金纳米颗粒调控人肝细胞癌细胞中 CYP3A4 活性与细胞毒性：粒径、表面化学与蛋白质冠层的影响

摘要

本研究探讨 40 nm 和 80 nm 金纳米颗粒 (AuNP) 经阳离子支化聚乙烯亚胺 (BPEI)、阴离子硫辛酸 (LA) 或中性聚乙二醇 (PEG) 官能化后，在有人血浆蛋白冠层 (PC) 与无蛋白冠层条件下，与人肝细胞癌 (HCC) 细胞系 C3A 的相互作用。除 80 nm LA-AuNP 外，裸 AuNP 均对 C3A 细胞有细胞毒性，但蛋白冠层显著减轻毒性。40 nm BPEI-AuNP 随时间细胞摄取增加，而蛋白冠层降低 80 nm PEG-AuNP 摄取。BPEI-AuNP 引发双相氧化/亚硝酸应激响应，PEG-AuNP 表现为强抗氧化剂。所有裸 AuNP 无论粒径表面电荷均抑制 CYP3A4 活性，蛋白冠层可恢复活性，除 PEG-AuNP 外。40 nm PEG-AuNP 主要诱导线粒体脂肪酸 β-氧化相关基因表达变化，次要影响肝脏外排/摄取转运体。研究深化了对 AuNP-细胞相互作用及其在 HCC 中分子机制的理解，为改进治疗策略提供洞见。

研究背景

肝细胞癌 (HCC) 仍是全球最高发癌症之一，且是美国癌症死亡率增长最快的原因。根治方案——肝移植或手术切除——仅限早期，晚期依赖化疗或放疗，但选择性低、系统毒性大。基因沉默疗法，特别是 RNA 干扰 (RNAi)，承诺更高特异性，但高效递送需安全穿透靶细胞的载体。病毒载体转导效率高，但非病毒平台如纳米颗粒 (NP) 因安全性好和理化性质可调而更受青睐。金纳米颗粒 (AuNP) 因易于表面修饰和光学特性，成为靶向递送治疗货物的热门选择。然而进入血液后，AuNP 会吸附蛋白质形成蛋白冠层 (PC)，改变表面化学进而影响生物学命运，包括细胞摄取和毒性。理解 NP 粒径、表面电荷和 PC 如何在 HCC 细胞中调节细胞响应，对设计安全有效的纳米药物至关重要。

实验方法

金纳米颗粒合成

40 nm 和 80 nm AuNP 由 nanoComposix (San Diego, CA) 定制制备。BPEI、LA、PEG 官能化分别通过 EDC 化学、二氢硫辛酸偶联、巯基-甲氧基 PEG 化实现。粒径、多分散指数 (PDI)、Zeta 电经动态光散射 (DLS)、透射电镜 (TEM)、UV-Vis 光谱确认。AuNP 经切向流过滤 (TFF) 纯化并无菌过滤。

蛋白冠层制备

人血浆 (n=5，Biological Specialty Corp., Colmar, PA) 与 AuNP 按 55% (v/v) 混合，37 °C、250 rpm 孵育 1 h。重复 PBS 洗涤 (20,000×g, 20 min) 去除弱结合蛋白。所得 PC 包被 AuNP 重悬 PBS 后稀释入细胞培养基。

AuNP 理化表征

在 DI 水、PBS、完全 EMEM (10% FBS) 中于 25 °C 和 37 °C (0 h 和 24 h) 测量裸与 PC 包被 AuNP 的水动力直径 (D_H)、PDI、Zeta 电位。室温记录光吸收光谱。

透射电镜

TEM (Tecnai G2 Spirit BioTWIN, 120 kV) 评估 AuNP 形貌。样品滴加于 200 目铜网自然干燥。

细胞培养与活力测定

C3A 细胞 (ATCC CRL-10741) 培养于 EMEM + 10% FBS，96 孔板种 8×10⁴ 细胞/孔，贴壁 48 h 后给药。暴露 AuNP 浓度 0–250 µg/cm² 24 h 后用 alamarBlue® 法测活力。

ICP-MS 测定细胞摄取

细胞用 1.56 µg/cm² AuNP 处理 0.5–24 h。经蚀刻步骤除表面吸附颗粒后，王水消化，ICP-MS 定量细胞内 Au，以 AuNP/细胞表示摄取量。

氧化/亚硝酸应激测定

用总 ROS/SO 试剂盒 (Enzo Life Sciences) 在暴露 40 nm BPEI- 和 PEG-AuNP (高达 125 µg/cm²) 后 1、3、24 h 量化 ROS/RNS 产生。

细胞色素 P450 3A4 活性

用 P450-Glo™ 测定套件 (Promega) 在暴露各 AuNP 类型 LC₅₀ 浓度 24 h 后评估 CYP3A4 活性。发光值归一化至对照组。

基因表达谱分析

鉴于 40 nm PEG-AuNP 效应显著，用其 LC₅₀ (129.5 µg/cm²) 处理 C3A 细胞 24 h。总 RNA (RIN ≥ 7.8) 分离、逆转录，用 Human Molecular Toxicology Pathway Finder 和 Human Drug Transporters RT² Profiler™ PCR 阵列 (Qiagen) 分析。差异表达基因 (|fold change| > 2, p < 0.05) 经 qRT-PCR 验证 9 个代表基因。

统计分析

LC₅₀ 用 GraphPad Prism 变斜率 Hill 方程拟合。单因素方差分析 (SAS 9.4) 后接 Tukey HSD 检验，p < 0.05 为显著。

结果与讨论

裸与 PC 包被 AuNP 理化表征

图 1 显示 TEM 确认单分散 AuNP，粒径与标称 40、80 nm 吻合。PC 形成导致水动力直径适度增加、UV-Vis 等离子体峰红移，表明蛋白吸附。完全 EMEM 中 24 h DH 和 PDI 稳定，除 PC-BPEI-AuNP 显示 PDI 瞬时下降，提示胶体稳定性增强。PC 包被后 Zeta 电位向中性漂移，反映蛋白掩蔽表面电荷。

AuNP 细胞毒性

裸 AuNP LC₅₀ 范围 127.3–205.5 µg/cm² (图 2a)。所有 40 nm BPEI-、LA-、PEG-AuNP 及 80 nm BPEI-AuNP 均有细胞毒性，而 80 nm LA-AuNP 无显著毒性。PC 显著降低大多数 AuNP 毒性，唯 80 nm BPEI-AuNP 在 250 µg/cm² 下仍保留 51% 活力 (图 2b)。这与前人报道 PC 减弱 AuNP 在原代肝细胞等细胞系中毒性一致 [7–9]。

AuNP 细胞内摄取

时间依赖性摄取分析 (图 3) 显示：40 nm BPEI-AuNP 快速累积，6 h 峰值后下降。相反，PC 减弱 40、80 nm BPEI- 和 LA-AuNP 摄取，却增强 80 nm PEG-AuNP 内化。文献亦报道 PC 可视 NP 粒径、表面化学、细胞类型阻碍或促进内化 [8, 9, 33]。

氧化与亚硝酸应激测量

两种 AuNP 均以时间和浓度依赖方式诱导 ROS/RNS (p<0.0001)。高浓度 40 nm BPEI-AuNP 产生双相响应：1 h 初期抗氧化，3 h 及以后明显促氧化激增。相比之下，40 nm PEG-AuNP 全时间点持续抑制 ROS/RNS 产生 (fold change <0.5)，提示保护性抗氧化角色 (图 4)。

CYP3A4 活性测定

所有裸 AuNP (40、80 nm BPEI、LA、PEG) 在 LC₅₀ 浓度下将 CYP3A4 活性抑制至对照 20–31% (图 5)。无毒浓度的 80 nm LA- 和 PEG-AuNP 亦抑制活性 (~30%)。PC 大体恢复所有 AuNP 的 CYP3A4 活性，唯 PEG-AuNP 例外，40 nm 和 80 nm 分别保留 63% 和 46% 活性。结果佐证前人报道 AuNP 通过直接酶相互作用或底物口袋阻断抑制 CYP3A4 [7, 25]。

40 nm PEG-AuNP 毒性通路聚焦基因表达谱

基因芯片分析在 40 nm PEG-AuNP LC₅₀ 下鉴定 212 个差异表达基因 (186 下调、26 上调) (图 6)。值得注意的是 12.3% 基因涉及线粒体脂肪酸 β-氧化，关键酶 (ACAD11、ACAD9、ACADM、ACADS、ACAA1、ACAA2、DECR1、ECHS1、EHHADH、HADHA) 显著下调 (fold change 2–18)。β-氧化酶下调意味着 NADH/FADH₂ 产生受损，进而损害三羧酸循环和 ATP 合成，这是 AuNP 处理肝细胞线粒体功能障碍的标志 [7–9]。

凋亡基因 (CASP3、CASP7、CASP9、TNFRSF10A/B、TNFSF10) 上调，抗凋亡基因 (AKT1、BCL2、MCL1、XIAP) 下调，与观察到的剂量依赖性细胞毒性一致。DNA 损伤修复检查点 (CHEK1/2、ERCC1/2/3、LIG4) 混合调控，提示基因组完整性受损。热休克蛋白 (HSPA1A/B) 上调，HSP40/90/60 亚家族下调，反映复杂应激响应。抗氧化基因 (GPX1/2/4、PRDX1/2/6、SOD1、CAT) 上调，促氧化基因 (TXNIP、PPP1R15B) 下调，与 PEG-AuNP 抗氧化表型吻合。

药物摄取与外排转运体基因表达谱

PC 诱导的药物转运体调控进一步凸显潜在药代动力学影响。35 个转运体基因中，12 个 ABC 转运体下调 (如 ABCB1、ABCC2/3/4、ABCG2/8、ABCA1)，21 个 SLC 转运体受抑 (如 SLC31A1、SLC22A9)。反之 MDR4 (ABCB4) 和线粒体 ABC 转运体 (ABCB6) 上调，指示对纳米颗粒暴露的代偿响应。这些变化可能影响化疗药物胞内浓度，联合用药时需审慎考量。

实时 PCR 验证 9 个选定基因确认芯片结果，强化转录组数据可靠性。

结论

本研究表明 AuNP 表面化学和人血浆蛋白冠层的存在关键决定其在 C3A HCC 细胞中的细胞毒性、细胞摄取、氧化应激谱、CYP3A4 抑制及基因表达变化。裸 BPEI- 和 LA-AuNP 高毒性，PEG-AuNP 展现抗氧化性但仍抑制 CYP3A4。PC 大体缓解毒性和 CYP3A4 抑制，除 PEG-AuNP 保留显著效应外。40 nm PEG-AuNP 基因表达分析揭示线粒体脂肪酸 β-氧化酶主导下调、凋亡基因上调、药物转运体广泛调控，为肝毒性机制及药物-纳米颗粒相互作用提供洞见。研究强调设计 AuNP 基治疗药物用于 HCC 时必须考虑蛋白冠层形成和表面官能化。

缩略语

ANOVA

单因素方差分析

AuNP

金纳米颗粒 bare: 无 PC

BPEI

支化聚乙烯亚胺

CYP

细胞色素 P450

D_H

水动力直径

DLS

动态光散射

EDTA

乙二胺四乙酸

EMEM

Eagle 基础必需培养基

HCC

人肝细胞癌

HPTC

人肾近端小管细胞

HSD

Tukey 诚实显著差异检验

HUVEC

人脐静脉细胞

ICP-MS

电感耦合等离子体质谱

LA

阴离子硫辛酸

LC₅₀

中位致死浓度

MDR

多药耐药

NP

纳米颗粒

PBS

磷酸盐缓冲液

PC

人血浆蛋白冠层

PDI

多分散指数

PEG

中性聚乙二醇

RNAi

RNA 干扰

RNS

活性氮物种

ROS

活性氧物种

SO

超氧阴离子

TEM

透射电子显微镜

TFF

切向流过滤