PEG修饰CoFe₂O₄纳米颗粒：毒性评估与姜黄素的保护作用

摘要

本研究采用水热法成功合成了聚乙二醇（PEG）包覆的CoFe₂O₄纳米颗粒。形貌表征显示，所得PEG-CoFe₂O₄纳米颗粒为纯相多晶结构，粒径约24 nm。研究系统评估了CoFe₂O₄纳米颗粒诱导的毒性，并通过生物学实验检测其毒性效应。进一步利用姜黄素探究其对纳米颗粒毒性的修复作用，结果显示生物化学指标在姜黄素给药后得到解毒并恢复至正常水平。因此，水热法合成的PEG包覆CoFe₂O₄纳米颗粒可用于生物医学应用，而作为一种无副作用的天然化合物，姜黄素可用于治疗纳米颗粒在生物体内诱导的毒性。

研究背景

纳米颗粒（NPs）因其独特的理化性质（与块体材料显著不同）而具有广泛应用优势[1]。钴铁氧体（CoFe₂O₄）作为最重要的磁性材料之一，因其在纳米尺度下的优异性能，在近期技术中引起了极大关注[2-5]。它被视为医学工业应用的有力候选材料，因其可在纳米尺度下实现所需的理化性质，且制备简便、成本低廉，易于控制成分、形状和尺寸。对于生物应用，直径<100 nm的CoFe₂O₄纳米颗粒能显著影响其在生物体内的理化性质和药代动力学。直径>100 nm的颗粒可作为胃肠道磁共振成像造影剂，而<20 nm的小颗粒则可用作肿瘤治疗载体。针对钴铁氧体纳米颗粒的临床应用，体内外生物安全性评估至关重要[6,7]。多数纳米颗粒经口服或静脉注射后主要分布于肝、肾、肺等器官，引发炎症。与其他材料相比，钴铁氧体的生物毒性及姜黄素修复效应研究较少，尽管已有少量关于PEG包覆钴铁氧体纳米颗粒毒性与生物安全性的报道。

从毒理学角度看，主要担忧是过量暴露导致纳米颗粒在生物器官中富集，需清除积累颗粒并紧急治疗炎症性疾病。有研究尝试用抗炎药治疗体内纳米颗粒毒性，发现此类药物能在一定程度上促进体内积累纳米颗粒的排泄，减轻或消除组织炎症[8,9]。姜黄（Curcuma longa）是东南亚传统药用植物，长期用于治疗炎症性疾病。大量研究证实姜黄素具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤及抗致癌特性[10,11]，能促进伤口愈合、治疗肝病、泌尿道疾病和肝炎[11]。姜黄素通过Nrf2-keap1通路缓解慢性病中的氧化应激和炎症，抑制大多数慢性病相关的促炎通路，阻断TNF的产生及TNF介导的细胞信号传导[12]。体内外实验表明，姜黄素可直接结合TNF发挥阻断作用[12]。

本研究利用水热法制备了形貌可控、粒径约25 nm的PEG包覆CoFe₂O₄纳米颗粒。通过不同剂量暴露，检测血液生化指标、HE染色、生物分布及姜黄素对PEG-CoFe₂O₄纳米颗粒毒性的治疗效果。该研究为探究CoFe₂O₄纳米颗粒毒性效应及姜黄素体内治疗提供了新思路。

材料与方法

钴铁氧体纳米颗粒制备

采用水热法合成钴铁氧体纳米颗粒。将硝酸铁和氯化钴溶于去离子水，混合PEG和氢氧化钠水溶液，以双蒸去离子水为溶剂避免杂质。磁力搅拌30 min后移入高压釜，180°C水热反应6 h。反应完成后冷却至室温，去离子水洗涤两次，再用乙醇洗涤去除多余PEG和未溶解盐分，80°C干燥过夜并研磨成粉。此阶段颗粒呈非晶态（XRD确认，Fig. 2a）。为获得晶态颗粒，将样品在500°C退火6 h，最终得到结晶PEG-CoFe₂O₄纳米颗粒（XRD确认，Fig. 2b）。

PEG-CoFe₂O₄纳米颗粒的^99mTc标记

以亚锡酸氯（SnCl₂）为还原剂，将纳米颗粒溶于去离子水中超声处理0.5 h。加入SnCl₂、抗坏血酸和^99mTcO₄⁻（钴铁氧体约占0.4%重量）。因^99mTc半衰期短（~6 h），放射性计数在24 h内测定。用1.0 M NaHCO₃调节pH至5–10，加入PEG-CoFe₂O₄悬液，80°C下10,000 rpm搅拌25 min。离心除去上清，剩余物为^99mTc-PEG-CoFe₂O₄。纸层析法（正常盐水和丙酮色谱溶液）测定标记率，结果约70%，反映体内真实分布与代谢。

PEG-CoFe₂O₄纳米颗粒的生物分布研究

昆明小鼠（15–18 g）由兰州大学医学科学实验室中心提供。动物单独饲养，温控21–22°C，光照08:00–20:00，按欧洲共同体指令（86/609/EEC）及甘肃省医学实验动物中心、兰州大学动物实验伦理委员会指南给予饲料水。小鼠随机分为7组（每组5只），静脉注射^99mTc-PEG-CoFe₂O₄溶液，注射后1、6、16、24 h处死。立即解剖心、肝、脾、肺、肾组织并采集大量血液。组织包裹称重后测定^99mTc放射性，数据经物理衰变校正。组织分布以单位湿组织克注射剂量百分比（%ID/g）表示，计算公式为（组织放射性/总注射剂量）÷湿组织重量。

PEG-CoFe₂O₄不同剂量对小鼠毒性的影响

21只小鼠分7组（每组3只）。PEG-CoFe₂O₄纳米颗粒静脉注射，剂量分别为125、250、350 μg/只（0.2 ml），对照组注射0.9%生理盐水。治疗组同步静脉注射相同剂量姜黄素。损伤组24 h后处死，治疗组3 d后处死。采血离心10 min获取血清，测定总胆红素（TB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、胱抑素C（Cys-C）。同步取肝、肺、脾、肾、心组织，10%缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，苏木精-伊红（H&E）染色，奥林巴斯CX41显微镜配数码相机观察。

结果与讨论

TEM与XRD分析

透射电镜（JEOL JEM-1400）和X射线衍射仪（Shimadzu XRD-7000，Cu Kα）表征形貌。Fig. 1显示不同分辨率TEM图像，确认纯相PEG包覆钴铁氧体纳米颗粒成功形成，粒径约24 nm。Fig. 2为XRD分析：Fig. 2a为制备样品，显示非晶态；Fig. 2b为500°C退火6 h后，颗粒转为晶态。Debye-Scherrer公式（D = Kλ / βcosθ）[13]计算平均晶粒尺寸约22 nm。XRD峰位和相对强度表明立方尖晶石结构（JCPDF卡片No. 20-1086，Fig. 2b插图），所有峰指标正确，无杂质峰。TEM和XRD均确认约22–25 nm结晶纳米颗粒成功形成。

傅里叶变换红外光谱、拉曼及热重分析

傅里叶变换红外光谱（FTIR）研究钴铁氧体纳米颗粒结构性质及阳离子分布。Fig. 3为室温红外光谱。钴铁氧体通常在400–600 cm⁻¹有两个强吸收带ʋ₁和ʋ₂[14-16]，本实验明显观测到。高频带（ʋ₁）对应四面体晶格位点金属-氧（M-O）本征伸缩振动，低频带（ʋ₂）对应八面体位点金属离子伸缩振动[14-16]，证实立方结构钴铁氧体纳米颗粒成功形成。~3400 cm⁻¹处PEG特征峰确认PEG成功接枝。

Fig. 4为室温拉曼光谱（190–684 cm⁻¹）。高频特征峰684 cm⁻¹为尖晶石铁氧体A_1g模式，对应四面体位点Fe-O键氧离子对称伸缩[17]。低频峰亦属立方结构钴铁氧体。所有峰在适当能量出现，确认PEG包覆立方CoFe₂O₄纳米颗粒成功形成。

热重分析（TGA）在50–600°C进行（Fig. 5）。CoFe₂O₄在200–300°C失重，PEG在400°C以下失重，PEG-CoFe₂O₄在200–400°C失重。PEG热稳定性较差（图右侧），而PEG-CoFe₂O₄热稳定性超80%。纯钴铁氧体不溶水，PEG包覆后因亲水性易溶解（Fig. 6）。随时间推移颗粒沉降瓶底，可能因纳米颗粒重力。注射前在生理盐水中充分分散以确保在小鼠各器官正常递送。

生物分布研究

为准确量化纳米载体给药后在各器官含量，对正常小鼠进行^99mTc-PEG-CoFe₂O₄生物分布研究。Fig. 7显示PEG-CoFe₂O₄在肝、脾摄取较高，与文献[18]一致（注射1 h后肝脾摄取量为其他磁性纳米颗粒3倍）。原因在于网状内皮系统器官（肝、脾）含Kupffer细胞，通过吞噬作用清除血液循环中的纳米/微米材料[19]。本研究观察到组织分布随时间降低，表明PEG-CoFe₂O₄随尿液排泄。肾为纳米颗粒排泄器官，Fig. 7显示1 h时肾分布最高[20]。血液积累仅注射即后较高，表明放射性从血库快速清除（Fig. 7），类似PEG修饰氧化铁纳米颗粒在血液中长循环[21,22]。心脏分布极低，与文献[23]一致。脾脏为老化红细胞破坏及血红蛋白结合铁回收主要场所[18,24]。随时间推移，脾脏较慢但更有效地清除循环中纳米颗粒，导致注射1 h后组织放射性浓度升高。肺部摄取不显著（Fig. 7），文献[23]亦有类似报道，表明无微团块不可逆滞留于肺毛细血管[23,25,26]。

PEG-CoFe₂O₄剂量对毒性的影响

为揭示PEG-CoFe₂O₄潜在毒性，开展小鼠体内生化检测。静脉注射生理盐水与PEG-CoFe₂O₄混合液（150、250、350 μg），24 h后处死。采血离心10 min获血清，重点检测肝肾功能指标：Cys-C、CREA、ALT、AST、TB、BUN。SPSS软件与对照组比较（p < 0.05为显著差异），结果见图8。ALT、BUN、CREA在暴露组与对照组间差异显著。TB和Cys-C（肾功能主要生物标志物）在150 μg/只剂量下显著降低，250 μg/只升高，350 μg/只恢复正常。提示PEG-CoFe₂O₄在一定程度上影响肾功能但未显著损伤组织。AST（肝健康生物标志物）在所有剂量下显著降低，提示对肝功能影响大于对照组。综合来看，250 μg/只剂量损伤相对较大，后续实验采用该剂量。

姜黄素对PEG-CoFe₂O₄毒性的修复效应

本研究利用姜黄素减轻PEG-CoFe₂O₄损伤诱导的炎症。通过测定治疗组小鼠血清生化指标（BUN、CREA、Cys-C、ALT、AST、TB）及组织病理学，探究姜黄素治疗效果。Fig. 9显示：与暴露组相比，不同剂量姜黄素使BUN、CREA、Cys-C、AST显著下降；150 μg/只姜黄素使ALT、AST、CREA恢复至对照组正常水平。TB和ALT在所有姜黄素剂量下均较暴露组显著下降。结果表明姜黄素对PEG-CoFe₂O₄损伤有积极治疗效果，不同剂量均显示更好疗效。本研究考察姜黄素对血清肝酶（ALT、AST）和肾酶（BUN、CREA、Cys-C、TB）水平的保护作用。PEG-CoFe₂O₄显著升高上述酶水平，姜黄素给药后多接近正常。坏死或细胞膜损伤可致酶释入血，血清酶水平反映肝肾功能。姜黄素组酶量减少，表明其抗PEG-CoFe₂O₄毒性保护作用，归因于姜黄素抗氧化作用减轻氧化应激。此外，TNF-α和IL-1参与肝坏死诱导，姜黄素通过抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1降低毒性[11]。结果与文献[27]一致。

肝、肾、脾组织病理学分析验证纳米颗粒给药可能诱导的毒性效应。各器官取出，10%福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm切片H&E染色显微镜检查。结果显示分析器官无相关病理组织学改变（Fig. 10）。肝脾检查显示器官结构未受钴铁氧体纳米颗粒影响。可能原因：一是纳米颗粒尺寸较大（24 nm）；二是给药剂量较小（150、250、350 μg）且24 h处死，仅影响器官功能未损伤结构。文献[28]给予20 mg/kg（高于本研究）连续7天，文献[29]亦未监测到器官病理改变。

结论

本研究利用水热法成功制备24 nm PEG包覆钴铁氧体纳米颗粒。详细探究不同剂量PEG钴铁氧体纳米颗粒诱导的小鼠多器官毒性，并用姜黄素研究修复效应。生物学实验检测CoFe₂O₄纳米颗粒毒性。姜黄素治疗后生化指标出现积极变化，恢复正常或显著下降。研究表明水热法合成的PEG包覆CoFe₂O₄是良好的药物载体模型，姜黄素作为无副作用天然化合物，可用于治疗生物体内纳米颗粒毒性及其他疾病。

缩略语

ALT：

丙氨酸氨基转移酶

AST：

天冬氨酸氨基转移酶

BUN：

血尿素氮

CREA：

肌酐

Cys-C：

胱抑素C

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

H&E：

苏木精-伊红

NPs：

纳米颗粒

Nrf2：

核因子红细胞2相关因子2

PEG：

聚乙二醇

TB：

总胆红素

TEM：

透射电子显微镜

TGA：

热重分析

TNF：

肿瘤坏死因子

XRD：

X射线衍射