无配体铱纳米粒子的简便合成及其体外生物相容性

背景

贵金属纳米粒子因其有趣的光学、电子和表面催化特性而成为新兴纳米技术的支柱。在纳米医学中，这些独特的生物材料由于能够通过表面修饰来定制其生物相互作用以用于广泛的应用而引起了极大的关注 [1]。金纳米粒子 (AuNPs) 已被广泛研究用于传感和治疗应用 [2, 3]，而其他贵金属，包括银，已经发现了特殊用途，例如抗微生物剂 [4]。然而，由铂类元素组成的纳米粒子通常因其表面催化特性而被采用 [5]，尚未对生物医学应用进行彻底检查。这些元素卓越的表面稳定性和已知的生物相容性，以及它们在纳米尺度上潜在的新型物理特性，使其成为 AuNPs 的独特替代品。

高能辐射广泛用于医学，包括诊断成像和放射治疗。因此，与辐射相互作用的功能材料，如高原子序数和高密度纳米粒子，可以提高这些模式的性能。迄今为止，大多数化学和工程研究都集中在 AuNPs 以增强辐射相互作用，尽管已经分别研究了铋和铪的诊断和治疗应用 [6, 7]。

在这里，我们提出了一种生产铱纳米颗粒 (IrNPs) 的合成方法，由于其高密度，预计其具有很强的辐射衰减。铱是活性最低的金属之一，通常被认为具有生物相容性，元素密度为 22.56 g/cm ³ （仅次于锇，众所周知，锇具有剧毒）。铱的同位素， ¹⁹² Ir 是一种常用的近距离放射治疗伽马发射器，这种材料成功的部分原因在于其高密度，即小体积材料中的大量原子。在目前的研究中，我们介绍了 IrNPs 的合成及其体外生物相容性以及铱离子的合成，这在之前尚未在选定的细胞系中进行过评估。尽管材料具有化学惰性和优异的密度，但这些新型 IrNP 尚未被轻易探索用于医疗目的。尽管与其他贵金属一样，铱是一种相对昂贵的材料，但其目前作为商品的价值约为黄金价格的四分之三和铑价格的一半，使其成为一种有趣的经济替代品。

方法

IrNPs 的合成

所有合成反应均在室温下在有氧条件下在纯化的 18 MΩ 水中进行。通过浴超声处理制备 20 mM 氯化铱 (III) (Acros Organics) 原液并搅拌至少 20 分钟以生成光学透明溶液。 1.0 M 硼烷吗啉 (Alfa Aesar) 的溶液也通过水浴超声处理制备。对于 500 mL 总体积的更大规模合成，使用 25 mL 氯化铱 (III) 溶液（稀释至 1.0 mM）并在快速搅拌下加入 5.0 mL 硼烷吗啉（最终 10 mM 浓度）。溶液在 30 分钟内逐渐从深棕色变为黑色。允许纳米颗粒稳定至少 60 分钟。将该胶体溶液直接加入离心旋转过滤器（Amicon Ultra-4，10k MWCO再生纤维素）中，以4000×g收集纳米颗粒 并用纯净水洗涤。然后将纳米颗粒悬浮在水中，通过注射器过滤器（Millex-MP 0.22 μm EO），并储存用于定量。

纳米粒子表征

对于 X 射线光电子能谱 (XPS) 分析，将纳米颗粒悬浮在等体积的硝酸中，通过在微量离心管中离心收集（5 分钟，17 rcf），并在分析前悬浮在水中。透射电子显微镜 (TEM) 在 FEI Tecnai F-20 TEM 上以 200 kV 运行。将纯化的 IrNP 滴铸在多孔碳 Cu 支撑的 TEM 网格（Ted Pella）上，并在室温下干燥过夜。使用ImageJ软件分析进行线衍射分析。对于 X 射线衍射 (XRD) 分析，将浓缩的 IrNP 滴铸在载玻片上并在室温下干燥。 XRD 数据是在使用石墨单色化 Cu Kα 辐射的 Rigaku Ultima IV X 射线衍射系统上以聚焦光束 (Bragg-Brentano) 几何形状收集的。在室温下以 0.1°/min 的扫描速率在 20–80° 2θ 的角度范围内进行扫描。动态光散射 (DLS) 在一次性聚苯乙烯比色皿中的 Malvern Nano ZSP 上进行。纳米粒子悬浮在水中，数据按数量分布。在黑色 96 孔板和 100 μL 的总溶液体积中，在 Tecan M200 Pro 上收集 UV-Vis 吸收光谱。调整铱的浓度以说明相对吸收峰。 XPS 分析在配备有半球电子分析仪和铝 Kɑ (1486.7 eV) X 射线源的 PHI Versaprobe II 上进行。使用 Multipak 软件套件进行频谱分析。结合能校准是使用 284.6 eV 的 C1s 峰进行的，峰拟合基于不对称峰和迭代的雪莉背景，导致卡方值为 1.13。在生物毒性测定之前，对 IrNP 和氯化铱 (III) 溶液的电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 进行了评估。 50 微升的每种 IrNP 溶液在 50 μL 王水（3:1 M 浓硝酸对盐酸）中在 70 °C 消化管中消化过夜。然后将样品稀释在 5.0 mL 1% 硝酸中进行分析。 ICP-MS 在 Agilent 7900 上进行，使用氦气作为碰撞气体。使用 100–0.1 μg/mL 铱储备溶液（在 1% HCl 中）制备校准曲线，并将所有样品稀释，以便在数十 ppb 范围内测量浓度。

细胞毒性分析

HepG2和J774A.1细胞系以2 × 10 ⁵ 接种 96 孔板（含 10% FBS 的 DMEM）中的每孔细胞数 (100 μL)，并静置 24 小时。铱纳米颗粒、铱盐、水或 DMSO 以 10% 体积（额外体积 10 μL）加入。然后将细胞孵育 24 或 48 小时。对于活力分析，去除培养基，并在PBS中洗涤细胞一次。将 100 微升含有 10% Alamar Blue (Thermo Scientific) 的培养基与细胞一起孵育 2 h。 然后将培养基重新接种到黑色 96 孔板中，并在 Tecan M200 Pro 上读取荧光 (ex530/em590)。所有数据一式四份进行，并在独立的日子重复实验以确认总体趋势。如先前报道的那样进行溶血测定[8]。

结果

铱纳米粒子的合成和表征

在该合成中，我们通过用 10 倍摩尔过量的硼烷吗啉在水中还原，从氯化铱 (III) 盐中形成元素 IrNP。该反应很容易放大到数升，并且在室温和有氧条件下形成颗粒。这种合成方法产生小的（2-3 纳米）均匀的 IrNP（图 1a），通过高分辨率 TEM 成像观察到具有高度的结晶度。从 TEM 获得的衍射图案进一步证实了纳米晶体的身份，线间距为 0.22 nm，表示铱的衍射光栅（图 1b）。 X 射线衍射图与元素铱（PDF 卡编号：9008470，图 1c）非常匹配。合成后，IrNPs 在水中胶体稳定，并在室温下悬浮在溶液中数月（图 1d）。

一 通过 TEM 成像，铱纳米粒子为 2-3 纳米，b 具有高度结晶的晶格参数。 c XRD 谱与元素铱相匹配，并且 d 通过 DLS，颗粒在水中的流体动力学尺寸为 5 nm

通过从浅黄色铱 (III) 前体到深黑色纳米颗粒溶液的颜色变化观察到，纳米晶体在 30 分钟内形成（图 2）。当暴露在碱性环境中时，这些 IrNP 会形成预测的氧化铱，呈现蓝色。酸性条件，例如在纯硝酸中孵育，似乎不会影响材料的颗粒结晶度或完整性；然而，它确实会引起絮凝和沉淀。此外，在数小时内还在生物相关溶液（磷酸盐缓冲盐水和组织培养基）中观察到聚集，这表明未来的生物医学应用将需要进一步的表面改性。在硝酸中冲洗并悬浮在水中的 IrNP 的 X 射线光电子能谱分析显示主要的铱 (0) 表面，尽管数据的峰值拟合分析表明 20% 表面氧化（图 3）。通过 XRD 或 XPS 均未观察到颗粒的优选微晶取向。或者，在合成过程中（在成核之前）向反应溶液中引入硫醇表面活性剂会抑制颗粒形成。

氯化铱 (III) 呈淡黄色，在 324 和 386 nm 处有吸收峰。 IrNPs 是广谱吸收剂，呈黑色。氧化铱（预测），由在碱性溶液中处理的氧化 IrNPs 产生，呈现蓝紫色，在 584 nm 处有吸收峰

IrNPs 的 X 射线光电子能谱 (XPS) 主要是元素铱表面状态，具有约 20% 的氧化物表面污染

铱细胞毒性

我们评估了未加帽的 IrNPs 的体外生物相容性，并将其与两种哺乳动物细胞中的氯化铱 (III) 盐进行比较。 HepG2 是一种肝细胞癌细胞系，用于评估对肝脏的潜在毒性。 J774A.1 巨噬细胞用于评估对单核吞噬系统的毒性。将细胞与 IrNP 或氯化铱 (III)（针对铱的总浓度标准化）一起孵育 24 或 48 小时，然后洗涤以去除细胞外铱，并使用 Alamar Blue 测定法评估代谢活性（图 4）。 HepG2 细胞在存在铱 (III) 的情况下在 24 小时时表现出代谢活性增加（高达 115% 的存活率），但反应在 48 小时后减弱，500 μM 铱 (III) 将存活率降低至 90%。在 24 小时和 48 小时存在 50 μM IrNP 的情况下，HepG2 细胞的细胞活力从 94% 降低到 78%。有趣的是，J774A.1 细胞对 50-μM 浓度的 IrNPs 的代谢活性增加，24 小时存活率为 122%；然而，48 小时后，正常细胞功能恢复（98% 存活率），表明对纳米材料的瞬时代谢刺激。 J774A.1 细胞与 500 μM IrNP 孵育 24 小时显示出明显的中性代谢反应，但 48 小时后此浓度下的活力下降表明这是毒性和代谢刺激的结果，表现为中性活力反应。此外，我们通过溶血试验评估了 IrNPs 与血液的体外生物相容性，发现当 IrNPs 在 PBS 中与红细胞在 37°C 下孵育 1 小时时，没有引起显着的溶血（附加文件 1：图 S1）。

HepG2 和 J774A.1 细胞与 Ir(0) 纳米颗粒或 Ir(III) 盐一起孵育 24 或 48 小时的细胞活力。 *统计显着值 (p <0.05) 相对于未处理的细胞

讨论

已经研究了各种合成工艺来生产用于催化应用的纳米级铱，包括通过氢化物和氢气还原铱盐 [9,10,11,12,13]，紫外线和伽马辐射 [14,15,16,17]，和多元醇或醇还原 [18,19,20]。然而，许多这些合成方法旨在将铱集成到基材或支持化学反应的载体上，并且与生物应用不兼容 [21]。最近，雾化了 ¹⁹² Ir 被用作肺毒性的模型纳米级材料，并因其特殊的惰性而被选中 [22, 23]。这些研究的主要目的是检查从肺部吸入的细颗粒物的清除和移位；然而，它也突出了该元素的生物相容性。

我们评估了未加帽的 IrNPs 的体外生物相容性，并将其与两种类型的哺乳动物细胞中的氯化铱 (III) 盐进行比较，这些细胞预计会积累最高浓度的注射纳米颗粒。 J774A.1 细胞中的铱 (III) 毒性遵循正常的毒性剂量反应曲线； 100 μM 铱 (III) 将细胞活力降低至 93% 和 66%，而 500 μM 分别在 24 和 48 小时时导致 40% 和 10% 的细胞活力。该数据反映了对铱（0）和铱（III）的有趣的细胞特异性反应，我们预计在体内进一步探索这些影响。较小的 IrNPs 和其他难溶性无机纳米材料预计会转移到肾脏和肝脏，在肾脏中停留时间较短，而在肝脏中停留时间较长，这可能会进一步影响细胞特异性毒性特征。较大的铱颗粒预计会通过粪便排泄，但我们预计，如果可以保持体内胶体稳定性，这些极小的 IrNPs 可能很容易通过肾脏系统过滤 [23]。

在为体内应用做准备时，通过溶血试验评估了 IrNPs 的血液相容性。利用小鼠全血，我们评估了这些 IrNPs 对红细胞破裂和血红蛋白潜在释放的影响。尽管需要对最终表面修饰的 IrNP 进行深入研究，但目前的 IrNP 构建块在极高浓度（500 μM）之前不会引起可检测的溶血反应。

结论

我们从这些研究中得出结论，铱 (0) 纳米晶体可以通过氯化铱 (III) 的简单硼氢化物水溶液还原来轻松合成，这会产生 2-3 nm 高度结晶的纳米粒子，在水中胶体稳定，流体力学约为 5 nm尺寸。在急性暴露期间，这些颗粒在肝细胞中高达 50 μM 的铱浓度（相比之下氯化铱为 10 μM）是无毒的，刺激巨噬细胞的代谢活动，并且在实际浓度下不会引起溶血反应。这些不含配体的纳米粒子可作为后续表面修饰的 IrNPs 的构建块或核心，用于生物和医学应用。进一步研究这些高密度纳米材料在 X 射线或其他辐射存在下的功能特性，为开发新的治疗和诊断药物提供了机会。

缩写

AuNP：

金纳米粒子

DLS：

动态光散射

ICP-MS：

电感耦合等离子体质谱

IrNP：

铱纳米粒子

PDF：

粉末衍射文件

紫外线：

紫外线

XPS：

X射线光电子能谱

XRD：

X射线衍射