绿色合成掺铈碳纳米颗粒实现卓越羟基自由基清除用于抗氧化治疗

摘要

纳米医学的最新进展凸显了氧化铈纳米颗粒作为强效抗氧化剂的潜力。本文介绍了一种简单、环境友好的方法，利用牛血清白蛋白（BSA）生物矿化制备掺铈碳质纳米颗粒（Ce掺杂CNPs）。所得颗粒单分散，平均直径14.7 nm，表面富含亲水性基团，确保在水介质中长期分散稳定。体外细胞毒性研究（CCK-8）证实其在宽剂量范围内几乎无细胞毒性。面对过氧化氢诱导的活性氧，Ce掺杂CNPs展现出卓越的羟基自由基清除能力，以剂量依赖方式保护血管平滑肌细胞和7721肿瘤细胞免受氧化损伤。这些发现确立了Ce掺杂CNPs作为有前景的低毒性ROS清除剂，可用于治疗氧化应激相关疾病。

研究背景

氧化应激被定义为活性氧（ROS）产生与抗氧化防御之间的失衡，是许多慢性疾病（包括动脉粥样硬化、癌症和神经退行性疾病）的基础。高反应性的羟基自由基（•OH）破坏性尤强，可引发脂质过氧化、蛋白质修饰和DNA链断裂，最终导致细胞死亡和组织损伤。因此，降低ROS水平（特别是•OH）的治疗策略具有极大的临床价值。

氧化铈纳米颗粒（CeO₂ NPs）因其可逆的Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原循环，已成为强效纳米酶。这使它们能模拟超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，分别清除•O₂⁻和H₂O₂。然而，传统CeO₂ NPs通常需要表面包覆（如PVP）以实现水溶稳定性和生物相容性，这可能改变其固有特性。我们的研究通过将铈离子嵌入源自BSA的碳质框架中，克服了这一局限，制得具有内在亲水性和强大抗氧化性能的Ce掺杂CNPs。

实验部分

材料与试剂

牛血清白蛋白（BSA）、荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）购自Sigma（美国纽约）。胎牛血清（FBS）和Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）购自Invitrogen中国有限公司（上海）。硝酸铈六水合物（Ce(NO₃)₃·6H₂O）、甲基紫（MV）、硫酸亚铁七水合物（FeSO₄·7H₂O）和30% H₂O₂购自阿拉丁试剂（上海）和国药集团化学试剂有限公司（北京）。所有化学品均为分析纯，无需进一步纯化即可使用；全程使用去离子水。

掺铈碳质纳米颗粒的合成

Ce掺杂CNPs通过Wang等人报道的BSA模板合成改良的生物矿化路线制备。简述如下：将1.25 g BSA溶于50 mL去离子水中，持续搅拌形成澄清溶液。随后滴加300 mM Ce(NO₃)₃·6H₂O溶液，同时维持剧烈搅拌。同步缓慢加入2.0 M NaOH将pH调至12。混合物在55 °C下搅拌8 h，得到棕色悬浮液，冷却至室温。产物经0.22 μm PES膜过滤去除大团聚物，对水透析（14 kDa MWCO）3天，真空冻干。所得粉末储存备用。

表征技术

透射电镜（TEM, JEOL JEM-2100）在200 kV下提供形貌数据。颗粒尺寸分布用ImageJ（NIH）计算。傅里叶变换红外光谱（FT-IR, Nicolet Nexus 470）和X射线光电子能谱（XPS, PHI 5000）鉴定表面官能团和氧化态。X射线衍射（XRD, Rigaku D/MAX-2000）确认晶相。紫外-可见吸收光谱（Shimadzu UV-2550）用于溶液研究。

紫外-可见光度法测定自由基清除活性

将Ce掺杂CNPs（10 µM）分散于0.1 M Tris-HCl（pH 5.0）中并超声处理以增强溶解度。反应混合物包含3.0×10⁻⁵ M MV、0.15 mM FeSO₄·7H₂O、1.0 M H₂O₂和Ce掺杂CNPs悬浮液（0.17 mM），总体积10 mL。室温下反应5 min后，测定582 nm处吸光度以量化MV恢复情况，反映羟基自由基清除能力。

细胞活力（CCK-8）测定

将VSMC和7721细胞（1.5×10⁴个/孔）接种于96孔板，培养至约80%汇合度。24 h后，更换含0-400 µg/mL Ce掺杂CNPs的DMEM培养基，继续孵育24 h。加入CCK-8试剂（10 µL/孔）孵育4 h。用Synergy HT酶标仪读取490 nm吸光度；细胞活力以未处理对照组百分比表示。

过氧化氢诱导氧化应激模型

为建立氧化损伤模型，将VSMC和7721细胞暴露于30% H₂O₂，浓度范围50 µmol mL⁻¹至800 µmol mL⁻¹，持续4 h。处理后按上述方法用CCK-8测定细胞活力，确定H₂O₂的LD₅₀（≈560 µM）。

凋亡与存活/死亡染色

用Ce掺杂CNPs（0-400 µg/mL）预处理细胞，随后用560 µM H₂O₂处理4 h。在6孔板中培养的7721细胞进行存活/死亡染色（Calcein-AM/PI），在共聚焦显微镜下获取荧光图像。

流式细胞术分析凋亡

H₂O₂处理后，收集7721细胞，洗涤后用Annexin V-FITC和PI染色。在Beckman Coulter Epics XL MCL流式细胞仪上分析；用FlowJo 7.6.2计算早期（Annexin V⁺/PI⁻）和晚期（Annexin V⁺/PI⁺）凋亡细胞百分比。

统计分析

数据表示为均值±SEM。采用单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey事后检验；p < 0.05视为统计学显著差异。

结果与讨论

纳米颗粒合成与形貌

生物矿化策略产出高度单分散的Ce掺杂CNPs，透射电镜（图1a）证实了这一点。颗粒呈多边形、非团聚形貌，平均直径14.7±0.8 nm（图1b）。水分散液数日保持澄清，显示优异的胶体稳定性——这是生物医学递送的关键优势。

表面化学与氧化态

XPS分析证实Ce³⁺（约15.99%）与Ce⁴⁺共存，支撑了颗粒的氧化还原活性（图2b）。C 1s谱（图2c）在285.0、287.8和288.9 eV处显示峰值，分别对应C-C、C=O和C-O基团；O 1s谱（图2d）在530.5和531.8 eV显示峰值，提示Ce-O键和表面羟基。FT-IR谱（图3A）在3400 cm⁻¹显示宽O-H伸缩振动，在1510和1450 cm⁻¹显示硝酸盐相关峰，确认亲水性官能团的存在及铈离子的成功掺入。

XRD谱（图3B）显示混合碳-铈晶格的特征峰，碳相关峰位于24.4°附近，氧化铈反射峰位于30.3°、35.23°和43.2°，确认Ce成功整合进碳框架。

体外细胞毒性

CCK-8测定显示，Ce掺杂CNPs在高达400 µg/mL浓度下不损害细胞活力（图4a）。即使在最高剂量下，活力仍维持90%以上，凸显颗粒的优异生物相容性。

抗氧化功效

560 µM H₂O₂被确定为VSMC和7721细胞的LD₅₀。Ce掺杂CNPs预处理以剂量依赖方式显著提高存活率，400 µg/mL时活力恢复至约88%（图4c）。存活/死亡染色（图5）显示随Ce掺杂CNPs增加，红色（PI阳性）细胞显著减少，证实其对氧化性凋亡的保护作用。流式细胞术（图6）量化凋亡：单独H₂O₂诱导46.4%晚期凋亡，加入50、100、200和400 µg/mL Ce掺杂CNPs后分别降至24.2%、20.0%、15.1%和11.2%。

结论

我们开发了一种绿色、一步法合成掺铈碳质纳米颗粒的方法，产物高度可分散、生物相容性好，并表现出强效羟基自由基清除活性。颗粒保留内在Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原循环，能模拟SOD和CAT活性，保护血管和肿瘤细胞免受H₂O₂诱导的氧化损伤。其剂量依赖的抗氧化功效和极低细胞毒性，使Ce掺杂CNPs成为预防和治疗氧化应激相关病理的极具吸引力的候选材料。