDs荧光强度在4°C和室温下均保持优异稳定性（图S2A）。4°C下两周荧光强度下降<10%可忽略。预期CDs具备长期稳定性，可作为生物医学成像荧光探针。

图S2B显示CDs在高（>10）或低（<3）pH水溶液中PL强度下降。但pH 3-10水溶液中PL强度稳定。CDs用于生物标记和成像需与细胞共孵，pH约中性（6-8），保证PL稳定性。理论上表明制备CDs可在细胞内高稳定发射荧光用于生物标记成像。

为阐明CDs荧光稳定性，进行抗光漂白测试。图S2C显示，相比量子点（CdTe）和传统荧光染料（DAPI），CDs不仅荧光强度更高，且抗光漂白性能优异。此外CDs在DI水、PBS、FBS培养基、DMEM培养基、CM1-1培养基等各种溶液中分散良好（图S3），预期在血液系统有优异稳定性。

CDs ζ电位-31.1 mV（图S4），归因于表面氧和羧基官能团。带正电的DOX可通过与羧基静电相互作用、疏水相互作用物理吸附于CDs表面。DOX-CDs ζ电位-9.7 mV，证实DOX-CD复合物形成。此外CDs含sp²碳网络，可通过强π-π相互作用负载DOX芳香结构。通过不同浓度DOX考察最佳包封率和载药率。图S5显示，0.1 mg/mL DOX时最大包封率50.82%，对应载药率6.82%。

DOX-CDs体外药物释放

PBS中考察DOX-CDs pH敏感释放行为。DOX-CDs在pH 7.4、6.0、5.0孵育监测DOX释放（图2）。DOX-CDs在三种pH下均表现持续释放。结果显示DOX释放pH依赖性。pH 7.4下8 h内仅释放13% DOX。pH降至6.0或5.0时，DOX-CDs分别释放>35%或>65% DOX，表明DOX-CDs对低pH敏感。释放DOX量随pH降低增加，归因于酸性环境中DOX上-NH₂基团质子化增加。因此DOX-CDs可禁止血液循环中DOX过早泄漏，增强细胞内药物释放，极大有益于癌症有效治疗。

体外细胞毒性测试

生物相容性对CDs生物医学成像和药物递送应用至关重要。不同浓度CDs对HO-8910和EA.hy926细胞细胞毒性测试（图3a）。即使高浓度5 mg/mL，两细胞系活力均维持85%以上，表明CDs优异生物相容性和低细胞毒性。

结合DOX后，DOX-CDs对HO-8910细胞表现DOX浓度依赖性细胞活力（图3b）。DOX浓度>0.05 mg/mL时，DOX-CDs细胞活力显著低于无DOX CDs，表明DOX-CDs优异抗癌效果。

体外细胞摄取与标记研究

HO-8910细胞考察DOX-CDs细胞内摄取能力（图4）。癌细胞内观察到鲜明绿色和红色荧光，分别来自CDs和DOX。特别地，强烈绿色荧光主要定位于细胞质，指示CDs细胞内分布。相反，红色信号在细胞核显著强于细胞质，提示DOX可能从CDs解离并直接移至细胞核，因其对DNA高亲和力。可解释为内体/溶酶体低pH（5.0）辅助DOX从DOX-CDs释放。因此DOX-CDs可作为细胞标记和细胞内药物递送的有前景药剂。

体内动物成像研究

裸鼠皮下注射CDs水溶液（50 μL，6 mg/mL）。腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，Tanon-5200Multi Gel成像系统在488 nm激发光和535 nm发射滤光片下成像（图5a）。注射部位观察到强绿色荧光，表明CDs荧光能有效穿透小鼠皮肤和组织。注射后小鼠保持健康，表明CDs对动物具有优异生物相容性和低毒性。综合结果，CDs可作为体外和体内优异发光探针。

尾静脉注射纳米探针考察CDs生物分布和排泄途径。不同时间点（0、0.5、1、3 h）解剖各器官荧光成像（图5b）。注射后肾脏和膀胱荧光信号远强于心、脾、肝等其他器官。肾脏荧光信号注射后0.5 h显著增加，1 h后逐渐减弱。膀胱荧光信号从0.5 h到1 h逐渐增加，表明CDs从肾脏转运至膀胱。结果表明CDs可通过肾脏-膀胱系统排泄清除。

体内长期毒性测试

为充分考察CDs临床研究潜力，进行体内长期毒性研究。昆明小鼠尾静脉注射PBS和CDs，7天和21天后收集主要器官（心、肺、肾、肝、脾）做组织学分析。显微镜成像组织学组织评估实验组与对照组病理差异（图6）。CDs给药动物主要器官未观察到显著器官损伤和炎症病变，提示制备CDs临床使用和体内研究安全。因此合成绿色CDs作为生物标记和生物成像探针具有生物相容性。

结论

本工作展示了一种低成本制备高量子产率（93%）绿色荧光CDs的方法，用于生物成像和增强细胞内药物递送。DOX成功结合CDs形成DOX-CDs，具备良好晶体结构、优异水溶稳定性、优秀光致发光性能。DOX-CDs响应细胞内pH环境促进酸触发细胞内释放。得益于pH敏感性，DOX-CDs有效抑制HO-8910细胞增殖。DOX-CDs展现优异细胞标记能力，响应内体/溶酶体pH在细胞内释放DOX。CDs作为体外和体内荧光探针。最后，组织学分析未观察到CDs处理小鼠显著毒性效应。尽管如此，本工作证明低成本制备的CDs在生物医学成像和细胞内药物递送方面具有巨大潜力。