双模探针靶向整合素αvβ3的合成和体外研究

背景

恶性肿瘤浸润和远处转移是治疗失败的主要原因。恶性肿瘤转移的过程需要破坏细胞外基质（ECM）和肿瘤新生血管[1]。因此，体外无创监测与肿瘤新生血管形成相关的分子标志物对于预测肿瘤转移和早期诊断尤为重要。整合素 αvβ3 是一种广泛研究的肿瘤新血管系统分子标志物，已受到广泛关注。该整合素与肿瘤新生血管形成过程中血管内皮细胞的粘附、增殖和分化密切相关[2]。

分子成像的进步使得在分子水平上对肿瘤生长进行无创监测成为可能。感兴趣的目标分子的分子成像研究必须具有两个基本要素：(1) 合适的靶向成分和 (2) 可以通过成像技术检测到的信号成分。整合素 αvβ3 特异性识别并结合 ECM 蛋白中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列，通过构象变化被激活。因此，RGD序列作为重要的靶向成分被广泛用于肿瘤靶向示踪剂的合成[3]。由于其非电离辐射、高软组织分辨率和非限制性穿透深度，磁共振 (MR) 成像已成为监测肿瘤的最强大的分子成像诊断工具之一 [4, 5]。统计分析表明，大约 50% 的 MR 检查需要使用造影剂来提高图像质量 [6, 7]。近红外荧光成像是一种光学成像，近红外光是最早发现的非可见光，其波长范围为 700 至 900 纳米。近红外荧光成像技术允许外科医生在手术过程中可视化、描绘和切除肿瘤 [8, 9]。然而，随着人类疾病谱的变化，单模分子成像由于其较高的假阳性和假阴性率无法满足精准诊断的要求。因此，基于多模式融合的分子成像技术将成为分子成像发展的新趋势[10]。

在本研究中，我们制备了一种双模式分子探针 cRGD-Gd-Cy5.5，可用于肿瘤的组织学和功能成像（方案 1）。与以 Fe3O4 为信号单元的分子探针 [11, 12] 相比，cRGD-Gd-Cy5.5 表现突出，具有 (a) 高顺磁性（Gd ^{3 +} 周围有七个未配对电子） ); (b)与载体结合形成稳定螯合剂的能力，如临床广泛使用的Magnevist； (c) 空间分辨率高，图像清晰度高于阴性造影剂 [13, 14]。我们选择脂质体作为将 MR 造影剂连接到荧光造影剂的载体分子。常见的磷脂分子结构中有两条长疏水烃链和一个亲水基团。当加入水或缓冲溶液中时，适量的磷脂分子呈特定方向排列，亲水基团两侧面向水相，疏水烃链彼此相对，在脂质体中形成双层。 RGD靶向环肽和Cy5.5荧光分子通过引入带氨基的聚乙二醇（PEG）磷脂与脂质体表面偶联，最后将Gd离子封装在脂质体中，实现靶向多峰分子探针的构建在结构、组成、尺寸、形状、稳定性和 MR 弛豫率方面具有理想的特性。通过细胞毒性试验和细胞形态观察评估其细胞相容性。最后，评估了cRGD-Gd-Cy5.5在体外癌细胞的T1加权MR成像和荧光成像中的潜力。

Gd掺杂脂质体的合成路线，然后是RGD偶联和Cy5.5用于生物应用，用于整合素αvβ3的高灵敏度检测

结果

cRGD-Gd-Cy5.5 纳米探针的表征

cRGD-Gd-Cy5.5溶液为淡粉色澄清液体，静置一段时间无明显沉淀，分散性良好。透射电子显微镜 (TEM) 显示 cRGD-Gd-Cy5.5 脂质体复合物的外观为大小均匀的球形，在用 2% 磷钨酸钠负染色后没有颗粒聚集或损坏，如图 1a 所示。粒径分布一致，范围为 50 至 80 nm，平均粒径为 60.08 ± 0.45 nm。通过动态光散射 (DLS) 测量的 cRGD-Gd-Cy5.5 脂质体复合物的水合粒径为 124.2 ± 0.215 nm（图 1b）。如图所示，纳米颗粒在水中表现出窄的尺寸分布和良好的分散性。表面zeta电位为39.5 ± 1.65 mV，表面带正电荷，与表面存在氨基一致（图1c）。

CRGD-GD-CY5.5 纳米探针的表征数据。 一 cRGD-Gd-Cy5.5 的低倍 TEM 图像。 b 通过尺寸分析检测粒径，探针的平均尺寸为124.2nm。 c Zeta电位约为39.5 mV，表观表面带正电

多功能微孔板实验表明空白脂质体不存在紫外吸收区，在600 nm激发光下与荧光Cy5.5偶联的脂质体在685 nm处有明显吸收峰（图1a），与荧光Cy5.5的发射波长一致.荧光分子表明Cy5.5成功偶联。小动物荧光成像系统结果显示，在600 nm激发光下，脂质体偶联的荧光Cy5.5有明显的红色荧光，而空白脂质体无荧光信号（图2b）。

cRGD-Gd-Cy5.5 纳米探针的荧光特性。 一 用多功能酶分析仪检测荧光Cy5.5标记的脂质体，在600nm激发光下在670nm处有可见发射峰。 b 600nm激发光下，脂质体偶联荧光Cy5.5（左）有明显发光，空白脂质体（右）无荧光成像

cRGD-Gd-Cy5.5 纳米探针的 MR 弛豫测量

r1弛豫率是评价T1 MR造影剂成像性能的重要参数。因此，我们测量了具有不同 Gd 浓度的探针 cRGD-Gd-Cy5.5 的 T1 弛豫时间。如图 3b 所示，cRGD-Gd-Cy5.5 的 r1 弛豫率为 10.515 mM ^-1 s ⁻¹ 线性拟合后，远高于临床产品 Magnevist (4.56 mM ⁻¹ s ⁻¹ ）。 cRGD-Gd-Cy5.5的高r1弛豫率可能是载体脂质体特殊的空间结构和脂质体生物信号放大作用的结果。随着 Gd 浓度的增加，cRGD-Gd-Cy5.5 增强了 MR 信号强度（图 3a）。这些结果表明合成的cRGD-Gd-Cy5.5满足了MR成像对高图像对比度的需求。

cRGD-Gd-Cy5.5 纳米探针的弛豫特性。 一 T1- 这些粒子在不同浓度 (Gd) 下的加权图像（Siemens、Verio、3.0T、MOLLI，序列：TR =5.8 ms、TE =3.66 ms、TI =16–3200 ms）。 b Gd浓度与弛豫时间拟合曲线； cRGD-Gd-Cy5.5 的 r1 值为 10.515 mM ^-1 s ⁻¹

cRGD-Gd-Cy5.5 纳米探针的细胞毒性研究

通过 CCK-8 测定评估 cRGD-Gd-Cy5.5 的体外细胞毒性，并与未处理组中的细胞活力 (100%) 进行比较。在测试的 Gd 浓度范围内（50-400 μM），所有细胞的细胞活力均大于 70%（图 4），表明该分子探针具有良好的细胞相容性。值得注意的是，即使与 400 μM Gd 孵育 24 小时后，细胞活力仍高于 70%，该浓度大大高于体外和体内使用的剂量。

细胞毒性试验。人肺腺癌 (A549)、鼻咽癌细胞系 (SUNE-1-5-8F)、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和乳腺正常细胞系 (MCF10A) 与不同浓度的 cRGD-Gd- 孵育的细胞活力Cy5.5 24 小时

整合素αvβ3的免疫荧光染色和流式细胞术分析

免疫荧光结果显示整合素αvβ3在A549和5-8F细胞中的表达定位于细胞膜和细胞质中。 A549细胞的整合素主要位于细胞膜上，A549细胞表面的荧光强度高于SUNE-1-5-8F细胞。 MCF-10A 细胞的荧光强度极弱，表明乳腺上皮细胞表面几乎没有表达整合素 αvβ3（图 5a）。流式细胞术结果如图 5c 所示。整合素αvβ3表达水平排列如下：A549（89.07%）>SUNE-1-5-8F（63.84%）>MCF-10A（1.56%），说明癌细胞中αvβ3水平明显高于正常乳腺腺细胞。

A549、SUNE-1-5-8F 和 MCF-10A 细胞的共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 图像。 一 整合素 αvβ3 的细胞免疫荧光图像。 A549和SUNE-1-5-8F细胞系在细胞膜上表达，MC​​F-10A细胞几乎不表达整合素αvβ3。 b A549、SUNE-1-5-8F 和 MCF10A 细胞与 200 μg mL ^-1 的 cRGD-Gd-Cy5.5 一起孵育 在 37°C 下浓缩 1 小时。与细胞结合的探针量与细胞免疫荧光结果一致。 c 流式细胞术检测A549、SUNE-1-5-8F和MCF-10A细胞整合素αvβ3表达

cRGD-Gd-Cy5.5 的细胞摄取

根据免疫荧光染色结果，以cRGD-Gd-Cy5.5孵育的A549和5-8F细胞为实验组，cRGD-Gd-Cy5.5孵育的MCF-10A细胞为实验组。控制组。与cRGD-Gd-Cy5.5孵育后，在A549和5-8F细胞的细胞膜上均观察到红色荧光信号，A549细胞的信号强度高于SUNE-1-5-8F细胞的信号强度（图3）。 5b)。该结果与免疫荧光染色检测到的整合素αvβ3的表达一致。对照组MCF-10A细胞膜几乎未见红色荧光信号。

体外磁共振成像和荧光成像

基于其高r1弛豫率和良好的细胞相容性，cRGD-Gd-Cy5.5被用作体外癌细胞MR成像的阳性造影剂。如图 6a、b 所示，T1 加权 MR 图像的颜色逐渐变亮，表明用 cRGD-Gd-Cy5.5 处理的 A549 细胞的 MR 信号强度随着 Gd 浓度的升高而增加。两组间T1弛豫时间差异有统计学意义，如t所示 测试两个独立样本 (p <0.05)。这些数据表明合成的 cRGD-Gd-Cy5.5 有可能在癌细胞的体外 MR 成像中用作阳性造影剂。类似地，随着探针浓度的增加，小动物荧光系统的荧光强度也相应增加（图 6c）。从图像信号和具体数据来看，目标组（cRGD-Gd-Cy5.5）的成像效果优于非目标组（Gd-Cy5.5）。

细胞磁共振和荧光成像。 一 根据 Gd 浓度：0、0.005、0.01、0.02、0.04 和 0.08 (mM)，将细胞与 A549 细胞孵育 2 小时。 Gd-Cy5.5用作对照组。 b 相应磁共振图像的 T1 弛豫时间。 c 小动物活体成像系统图片

体内磁共振和荧光成像

在注射造影剂之前获得的 MRI 图像显示肿瘤和其他外周器官/组织之间没有显着的信号差异。注射 CRGD-Gd-Cy5.5 后 5 分钟，肿瘤部位的信号强度开始增强，但注射后 6 小时后仍保持稳定的高信号。在测试组中，从 30 分钟开始观察到强化的肿瘤实质，并且在 2 小时时强化增强（图 7a）。然而，受体阻断组仅在肿瘤边缘发现轻度强化，强化程度在2小时时减弱并已消失（图7a）。在荧光图像上，目标组的荧光强度从第 30 分钟开始逐渐增强，但在第 6 小时仍然很高（图 7b），表明血液循环延长，CRGD-Gd-Cy5.5 有效地集中在肿瘤。在受体阻断组中，在任何测试时间点均未观察到特定的探针浓度。在第 6 小时观察到双侧肾脏的高强度荧光（图 7b）。推测CRGD-Gd-Cy5.5的代谢途径可能是通过肾脏系统清除。

裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型的MR和荧光成像。 一 在注射前和注射后 0.5、2 和 6 小时，将裸鼠麻醉并用 3.0-T MRI 扫描仪成像。 b 注射后0.5、2、6小时对裸鼠进行麻醉并用荧光成像系统成像

讨论

整合素αvβ3不仅在肿瘤新生血管内皮细胞中高表达，而且在多种肿瘤细胞表面高表达，如恶性黑色素瘤、恶性胶质瘤、前列腺癌、肺癌和乳腺癌细胞[15]，而αvβ3在常规上皮细胞和成熟血管内皮细胞中不表达或以低水平表达。基于上述特性，整合素αvβ3已成为体内监测肿瘤转移的理想靶点[16]。然而，目前测量整合素αvβ3表达水平的方法仍存在无创性、可重复性和成像时效性等问题有待解决。针对上述客观问题，本研究合成了一种双模式分子探针，用于实时、动态监测整合素αvβ3的表达，间接达到预测和监测肿瘤转移的目的。

对比剂根据磁共振成像的机制可分为两类：Gd化合物（T1阳性对比剂）和顺磁性氧化铁纳米颗粒（T2阴性对比剂）。与其他造影剂相比，Gd化合物在临床实践中具有无可比拟的优势[17]。 Gd 离子是一种超顺磁性材料，可在 T1 加权图像中提供高强度信号。 Gd还可以与多种物质结合形成具有高空间分辨率和高信噪比的稳定复合物。然而，每种类型的造影剂都有其自身的局限性（即 T1 造影剂的血液循环时间短和 T2 造影剂的磁化伪影）[18,19,20,21]。传统的 Gd 化合物具有以下局限性。 (1) 传统的Gd螯合物没有靶向作用。 (2) Gd螯合物造影剂的信号强度低于相同浓度的超小超顺磁性氧化铁颗粒(USPIOs)。为解决上述问题，将Gd离子与大分子结构（如脂质体、树突分子、葡聚糖）连接以增强T1弛豫效应[22]，然后将复合物与肿瘤靶标的配体连接以制备分子探针并实现肿瘤靶向成像 [23]。在这项研究中，脂质体被选为将 MR 造影剂连接到荧光造影剂的载体分子。脂质体特殊的空间结构具有生物信号放大作用，有效提高局部组织中Gd离子的浓度，从而增强MR信号强度。周等人。 [24]采用β-环糊精连接的多面体低聚倍半硅氧烷（POSS）纳米粒子作为载体将RGD与Gd化合物偶联，成功获得分子探针cRGD-POSS-βCD-（DOTA-Gd），T1弛豫率为9.50 mM ⁻¹ S ⁻¹ .发现本研究中获得的脂质体-cRGD-Gd-Cy5 复合物的 T1 弛豫率为 10.515 mM ^-1 S ⁻¹ ，是目前临床使用的Gd剂（Magnevist）的T1弛豫率的两倍多，并且该复合物还表现出优异的MR成像性能。

本课题组制备的纳米探针尺寸均匀、外观规则、分散性好。 zeta 电位反映了分子探针的稳定性，zeta 电位的正值或负值越高，系统越稳定，聚集的可能性越小。一般而言，zeta 电位高于 + 30 mV 或低于 - 30 mV 的分子被认为具有良好的稳定性。本研究中获得的探针粒子表面的zeta电位为+ 39.5 ± 1.65mV，略低于+ 30mV。然而，在TEM下没有观察到聚集。

Gd剂是目前临床应用最广泛的MR造影剂，其生物安全性不容忽视。郭等人。 [25] 发现与树突状透明质酸偶联的 Gd 复合物是一种非常安全有效的微粒作为 MR 造影剂，具有高灵敏度和低残留在人体内的特点。通过对构建的分子探针体外细胞毒性的研究，证明该分子探针对肿瘤细胞以及非肿瘤细胞（上皮细胞和血管内皮细胞）具有低细胞毒性和高生物安全性。我们认为脂质体具有良好的生物相容性，低生物毒性可能是脂质体包裹Gd离子的一个好处。

在前期研究[26,27,28]的基础上，我组选择整合素αvβ3高表达的A549肺腺癌细胞系用于实验组，创新加入SUNE-1-5-8F鼻咽癌细胞株体外细胞靶向实验中的线；几乎不表达整合素αvβ3的乳腺上皮细胞作为阴性对照组。该分子探针与A549肺腺癌细胞和SUNE-1-5-8F鼻咽癌细胞的细胞膜结合良好，但不与MCF-10A细胞结合，表明该探针具有良好的分子靶向能力，免疫荧光检测结果证实了这一点。 MR成像结果进一步证实了脂质体cRGD-Gd-Cy5.5分子探针在MR中的靶向特性，在肿瘤细胞中信号强度高于非靶向造影剂（Gd-Cy5.5）。体内实验证实，探针可以在血清中保持稳定并持续靶向肿瘤部位至少 6 小时。体外研究的结果为后续在裸鼠鼻咽癌转移模型中分子探针的体内研究提供了保证。

结论

综上所述，该双模式探针cRGD-Gd-Cy5.5靶向整合素αvβ3的制备方法是可行的，该探针具有良好的稳定性和生物安全性以及较高的T1弛豫率。该探针对整合素αvβ3高表达的细胞表现出很强的靶向作用，为通过MR/荧光分子成像在解剖水平和分子代谢水平上无创、高效、实时动态监测肿瘤转移奠定了坚实的基础。体内。

方法

cRGD-Gd-Cy5.5的合成

向20mL氯仿、70mg卵磷脂、20mg胆固醇和210mg DSPE-PEG2000-NH中加入混合物，将混合物置于超声波清洗器中使物质完全溶解（如透明溶液所示，不含颗粒状物质）。然后将溶液置于梨形烧瓶中，在 60°C 水浴中旋转蒸发，直至形成蜂窝状薄膜（无液体残留）。精确称取三氯化钆六水合物（10mg），溶解在pH值为8.5的碳酸盐缓冲液中，得到澄清溶液，然后与上述蜂窝状薄膜混合，在50℃下水合1小时；该步骤之后通过超声波液体处理器（VCX 750，Sonics，USA）中的超声波探头进行分散和精制。最后，收集混合物并通过0.22-μm过滤器，用10-kD超滤管进行超滤以去除游离的三氯化钆，得到携带三氯化钆的脂质体，然后在4℃下储存。

然后将 RGD 环肽与荧光 Cy5.5 分子偶联。将 RGD 环肽 (5 mg) 溶解在 1 mL 稀盐酸缓冲液中，pH 为 5.0，1 mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 和 0.5 mg N 加入-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，然后在恒温振荡器中室温活化 30 分钟。然后将活化的 RGD 环肽分子与 100 μg Cy5.5 荧光分子和脂质体混合，使用精密 pH 试纸测得 pH 值为 8.4。然后将混合物在室温下在振荡器中孵育 4 小时；此步骤之后通过使用10-kD超滤管去除未反应的RGD环肽和荧光Cy5.5分子。

纳米粒子的表征

纳米颗粒的粒径通过 TEM (GEOL Tokyo, Japan) 测定。将少量脂质体-cRGD-Gd-Cy5.5 复合物加入超纯水 (pH =6.0) 以稀释成 1 mg/mL 溶液。用无菌移液管将一滴样品置于有涂层的铜网上，几分钟后滴加2%磷钨酸钠复染。 1-2 分钟后吸出过多的阴性染色溶液。然后将铜栅干燥并置于 80 kV 透射电子显微镜下观察。随机选取约 40 至 50 个纳米粒子观察其形态和粒径，并保存 50-nm 和 100-nm 尺度的图像。粒径采用NanoMeasure软件测量，3次重复测量取平均值。

使用粒度分析仪（Malvern，UK）测量纳米颗粒的流体动力学尺寸和 zeta 电位。将一滴脂质体-cRGD-Gd-Cy5.5 复合溶液用超纯水稀释，然后转移到 Eppendorf 管中，将其置于超声波清洗器中 5 分钟，使颗粒分散均匀。在纳米粒度分析仪中通过DLS对分散的颗粒进行评估，以确定粒径和zeta电位。

使用多功能酶标仪（BioTek，美国）表征脂质体 cRGD-Gd-Cy5.5 复合物的光学特性。将脂质体溶液和脂质体-cRGD-Gd-Cy5.5 各 2 微升加入 998 μL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 缓冲液中并充分混合，然后加入石英试管中；然后通过多功能酶标仪获得 400-800 nm 的紫外吸收。将脂质体-cRGD-Gd-Cy5.5复合物(1.5mL)溶液转移至Eppendorf管中，等量空脂质体溶液作为空白对照。采用小动物荧光成像系统进行荧光成像。

使用 FT-IR 光谱（Nicolet-5700，美国）确认了脂质体表面氨基的修饰。获得紫外-可见吸收光谱（UV 2550，Shimadzu，Japan）；浓度为 0.1 mg/mL 的脂质体 cRGD-Gd-Cy5.5 用于测量。

测量松弛率

用去离子水稀释载有 cRGD 修饰的 Gd 的脂质体荧光探针样品以获得以下 Gd 浓度：0.18、0.1275、0.085、0.0425 和 0.017 mM。将每个稀释样品5毫升放入带螺旋盖的小瓶中，然后将小瓶按照浓缩的顺序固定在多功能管架上。 cRGD 修饰的载有 Gd 的脂质体荧光探针样品通过头颈部线圈进行 MR 扫描，以获得不同浓度探针的 T1 加权图像。用于 T1 加权图像的扫描序列是修改后的 Look-Locker 反演恢复 (MOLLI) 序列，其中参数设置如下：重复时间 (TR) =5.8 ms，回波时间 (TE) =3.66 ms，反演恢复时间 (TI) =16–3200 ms，扫描厚度 =5 mm。扫描完成后，得到一张伪彩色图。 0.3 厘米 ² 在图中每个样本的图像中划定感兴趣区域，并读取相应的T1值。

细胞培养和细胞毒性分析

A549 人肺腺癌细胞、SUNE-1-5-8F 人鼻咽癌细胞、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和 MCF-10A 人乳腺上皮细胞获自美国典型培养物保藏中心 (ATCC, Manassas, VA) .细胞在含有 10% 胎牛血清 (Euroclone-Lonza)、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 2 mM 谷氨酰胺的 1640 完全培养基 (Euroclone-Lonza) 中于 37°C 下在 5% CO2 下培养。

CCK-8方法用于检测分子探针对不同细胞的细胞毒性，包括正常上皮细胞和肿瘤细胞。 A549细胞、5-8F细胞、HUVECs和MCF-10A细胞以5 × 10 ³ 的密度接种于96孔板中 细胞/孔并培养过夜。然后将贴壁细胞与 100 μL 含有不同 Gd 浓度（0、50、100、200 和 400 μM）的 cRGD-Gd-Cy5.5 的新鲜 1640 培养基孵育 24 小时。 Subsequently, the cells were washed three times with PBS and then incubated with 100 μL of Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing no fetal bovine serum (FBS). After 10% Cell Counting Kit-8 reagent (Dojindo, Japan) was added to each well, the sample was incubated for 10 h. The absorbance at 450 nm of each well was then measured using an ELISA microplate reader (Multiskan MK3, Thermo Scientific, Logan, UT). Cells treated with PBS only were employed as the control group. For each sample, five parallel wells were analyzed to obtain the mean and standard deviation.

Immunofluorescence Staining and Flow Cytometry Assay of Integrin αvβ3

A total of 20,000 A549, 5-8F, and MCF-10A cells each were seeded in confocal plates (Thermo Scientific) and cultured for approximately 24 h when the cells successfully grew on the slides. The cells were washed three times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (Boster) at room temperature for 30 min, and then washed three times (10 min each) in PBS. The cells were then incubated in 3% bovine serum albumin (PBST) for 30 min to block non-specific antibody binding and washed three times with PBS. The fixed cells were incubated with anti-integrin αvβ3 monoclonal antibody (1:500; Abcam, Cambridge, UK) at 4 °C overnight and then incubated with anti-mouse fluorescent secondary antibody (1:500) (Abcam) for 1 h. 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000; Sigma) was used to stain the nucleus. A laser confocal scanning microscope (Nikon A1, Tokyo, Japan) was used to detect the green fluorescence signal from integrin αvβ3 and the DAPI signal from nuclei.

The integrin αvβ3 expression levels in different cell lines were quantified using flow cytometry. In brief, three types of cells were collected:A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A, which were washed in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA). After being sealed with the PBS containing 5% BSA, the cells were cultivated in VNR-1 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) at density 2 μg/1 × 10 ⁶ and 4 °C for 30 min. The secondary antibody was DyLight 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (ab96879), diluted 1/500, and at 22 °C for 30 min. Quantitative assays were conducted on a flow cytometer (Gallios, Beckman Coulter, USA) at excitation wavelength 488 nm and emission wavelength 530 nm. Each time, at least 1 × 10 ⁵ cells (n  = 3) were collected.

Binding Assay of the Molecular Probe to Integrin αvβ3

A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A cells were inoculated into confocal plates. The cells were incubated at 37 °C for 1 h with the molecular probe of the same Gd concentration after the cells reached the logarithmic growth phase. The cells were then washed three times in PBS and placed under a laser confocal scanning microscope for observation.

In Vitro MR Imaging and Fluorescence Imaging of Tumor Cells

To verify the tumor cell-targeting ability of the cRGD-modified Gd-loaded liposomal fluorescent probe, the probe was incubated with A549 cells and then examined using MR imaging and a small animal fluorescence imaging system. A549 cells were seeded in six-well plates with 2 mL of 1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin–streptomycin in each well and then incubated at 37 °C and 5% CO2. In the experimental groups, cRGD-Gd-Cy5.5 was incubated with A549 cells for 2 h with Gd concentrations of 0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.08 mM. The cells of the control groups were incubated with the non-targeted gadolinium contrast agent (Gd-Cy5.5) for 2 h at the same Gd concentrations as the experimental groups. The cells were then washed with PBS, trypsinized, centrifuged, and finally placed in glass tubes containing 1 mL of PBS (with 0.5% agarose) for MR imaging. Specific imaging parameters were described above. A small animal live imaging system (IVIS Lumina XRMS Series III, MA, USA) was used for fluorescence imaging of the A549 cells.

In Vivo MR and Fluorescence Imaging

To validate whether CRGD-Gd-Cy5.5 had tumor targetability in vivo in animals, we conducted animal experiments following the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, released by the Animals Ethics Committee of Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. We successfully established a Balb/c nude mice nasopharyngeal carcinoma subcutaneous xenografting tumor model for magnetic resonance/fluorescent scanning. A 3.0-T MRI scanner containing 40-mm-diameter mouse volume coils (Discovery 750, GE, Germany) was used for T1-weighted imaging, operated at field of view = 80 × 80 mm, repetition time = 742 ms, echo time = 69 ms, and layer thickness = 2.0 mm. The nude mice were divided into two groups (n  = 3), including a test group and a receptor-blocked group. All mice were injected via tail vein with CRGD-Gd-Cy5.5 (0.05 mmol Gd/kg). Each mouse was scanned at four time points:before injection, 30 min, 2 h, and 6 h after injection. In the receptor-blocked group, 1 h before injection with CRGD-Gd-Cy5.5, each mouse was injected via the tail vein with free CRGD polypeptide (10 mg) and was MRI-scanned at the same four time points. The fluorescent images were photographed by a fluorescence imaging system (Bruker, USA). The grouping, drug injection, and scanning time points were all the same as described above. During the imaging, the mice (n  = 3) were anesthetized using a gas mixture of oxygen and isoflurane. The nude mice were kept at heart rate 60–120/min and respiratory rate at 20–40/min. Finally, direct visual comparison of tumor images was conducted by two experienced radiologists.

缩写

DLS:

动态光散射

DMEM：

Dulbecco’s modified Eagle medium

ECM:

Extracellular matrix

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride

FBS：

Containing no fetal bovine serum

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cells

MOLLI:

Modified look-locker inversion

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

PEG:

Polyethylene glycol

RGD:

Arginine–glycine–aspartate

TE:

Echo time

TEM：

透射电子显微镜

TI:

Inversion recovery time

TR:

Repetition time

USPIOs:

Iron oxide particles