环保微等离子体合成黄光发射碳量子点：癌细胞成像与光催化失活双功能

摘要

近年来，兼具诊断与治疗功能的多功能纳米颗粒在纳米医学中展现巨大前景。本研究报道利用微等离子体技术，以邻苯二胺为碳源，环保合成荧光碳纳米点（碳量子点，CQDs）。所制CQDs在380–500 nm呈宽吸收峰，发射峰值在550 nm处的亮黄色荧光。CQDs被HeLa癌细胞快速摄取；蓝光激发下高效产生亮黄色荧光信号与强烈活性氧（ROS），实现荧光癌细胞成像与光动力失活同步进行，相对细胞活力下降40%。黑暗中孵育400 μg mL⁻¹ CQDs后约98%细胞存活，显示优异生物相容性。新制CQDs被证明为体内生物成像及成像引导癌症治疗的高效安全候选材料。

引言

癌症仍是全球主要死因之一。兼具诊疗功能的多功能纳米颗粒在纳米医学应用前景广阔。同步图像引导治疗是癌症治疗新概念，能提供肿瘤大小位置、光疗最佳时间窗、治疗疗效等信息，极大优化治疗效率。光动力疗法（PDT）凭借时空选择性和非侵入性治疗多种癌症及疾病。理想光敏剂需具备：高效产生ROS、良好生物相容性、水溶性。但现有PDT应用受限于光敏剂水溶性差、稳定性差、激发波长不佳。亟需环保低成本方法制备水溶性好、生物相容性佳的光敏剂替代品。

碳量子点（CQDs）因合成简便环保、低毒性、优异生物相容性、水溶性好、光稳定性高等独特优势备受瞩目。CQDs在细胞成像、生物传感、靶向给药等生物医学领域潜力巨大。合成路线分自上而下（电化学氧化、激光烧蚀、化学氧化、超声法）和自下而上（水热法、微波法、热分解法）。但高温高压强酸条件导致能耗大、工艺复杂、环境危害不可避免。因此环保合成方法应运而生。微等离子体-液相法可在几分钟内合成CQDs，无需高温、大能量输入、繁琐步骤。微等离子体提供独特理化环境：高度非平衡、储能、产生大量电子、离子、自由基、激发电离活性物种。虽邻苯二胺是碳纳米点合成原料，但未用于微等离子体合成。

本研究用邻苯二胺为原料，经微等离子体处理合成CQDs。所得CQDs粒径均一（~3.2 nm），发射峰~550 nm。证明新合成CQDs光照下大量产生ROS。体外实验中，CQDs被HeLa细胞摄取，420–500 nm蓝光激发发黄光，低毒性；460 nm照射下观察到HeLa细胞失活。结果提示新制CQDs有望用于体内生物成像、成像引导或靶向癌症治疗。

结果与讨论

CQDs表征

本研究采用微等离子体法，以邻苯二胺为碳前驱体，简易环保制备黄光发射CQDs。图1A TEM图像显示颗粒呈环状或椭圆形，平均直径3.2 nm。高分辨率插图晶格间距0.21 nm，对应石墨(1,1,0)晶面。拉曼光谱（图1E）D峰（无序诱导模）~1342 cm⁻¹，G峰~1507 cm⁻¹，分别源于sp³和sp²杂化碳。ID/IG比值(0.77)反映石墨微晶尺寸与无序度。FTIR（图1F，400–4000 cm⁻¹）显示CQDs主要含胺基(3052, 3324 cm⁻¹)、羟基(3200 cm⁻¹)、羰基(1595 cm⁻¹)、C-N/C-O(1200 cm⁻¹)、C=C(1500 cm⁻¹)、C-H(748 cm⁻¹)官能团。XPS全谱（图2A）显示C 1s(285 eV)、N 1s(400 eV)、O 1s(531 eV)三特征峰。高分辨XPS（图2B-D）：C 1s解析为sp²/sp³碳(284.8 eV)、氮氧化碳(285.9 eV)、羰基碳(287.7 eV)；N 1s解析为吡咯氮(399.3 eV)、石墨氮(400.3 eV)、氨基氮(401.7 eV)；O 1s含C-O(531.6 eV)、C=O(533.1 eV)。这些官能团赋予CQDs良好溶解性。

光学性质：荧光发射谱（图1C）显示激发依赖性发射行为，400–500 nm激发下最大发射峰从473 nm红移至519 nm，荧光强度急剧下降。UV-Vis吸收谱（图1D）在400–490 nm有强吸收峰，特征吸收峰在280 nm(π-π*芳香C=C)和420 nm(n-π*羧基/C-N)。这些光学性质为同步生物成像与光动力失活提供可行性。

CQDs生物成像与细胞毒性

用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究CQDs在HeLa细胞成像与标记能力。HeLa细胞经200 μg mL⁻¹ CQDs孵育6 h后CLSM检测：细胞内均匀分布亮黄色荧光（图3A）。低浓度(200 μg mL⁻¹)即可实现黄光标记，进一步证明CQDs细胞成像潜力。碳纳米颗粒通常仅蓝光区强发射，长波发射弱；UV激发下生物组织常有蓝色自发荧光且易受光损伤，严重阻碍短波发射碳纳米颗粒生物成像应用。因此长波发射碳纳米颗粒开发备受关注。本研究CQDs在400–450 nm激发下发亮黄光，有望用于深层肿瘤检测，但距人体癌症成像实际应用仍有漫漫长路。

生物相容性与低毒性是CQDs作生物标记试剂的前提。MTT法检测细胞毒性：HeLa细胞用0–400 μg mL⁻¹ CQDs处理24 h，存活率>95%（图3B），表明CQDs几乎无毒。新生成黄光发射CQDs低细胞毒性、高生物相容性，促进其生物成像应用前景。

光动力疗法疗效

癌细胞失活

图3C显示：单独CQDs或蓝光处理HeLa细胞活力无显著差异；CQDs联合蓝光显著降低活力，呈照射时间依赖性。460 nm照射15 min后，200 μg mL⁻¹ CQDs使HeLa细胞活力下降约40%。MTT法测定激发CQDs对HeLa细胞半最大抑制浓度（IC₅₀）：10 min照射后IC₅₀约427.5 μg mL⁻¹(95% CI 366.7–498.7)；15 min照射后约255.1 μg mL⁻¹(95% CI 220.9–249.8)。激发CQDs能有效杀伤肿瘤细胞，效果媲美临床抗癌药物(如Photofrin)，凸显CQDs在成像引导抗肿瘤治疗中的应用价值。

CQDs ROS生成机制

PDT中，内吞光敏剂在适当照射下产生细胞毒性ROS杀伤癌细胞。ROS通过凋亡或坏死失活靶细胞，副作用小。图4A显示ROS试剂发红光，指示ROS生成；红色ROS信号与CQDs荧光良好重叠，说明ROS生成与CQDs被肿瘤细胞摄取密切相关。图4B：对照组和无激光组对比，460 nm激光照射15 min实验组显著产生ROS。结果表明CQDs在460 nm激光照射下显著促进细胞内ROS产生，具PDT应用潜力。原理上（图4C简化能级图）：CQDs从基态(S₀)跃迁至激发态(Sₙ)，效率取决于光源强度和消光系数；溶剂介导弛豫后停留第一单线激发态最低振动能级(S₁)；快速振动弛豫致发射光子能量低于激发光子，波长红移；荧光成像利用S₀→Sₙ→S₁跃迁。CQDs被HeLa细胞摄取，适当波长光照发荧光标记细胞。S₁可经荧光回基态或系间窜跃至非荧光三线激发态(T₁)。T₁电子转移反应活性高，生成超氧自由基导致荧光基团降解；T₁能量转移给分子氧产生单线态氧(比基态氧氧化性强)；超氧自由基、单线态氧及OH、H₂O₂等ROS与生物分子反应产生光毒性致细胞死亡。CQDs进入HeLa细胞后，光照致单线态经系间窜跃转三线态，能量转移产生ROS最终导致细胞死亡。适当波长下CQDs发生两类能量转移：发荧光标记肿瘤细胞，ROS杀伤肿瘤细胞。实验数据证实新制CQDs黑暗中生物相容性好、光照下肿瘤杀伤效率高，可作为肿瘤细胞及组织光敏剂。

此外，CQDs如何精准靶向肿瘤、更有效杀伤肿瘤细胞仍待解决。丰富表面亲水官能团(羧基、羰基、环氧基、羟基等)使碳点可偶联特异性抗体精准靶向肿瘤(需肿瘤特异性生物标志物)；高比表面积使碳点可作药物/基因递送工具。考虑到优异生物相容性、利于肿瘤细胞内化的小尺寸、丰富表面官能团及生物成像潜力，碳点(含CQDs)被认为是肿瘤治疗诊断一体化候选材料。但碳点在纳米医学与生物成像应用中仍存挑战与未解难题，未来需更多努力推动碳点相关纳米医学从实验走向临床。

结论

本研究利用微等离子体法，以邻苯二胺合成发光CQDs。蓝光激发下，~3.2 nm CQDs发黄光荧光。拉曼、UV-Vis、FTIR、XPS显示更多碳原子参与sp²杂化形成新有机基团。等离子体法合成CQDs作为细胞成像有效探针，黄光荧光清晰标记HeLa细胞。合成CQDs溶解性好、无毒、高生物相容性，加速生物成像应用。激发CQDs通过ROS生成有效杀伤HeLa细胞，展现满意的体外光动力细胞毒性，支持其PDT应用。

实验方法

碳量子点合成

微等离子体处理系统见附件图S1。内径180 μm空心不锈钢管连接高压直流电源(天津东文高压电源)，管口距液面2 mm。铂电极(DJS-1，上海仪电科学仪器)连接阴极浸入溶液。400 mg邻苯二胺(上海)溶于40 mL去离子水，取20 mL加入培养皿磁力搅拌。微等离子体处理时氩气(Ar)流速60 sccm，直流电流保持17 mA。10 min等离子体处理后，棕黑色产物用透析膜(分子量截留500 Da)对2 L去离子水透析12 h，再经0.22 μm超滤膜过滤，冻干得纯CQDs。

CQDs结构、组成与光学性质表征

尺寸形貌：TEM(JEM-2100F，JEOL，东京)；荧光光谱：Perkin Elmer LS 55荧光光谱仪(沃尔瑟姆，美国)；UV-Vis吸收：Varian Cary 50分光光度计(帕洛阿尔托，美国)；FTIR：Nicolet 6700光谱仪(赛默飞，沃尔瑟姆)；拉曼：800 UV微拉曼光谱仪(Invia-reflex，英国)；XPS：Axis Ultra DLD系统(岛津/克拉托斯，京都)。

细胞培养与细胞毒性实验

HeLa细胞(ATCC，马纳萨斯，美国)在含10% FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM中培养(37 ℃，5% CO₂，饱和湿度)。细胞毒性：96孔板播种6000细胞/孔，200 μL完全培养基，24 h后加入0、25、50、100、200、400 μg mL⁻¹ CQDs再培养24 h，MTT法检测细胞活力。简述：更换100 μL MTT测试液(0.5 mg mL⁻¹)暗培养4 h，弃上清，DMSO溶解结晶，490 nm测吸光度，以无CQDs对照为100%活力。IC₅₀测定：96孔板细胞孵育0–6400 μg mL⁻¹ CQDs 24 h，分别460 nm照射10 min或15 min，再培养24 h，MTT法检测活力评估IC₅₀。

细胞成像

2×10⁴ mL⁻¹细胞播种共聚焦皿(直径15 mm)，24 h培养，PBS洗两次去死细胞。加入200 μg mL⁻¹ CQDs溶液(pH 7)孵育6 h，PBS洗三次去未结合CQDs，4%多聚甲醛固定。CLSM(LSM510，蔡司，德国)在400–450 nm激发下观察。

光动力疗法与ROS检测

抗肿瘤效果：HeLa细胞孵育200 μg mL⁻¹ CQDs 24 h(37 ℃，暗)，460 nm(30 mW cm⁻²)照射5/10/15 min，再孵育24 h，MTT法测相对活力。细胞内ROS化学检测：荧光素酶细胞内ROS检测试剂盒(西格玛，美国)。共聚焦皿贴壁过夜，孵育200 μg mL⁻¹ CQDs 4 h，加100 μL/孔主反应混合液，1 h后4%多聚甲醛固定10 min，CLSM观察荧光图像。ROS产生量检测：96孔板培养细胞，24 h后更换0、100、200 μg mL⁻¹ CQDs溶液100 μL/孔再孵育4 h，PBS洗三次，照射15 min或不照射，加100 μL/孔主反应混合液1 h，荧光读数仪检测(520 nm激发，605 nm发射)。

统计分析

实验重复三次，SPSS 19.0统计分析。两组比较用Mann-Whitney U检验。激发CQDs对HeLa细胞IC₅₀用非线性回归评估。P<0.05为统计学显著差异。