PEG 包覆的 CoFe2O4 纳米颗粒的毒性与姜黄素的处理效果

背景

纳米粒子 (NPs) 的使用具有许多优势，因为它们具有独特的化学和物理特性，这些特性与它们的大块对应物有很大不同 [1]。钴铁氧体 (CoFe2O4) 作为最重要的磁性材料之一，由于其在最新技术中的各种应用而引起了纳米级的极大兴趣 [2,3,4,5]。由于其具有纳米级所需的物理和化学特性的能力，它被认为是其广泛应用的竞争候选者之一，主要是在医疗行业。此外，CoFe2O4 易于制造且具有成本效益，具有特定应用所需的受控成分、形状和尺寸。在这方面，用于生物应用的 CoFe2O4 纳米粒子的直径低于 100 nm 可以极大地影响生物体的理化性质和药代动力学。直径大于 100 nm 的较大颗粒用作胃肠道磁共振成像的造影剂，而小于 ~ 20 nm 的较小颗粒用作肿瘤治​​疗的载体。对于铁氧体钴纳米粒子的临床应用，研究体内外生物安全性非常重要[6, 7]。许多通过口服或静脉注射进入体内的纳米颗粒主要分布在肝、肾和肺中，从而导致这些器官发生各种炎症。与其他材料相比，铁酸钴尚未被广泛研究以探索其在生物体中的毒性，然后使用姜黄素探索其治疗效果，尽管很少有其他关于研究聚乙二醇 (PEG) 涂层铁酸钴的毒性和生物安全性的报道。纳米粒子。

从毒性的角度来看，主要关注的是过度暴露需要消除生物器官中积累的纳米粒子以及需要紧急治疗炎症性疾病。一些研究人员尝试研究几种抗炎药对体内纳米粒毒性的治疗，他们发现这些抗炎药可以在一定程度上促进体内积聚的纳米粒的排泄，以减少体内毒性。或消除组织炎症作用 [8, 9]。 姜黄 （姜黄）是一种传统药草，在东南亚用作治疗炎症性疾病的历史相当悠久。大量研究报道了姜黄素的抗氧化特性、抗突变和抗肿瘤作用以及致癌特性 [10, 11]。姜黄素具有治愈伤口以及治疗肝脏疾病、泌尿系统疾病和肝炎的能力[11]。它通过 Nrf2-keap1 通路减轻慢性疾病中的氧化应激和炎症。姜黄素可以抑制与大多数慢性疾病相关的促炎通路，并阻断 TNF 的产生和由 TNF 介导的细胞信号传导在各种类型的细胞中。此外，姜黄素还可以通过直接与TNF结合而在体外和体内充当TNF阻滞剂[12]。

在这项研究中，我们使用水热技术成功制备了形状和尺寸控制在 25 nm 左右的 PEG 包覆的 CoFe2O4 纳米颗粒。在给予不同的 CoFe2O4 纳米颗粒暴露（剂量）后，我们检查了血液分析、HE 染色和生物分布以及姜黄素对 PEG-CoFe2O4 纳米颗粒引起的毒性的治疗效果。本研究为研究CoFe2O4纳米颗粒的毒性作用以及使用姜黄素在体内治疗PEG-CoFe2O4纳米颗粒引起的毒性提供了一种新方法。

方法

钴铁氧体纳米颗粒的制备

使用水热技术合成钴铁氧体纳米颗粒。为此，将足量的硝酸铁和氯化钴溶解在去离子水中，然后与 PEG 和氢氧化钠 (NaOH) 的水溶液混合。双蒸去离子水用作溶剂以避免最终纳米颗粒中存在任何杂质。使用磁力搅拌器将混合物搅拌约 30 分钟，然后倒入高压釜中，在 180°C 下加热 6 小时以进行水热反应。反应完成后，将产物冷却至室温，然后用去离子水洗涤两次，然后用乙醇洗涤以除去溶液中存在的过量PEG和其他未溶解的盐。最后，将产物在 80°C 下干燥过夜，然后研磨成粉末以获得所需的钴铁氧体纳米粒子。在这个阶段，发现纳米颗粒是无定形的，这由图 2a 中所示的 XRD 证实。为了获得晶体形式的纳米颗粒，然后将样品在 500°C 下退火 6 小时，最终产品以结晶 PEG-CoFe2O4 纳米颗粒的形式获得，这通过图 2b 所示的 XRD 得到证实。

PEG-CoFe2O4 纳米颗粒的 99mTc 标记

使用氯化亚锡 (SnCl2) 作为还原剂，用 99mTc 对 PEG 包覆的 CoFe2O4 纳米颗粒进行放射性标记，并在超声波条件下将纳米颗粒溶解在去离子水中约 0.5 小时。然后将 SnCl2、抗坏血酸和 99mTcO4 添加到纳米颗粒悬浮液中（铁酸钴约为 0.4%（重量））。为了获得准确的数据，由于 99mTc 的寿命较短（~ 6 小时），因此在 24 小时内测量了放射性计数。使用 1.0 M NaHCO3 溶液将混合物的 pH 值调整为 5-10；然后，将 PEG-CoFe2O4 的悬浮液加入其中，然后将所得混合物在 80°C 下以 10,000 的温度搅拌 25 分钟。离心后，倒出上清液，剩余的物质经鉴定为 99mTc PEG-CoFe2O4。纸色谱（在生理盐水和丙酮的色谱溶液下）用于测量标记化合物的产率。发现纳米颗粒的放射性标记率为70%左右，反映了体内的真实分布和代谢情况。

PEG-CoFe2O4 纳米颗粒的生物分布

体重在 15-18 g 范围内的昆明小鼠由中华人民共和国甘肃兰州大学医学实验室中心提供。所有动物都被关在具有温度控制系统（21 至 22°C）的单独笼子中，并在 08:00 至 20:00 小时打开灯。根据 1986 年 11 月 24 日欧洲共同体理事会指令 (86/609/EEC) 的动物方案，按照甘肃省医学动物中心动物护理和使用机构委员会的批准，为小鼠提供适当的食物和水和兰州大学动物委员会指南（中国）。将小鼠随机分为七组（每组五只），静脉注射 99mTc-PEG-CoFe2O4 溶液，然后在注射后 1、6、16 和 24 小时处死。立即解剖来自心脏、肺、肝脏、脾脏和肾脏的组织，然后收集大量血液。每个组织都用箔纸包裹，适当称重，并计数为 99mTc。数据点已针对放射性的物理衰减进行了校正。组织分布以每克湿组织的注射剂量百分比（%ID/g）表示，可以通过每克湿组织注射的百分比（组织活性/总活性剂量）计算。

剂量对小鼠 PEG-CoFe2O4 毒性的影响

在这个实验中，21只小鼠被分为七组（三只小鼠/组）。 PEG-CoFe2O4 纳米颗粒以 125、250 和 350 微克/小鼠（0.2 毫升）的不同剂量静脉注射到小鼠体内，对照组用 0.9% 的生理盐水处理。在治疗组中，还对小鼠静脉注射了不同剂量的姜黄素，分别为 125、250 和 350 μg/小鼠。损伤组在 24 小时后被杀死，而治疗组在 3 天后被杀死。从小鼠收集血液并离心约 10 分钟以获得血清。测定血清总胆红素（TB）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、胱抑素C（Cys-C）含量。同时，肝脏、肺、脾、肾和心脏被立即收获。这些组织固定在 10% 缓冲福尔马林中，并用苏木精和伊红进行常规组织学处理。采用Olympus Microphot-CX41显微镜配合数码相机对组织进行显微观察。

结果与讨论

TEM 和 XRD 分析

使用 JEOL JEM-1400 透射电子显微镜和 X 射线衍射仪（Shimadzu XRD-7000）以铜 Kα 作为辐射源进行形态表征。图 1 显示了具有不同分辨率的 PEG 涂覆的铁氧体钴纳米粒子的 TEM 图像（图 1a、b），这证实了粒径约为 24 nm 的纯相 PEG 涂覆的铁氧体钴纳米粒子的成功形成。图 2 显示了制备的纳米粒子的 X 射线衍射分析。图 2a 显示了所制备样品的 XRD 结果，这表明纳米颗粒大多为无定形形式。然而，当样品在高温（即 500°C）下退火 6 小时时，发现纳米颗粒变成了结晶形式，这可以在图 2b 中的 XRD 图像中看到。平均微晶尺寸是使用德拜-谢勒方程 (D =Kλ / β cosθ ) [13]，结果是 ~ 22 nm。 XRD 图中所有观察到的峰的位置和相对强度表明，根据图 2b 插图中所示的 JCPDF 卡片（卡片编号 20-1086），晶体结构有利于纳米颗粒立方尖晶石结构的形成。所有峰都被正确标记，在 XRD 图中没有看到额外的峰，表明样品中不存在杂质。 TEM 和 XRD 结果均证实成功形成了约 22-25 nm 的结晶纳米粒子。

一 , b 不同分辨率下PEG包覆的铁氧体钴纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像

样品a的XRD结果 准备好的和b 在 500°C 下退火。插图显示了钴铁氧体的 JCPDF 卡。得到的XRD数据中没有发现额外的峰

傅立叶变换红外光谱、拉曼和 TG 分析

傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 被用来研究钴铁氧体纳米粒子的结构特性和阳离子分布。图 3 显示了在室温下采集的样品的红外光谱。一般铁氧体钴有两个强吸收带，ʋ 1 和 ʋ 2, 出现在 400–600 cm ⁻¹ 范围内 [14,15,16]，这在我们的案例中非常明显。高频段 (ʋ 1) 对应于金属 (M-O) 在四面体晶格位置的固有伸缩振动，而较低的带 (ʋ 2) 表示金属离子在八面体位置的伸缩振动 [14,15,16]。这些结果揭示了立方结构的钴铁氧体纳米颗粒的成功形成。根据 FTIR 数据，峰值显示在 ~ 3400 cm ⁻¹ 清晰地显示了PEG峰，证实了PEG与铁氧体钴纳米粒子的成功结合。

傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 在 500–4000 cm ^-1 范围内使用 研究样品的结构特性。数据证实了PEG包覆的铁氧体钴纳米粒子

样品的室温拉曼光谱如图 4 所示，代表了 190-684 cm ^-1 范围内的不同峰 .高频主峰 (684 cm ⁻¹ ) 是尖晶石铁氧体的特征峰，归因于 A1g 模式，对应于氧离子沿四面体位置的 Fe-O 键的对称拉伸 [17]。低频峰也属于尖晶石结构的钴铁氧体。在适当的能量下，拉曼光谱中所有这些峰的出现证实了PEG包覆的立方CoFe2O4纳米颗粒的成功形成。

在 190–1000 cm ⁻¹ 中收集的样品的室温拉曼光谱 频率范围

样品（CoFe2O4、PEG 和 PEG-CoFe2O4）的热重分析 (TGA) 在 50 到 600°C 之间进行，结果如图 5 所示。这些热分析图表明 CoFe2O4 纳米粒子在 200 –300 °C，PEG 在低于 400 °C 的温度下会失去重量，而 PEG-CoFe2O4 在 200–400 °C 的温度范围内会失去重量。可见PEG的热稳定性比较差（如图右侧所示）；然而，PEG-CoFe2O4 的热稳定性似乎超过 80%。纯铁氧体钴纳米粒子不溶于水；但由于其亲水性，涂上PEG后很容易溶解在水中，如图6所示。从图中可以看出，随着时间的推移，颗粒沉淀在瓶底，这可能是由于纳米粒子的重力。图 6 显示了 PEG 包覆的铁氧体钴纳米颗粒溶解的时间演变。在我们的案例中，我们在注射到小鼠体内之前将纳米颗粒完全分散在生理盐水中，以确保它们在小鼠的不同器官中正确递送。

在 50–600 °C 的温度范围内对纯 CoFe2O4、PEG 和 PEG 包覆的 CoFe2O4 进行热重分析 (TGA)

PEG-CoFe2O4 纳米粒子在不同时间间隔（5、10、30 和 60 分钟）的去离子水中的溶解度

生物分布研究

为了准确量化在活生物体中给药后每个器官中纳米载体的数量，在正常小鼠中进行了 99mTc PEG-CoFe2O4 的生物分布。可以看出，PEG-CoFe2O4 在肝脏和脾脏中的摄取量较高，如图 7 所示，这些结果与参考文献 [18] 相同，其中在注射后 1 小时放射性标记的铁酸钴的摄取量高出三倍在肝脏和脾脏中的含量高于其他磁性纳米颗粒。原因是与网状内皮系统（如肝脏和脾脏）结合的组织大量吸收了这些外来颗粒，因为这些器官具有库普弗细胞，库普弗细胞具有清洁功能，并在从体内去除纳米和微材料方面发挥重要作用。通过吞噬作用进行身体循环 [19]。在这项工作中，观察到 PEG-CoFe2O4 在组织中的分布随着时间的推移而减少，这意味着 PEG-CoFe2O4 纳米颗粒随着时间的推移通过排尿过程排出体外。肾脏是纳米颗粒通过尿液的排泄系统。在图 7 中，肾脏中的最大生物分布在 1 小时内观察到 [20]。仅在注射后立即血液蓄积很高，表明放射性物质从身体血池中的清除速度相对较快，如图 7 所示，这类似于带有长期存在于血液中的 PEG 链的氧化铁纳米颗粒的情况池 [21, 22]。此外，发现心脏中的生物分布非常低，这与参考文献[23]中的报道相同。值得注意的是，脾脏是旧红细胞破坏和随后与血红蛋白结合的 FE 再循环的主要部位 [18, 24]。已经观察到，随着时间的推移，脾脏中较慢但更有效的过程处于活跃状态，并且它们更有能力从循环中消除纳米颗粒，导致注射后 1 小时后组织放射性浓度增加。如图 7 所示，在我们的整个研究中，PEG-CoFe2O4 的肺摄取是微不足道的。参考文献 [23] 中也报道了类似的工作。这表明没有微团聚体可以不可逆地被困在肺的毛细血管中 [23, 25, 26]。

暴露于小鼠的不同时间间隔（1、6、16 和 24 小时）后，PEG-CoFe2O4 纳米颗粒在血液、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中的生物分布。所得数据中的误差线如图所示

PEG-CoFe2O4 对毒性的剂量影响

为了揭示 PEG-CoFe2O4 的任何潜在毒性作用，我们在体内对小鼠进行了生物化学测试。为此，我们注射了不同量（150、250 和 350 μg）的盐水和 PEG-CoFe2O4 混合溶液，并在 24 小时后处死小鼠。对于血液分析，收集血液并离心约 10 分钟以获得血清。测试了各种参数，重点关注肝肾功能标志物，包括 Cys-C、CREA、ALT、AST、TB 和 BUN。然后使用 SPSS 软件将这些参数与对照组进行比较 (p <0.05表示有显着差异），结果如图8所示，暴露组与对照组的ALT、BUN、CREA-A有显着差异。可以看出，TB 和 Cys-C 主要负责肾功能含量的生物标志物，发现每只小鼠暴露 150 μg PEG-CoFe2O4 时显着降低，发现每只小鼠暴露 250 μg 时增加剂量达到每只小鼠 350 μg 的正常水平。这表明，在一定程度上，PEG-CoFe2O4 暴露会影响肾功能，但并未对组织造成显着损害。 AST 是肝脏健康的生物标志物，在暴露于所有剂量后显着降低，这表明与对照组小鼠相比，它对肝功能的影响更大。从所有这些结果来看，很明显 250 μg/小鼠的 PEG-CoFe2O4 剂量表现出相对更大的损伤。因此，为了在我们的实验中进一步分析和测试，我们使用了 250 μg/小鼠的 PEG-CoFe2O4 剂量。

不同剂量(μg)PEG-CoFe2O4暴露于小鼠血清生化指标含量，误差线见图

姜黄素对 PEG-CoFe2O4 毒性的影响

在这项研究中，姜黄素被用来减轻炎症对 PEG-CoFe2O4 的损伤作用。为了研究姜黄素对PEG-CoFe2O4毒性的影响，测定了小鼠的生化指标和组织组织学。这些生化指标包括治疗组小鼠血清中的BUN、CREA、Cys-C、ALT、AST和TB。可以看出，与暴露组相比，BUN、CREA、Cys-C 和 AST 在不同剂量的姜黄素中显着降低，而在 150 μg/小鼠的姜黄素剂量下，ALT、AST 和 CREA 达到与对照组相比正常水平，如图 9 所示。在 TB 和 ALT 含量中，与 PEG-CoFe2O4 暴露组相比，所有剂量的姜黄素都显示出显着降低。在图 9 中，结果表明姜黄素对小鼠 PEG-CoFe2O4 的损伤具有积极的治疗作用，不同剂量的姜黄素显示出更好的治疗效果。这项工作研究了姜黄素对肝酶（ALT 和 AST）和肾酶（BUN、CREA、Cys-C 和 TB）的血清水平的保护作用。在本研究中，与对照组相比，PEG-CoFe2O4 显着提高了血清 ALT、AST、BUN、CREA、Cys-C 和 TB 酶的水平，在姜黄素给药后大部分接近正常水平。坏死或细胞膜损伤会导致这些酶释放到血液中。然而，这些酶的血清水平与肝肾功能有关。在接受姜黄素的组中，这些酶的数量减少，这表明姜黄素对 PEG-CoFe2O4 纳米粒子的毒性具有保护作用。这是由于姜黄素的抗氧化作用可减少氧化应激。此外，TNF-α 和 IL-1 在诱导肝坏死中起作用。因此，姜黄素可以通过抑制巨噬细胞分泌 TNF-α 和 IL-1 来降低毒性作用 [11]。这些发现与参考文献[27]中报道的其他结果一致。

姜黄素处理组小鼠血清生化指标含量，误差线如图所示

还进行了肝脏、肾脏和脾脏的组织病理学分析，以验证纳米颗粒给药引起的可能的毒性作用。取出每只小鼠的器官，用10%福尔马林处理，并包埋在石蜡中。 5 微米切片用苏木精-伊红 (H&E) 染色并用显微镜检查。结果表明，在图 10 所示的分析器官中没有记录到相关的组织病理学变化。肝脏和脾脏检查表明器官结构不受铁酸钴纳米颗粒给药的影响。这是由于两个可能的原因：首先，纳米颗粒的尺寸相对较大（即 24 纳米），其次，我们给予小剂量的钴铁氧体纳米颗粒（即 150、250 和 350 微米）并杀死24 小时后的小鼠。所以，这只会影响器官的功能，而不会影响它的结构。这与作者在参考文献 [28] 中报告的案例相似，他们在 7 天内给予 20 mg/kg（高于我们的案例）。同样，在参考文献[29]报道的另一例中，未监测到器官的组织病理学变化。

PEG-CoFe2O4或姜黄素暴露于小鼠后的组织切片

结论

在这项工作中，我们成功地使用水热技术制造了 24-nm PEG 涂层的铁氧体钴纳米颗粒。详细探讨了使用不同剂量的PEG钴铁氧体纳米粒子对小鼠各器官的毒性作用，然后用姜黄素研究其愈合效果。进行生物测定以检查 CoFe2O4 纳米颗粒的毒性。姜黄素处理后生化指标呈阳性变化，或达到正常水平或大幅下降。该研究表明，通过水热技术合成的 PEG 包覆的 CoFe2O4 是一种很好的药物载体模型，姜黄素是一种天然化学物质，无副作用，可用于治疗毒性和其他疾病在生物体中。

缩写

ALT：

丙氨酸氨基转移酶

AST：

天冬氨酸转移酶

BUN：

血尿素氮

CREA：

肌酐

Cys-C：

胱抑素C

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

H&E：

苏木精-伊红

NP：

纳米粒子

Nrf2：

核因子红细胞2相关因子2

PEG：

聚乙二醇

结核病：

总胆红素

TEM：

透射电子显微镜

TGA：

热重分析

TNF：

肿瘤坏死因子

XRD：

X射线衍射