SPIO 增强 DC 的交叉呈现和迁移，阴离子 SPIO 影响与白细胞介素-1β相关的纳米佐剂效应

背景

佐剂已广泛应用于临床和实验用途，长期以来一直被认为是免疫刺激剂、被动贮库或能够促进所需免疫反应的载体 [1, 2]。近几十年来，许多不同类别的化合物已被用作佐剂，包括纳米颗粒、微生物产品、乳液、细胞因子、聚合物和脂质体 [3,4,5]。纳米粒子作为免疫佐剂（纳米佐剂）的发展代表了基于放大免疫反应的抗原递送的一个显着领域。在所有类型的纳米粒子中，超顺磁性氧化铁纳米粒子 (SPIO) 具有良好的生物相容性、适当的表面结构和灵活的配体共轭 [6]。这些特性使它们适用于许多不同的生物医学领域，例如磁共振成像 (MRI)、靶向给药和热疗 [7, 8]。

树突状细胞 (DC) 是主要的专业抗原呈递细胞 (APC)，在细胞介导的适应性免疫中发挥关键作用，其中在对特定抗原的初次反应后产生免疫记忆，这种记忆会导致反应增强到随后遇到该抗原 [9, 10]。此外，DC 可以通过主要组织相容性复合体 I 类 (MHC-I) 促进外源抗原的呈递，这一过程称为交叉呈递，然后激活细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) [11]。用于交叉呈递的可溶性抗原通过受体介导的内吞作用被内化，然后转移到细胞质中进行蛋白酶体降解和肽加载。由于可溶性抗原的转运相对不令人满意，传统的 DC 疫苗会导致中等程度的免疫反应。因此，许多研究已经探索纳米佐剂作为可溶性抗原的载体以增强DCs中的交叉呈递[12,13,14]。

涂层材料在 SPIO 水性悬浮液的稳定化和后续功能化中起着关键作用 [15]。在之前的研究中，带正电荷的 SPIO 被证明可以促进 DC 的交叉呈递能力以增强免疫反应，并且它们超过了带相反电荷的对应物的作用 [16, 17]。带不同电荷的 SPIO 影响 DC 抗原交叉呈递的机制尚未阐明。白细胞介素 1β (IL-1β) 是一种参与先天免疫的原型促炎细胞因子，当检测病原体相关分子模式 (PAMP) 和损伤相关分子模式 (DAMP) 时，可以由免疫细胞（例如 DC）分泌。 18]。 IL-1β 的产生严格由炎性体介导，尤其是 NLRP3（NACHT、LRR 和 PYD 结构域蛋白 3）。 NLRP3 的激活诱导 caspase-1 的产生，然后将无活性的 pro-IL-1β 切割成活性形式的 IL-1β [19]。某些无机纳米粒子，如二氧化硅、双壁碳纳米管和二氧化钛，可以诱导炎性体形成 [20,21,22]。先前的研究报告了磁铁矿纳米粒子的表面电荷与其细胞效率之间的相关性 [23]。在此，我们推测载有SPIO的DCs上不同的表面电荷也可能影响IL-1β的分泌，我们的目的是研究这些表面电荷与DCs交叉呈递功能之间的关系。

方法和材料

SPIO 的准备

为了制备 SPIO，采用了一种简单的共沉淀方法，如前所述 [24]。简而言之，FeCl3 和 FeSO4 的混合溶液（摩尔比 Fe ³⁺ :Fe ²⁺ =2:1) 在氮气氛下制备，并在 37°C 下剧烈搅拌 30 分钟。形成 Fe3O4 纳米颗粒的黑色沉淀，并立即使用磁分离用蒸馏水洗涤 5 次。然后将 Fe3O4 分散在蒸馏水中，使其浓度为 3mg/mL，pH 值为 3。最终，悬浮液在 95°C 下充气（用空气），并分离出棕色的 SPIO。

SPIO 涂有 DMSA (SPIO/D ⁻ ) 和带有 APTS 的 SPIO (SPIO/A ⁺ ) 通过分别用内消旋 2,3-二巯基琥珀酸 (DMSA) 和 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 (APTS) 涂覆 SPIO 制备。对于 SPIO/D ⁻ ，将摩尔比为 1:40 的 DMSA 水溶液加入到 100 mL 的 SPIO 溶液中。连续搅拌反应 4 小时后，SPIO/D ⁻ 在 50°C 下以 500 rpm 的速度分离。对于 SPIO/A ⁺ , APTS 以 0.2:1 的摩尔比加入到 SPIO 溶液中，剧烈搅拌 5 小时。然后，用永磁体溶解沉淀物并用去离子水洗涤，并用超声波处理溶液。所得溶液用水反复洗涤，SPIO/A ⁺ 最后在 37°C 下真空干燥成粉末。

小鼠

C57BL/6 小鼠和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 转基因 C57BL/6 小鼠购自南京大学模型动物研究中心，并饲养在南京大学中心实验室的无特定病原体 (SPF) 条件下。所有动物实验均按照中国南京大学医学院动物护理和使用委员会批准的方案进行。

细胞培养

如前所述 [25] 从小鼠骨髓中产生鼠 DC。简而言之，将 8 周龄 C57BL/6 小鼠的骨髓单核细胞与其股骨和胫骨分离。随后，将细胞与 10% 胎牛血清 (FBS)、10 ng/mL 鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 一起在 RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 中培养；Gibco，美国）和 1 ng/mL 鼠白细胞介素-4（IL-4，PeproTech，Rocky Hill，NJ，美国）。每 2 天用新鲜培养基更换培养基。未成熟的DC通常在第6天收集。EGFP-DC按照上述方法来源于EGFP转基因C57BL/6小鼠。

解冻的冷冻人外周血单核细胞 (PBMC) 在完全培养基中静置过夜，即 X-VIVOTM 15 (Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland) =1:1。密度梯度离心后，将 PBMC 悬浮在培养基中 4 小时。来自贴壁细胞的人 DC 在 37°C 下在含有人 GM-CSF（100 ng/mL；R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）和人 IL-4（10 ng/mL；PeproTech，Rocky Hill，美国新泽西州）。第 2 天和第 4 天更换一半培养基。第 5 天收获未成熟的人类 DC。巨细胞病毒 Epstein-Barr 病毒和流感病毒 (CEF) 特异性 T 细胞来自悬浮细胞，在含有 MHC 的 CMX 培养基中培养-I 限制 CEF 肽（20 ng/mL，Panatecs，Heilbronn，Germany，PA-CEF-002）约 48 小时。 CEF 特异性 T 细胞在 CMX 培养基中通过 1000 U/mL 人 IL-2（Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA，200-02）扩增 12 天。对于 IL-2，每 3 天更换一次新鲜培养基。

特征化

使用透射电子显微镜（TEM，Advanced Microscopy Techniques，Danvers，MA）测定SPIO的形态和尺寸。 X射线衍射（XRD）图用于鉴定催化剂的光谱。还测量了 zeta 电位测定以确定涂有不同聚合物的纳米颗粒的表面电荷。 SPIO/A ⁺ 和 SPIO/D ⁻ 制备了 pH 值范围为 3 到 8 的纳米颗粒。使用 zetasizer Nano ZS90 电位分析仪（英国马尔文）进行 Zeta 电位测量。使用振动样品磁强计 (Lakeshore 7407) 在 37°C 下分析纳米颗粒的磁性能。

CPRG 检测

B3Z T 细胞系（CD8 ⁺ T 细胞杂交瘤）在 H-2Kb MHC-I 分子存在的情况下，当其 T 细胞受体与卵清蛋白 (OVA) 258-265 表位结合时，可以表达 LacZ 基因。 DCs (2 × 10 ⁴ ) 和 OVA（100 μg/mL，Sigma-Aldrich）与 SPIO、SPIO/A ⁺ 一起培养 , 或 SPIO/D ⁻ 在 37°C。 6小时后，DC与B3Z共培养（2 × 10 ⁵ ) 过夜。进行氯酚红-β-半乳糖苷酶测定（CPRG，Sigma-Aldrich，USA）以确定 B3Z 细胞的 β-半乳糖苷酶产量。在该测定中，595 nm 处的光密度 (OD) 表明 DC 的抗原交叉呈递能力。

细胞凋亡检测

采用荧光激活细胞分选 (FCS) 来探索不同浓度的 SPIO 对 DC 活力的影响。简而言之，将未成熟的DC与标记有Annexin V和PI（Biouniquer，CHN）的SPIO一起孵育，并通过FCS检测DC中Annexin V和PI的表达。

体内荧光强度成像

为了探索 DCs 在体内的迁移，将 TNF-α（60 ng/小鼠）预先注射到两条后腿的足垫中（n =8)。 24 小时后，SPIO 标记的 EGFP-DC (2 × 10 ⁶ ) 将 40 μL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 注入 C57BL/6 小鼠的左足垫，并将相同数量的未标记 EGFP-DC 注入右侧。为了检查迁移到淋巴结的 EGFP-DC 的水平，采用了 Maestro 成像系统（CRi，Woburn，MA，USA）。使用 484 nm 激发滤光片和 507 nm 发射滤光片观察解剖的淋巴结。然后用 Living Image 软件（v 2.50；Caliper Corporation，Newton，MA，USA）分析显示绿色荧光的荧光图像。共聚焦显微镜分析用于确定免疫组织化学。将冷冻淋巴结切成 5 μm 厚的切片，然后固定，将切片与绿色荧光蛋白 (GFP) 抗体 (Invitrogen) 一起孵育，山羊 Alexa Fluor 488 nm 抗体 (Invitrogen) 用作二抗。采用共聚焦激光扫描显微镜（Fluoview，Fv10i；Olympus）对样品进行观察。

体外人类 DC 抗原交叉呈递分​​析

培养的人DCs（2 × 10 ⁴ ) 接种到 96 孔圆底板中，SPIO/A ⁺ 和 SPIO/D ⁻ 添加与巨细胞病毒 (CMV) pp65 蛋白 (1 μg/mL, MACS) 结合的纳米颗粒 (100 μg/mL)，并分别使用 CMV pp65 蛋白和 CEF 肽 (1 μg/mL，Think 肽) 作为对照。 6 小时后，CEF 特异性 T 细胞（2 × 10 ⁵ ) 被添加到人类 DC 中 12 小时。 Brefeldin A（10 μg/ml，Sigma-Aldrich，美国）在培养基中再保持 6 小时。刺激和激活后，收集 CEF 特异性 T 细胞并用针对 CD3、CD4、CD8 和 IFN-γ 的人抗体（Invitrogen，美国）染色。染色后，样品通过定制的 LSR II 流式细胞仪（BD，Franklin Lakes，NJ，USA）进行分析。采集到的数据通过 FlowJo 软件（Tree Star, Ashland, OR, USA）进行分析。

酶联免疫吸附测定

使用小鼠 IL-1β 酶联免疫吸附测定 (ELISA) Ready SET-Go 试剂盒（eBioscience，美国）和人 IL-1β ELISA 试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）来确定 IL 的分泌DCs的-1β。用 100 μL/孔的 IFN-γ 包被的 ELISA 板（Costar，美国）用于在 4°C 下捕获抗体过夜，并用 ELISA 缓冲液封闭。然后将样品和标准品加入孔中并在 37°C 下孵育 2 小时。检测到生物素化的 IFN-γ。使用 OD 设置为 450 nm（BioTek，美国）的酶标仪测量样品。

统计分析

使用社会科学统计软件包（SPSS 13.0，芝加哥，伊利诺伊州，美国）分析数据。结果以平均值 ± SD表示，对照组和测试组之间的差异通过单向方差分析、双尾学生t评估 检验和双因素方差分析。 *P 处的差异 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

SPIO 的特征

通过TEM观察合成的SPIO的形态和尺寸。 TEM 图像显示 SPIO 的平均尺寸为 8.7 nm，呈球形（图 1a）。 XRD 分析显示了六个明显匹配标准 γ-Fe2O3 反射的峰（图 1b）。振动磁力计结果表明，获得的 SPIO 具有超顺磁性，饱和磁化强度比 Fe3O4 好 60.4emu/g（图 1c）。 DLS 图显示 SPIO 在溶液中的尺寸分布为 22 nm（图 1d）。为了确认DCs含有SPIO，进行普鲁士蓝染色以验证DCs含有铁（图1e）。

SPIO 的表征。 一 获得的SPIO的TEM图像。 b 纳米颗粒催化剂的XRD图谱表明材料为γ-Fe2O3。 c 获得的 SPIO 和 Fe3O4 纳米颗粒的磁化曲线。 d SPIO 的流体动力学直径。 e 孵育 12 小时后用 50 μg/mL SPIO 标记的 DC 的形态学：未标记的 DC 和普鲁士蓝染色标记的 DC

DCs 的 SPIO 激活交叉呈现

为了进一步研究 SPIO 标记的 DC 对鼠系统中 T 细胞活化的影响，通过 CPRG 测定检查 β-半乳糖苷酶的产生来确定 B3Z T 细胞活化的水平。本研究采用 100 μg/mL OVA 的固定浓度和五个剂量比的 SPIO（6 小时后为 1、5、10、25 和 50 μg/mL）。随着 SPIO 浓度的增加，B3Z 细胞的活化程度逐渐增加并在 25 μg/mL 时达到稳定（图 2a）。为了研究用不同浓度 SPIO 标记的 DC 的活力是否受到影响，在膜联蛋白 V 和 PI 染色后通过 FCS 分析 DC 和 SPIO 标记的 DC。结果表明，SPIO 浓度为 10、25 和 50 μg/mL 的 Annexin V/PI DCs 的总百分比没有显着差异，而在加载 100 μg/mL SPIO 后凋亡细胞的百分比增加（图 2b） ）。通过 FCS 观察到用不同浓度的 SPIO 标记的 DCs 的表面共刺激分子。与没有 SPIO 标记的那些相比，CD80 和 CD86 的表达在 25 μg/mL 时可检测到增加（图 2c）。用 25 μg/mL SPIO 标记的 DC 在不同时间点没有表现出细胞凋亡的变化（图 2d）。我们在以下实验中使用了 25 μg/mL。

用SPIO标记后DC交叉呈递和生物相容性的影响。 一 在不同 SPIO 浓度下增强的 DC 的交叉呈递。 b 通过 FCS 检测不同浓度（10、25、50 和 100 μg/mL）的凋亡 DC 和 SPIO 标记的 DC。 c DCs 的表型，包括 CD11c ⁺ CD80 ⁺ 和 CD11c ⁺ CD86 ⁺ 用 SPIO（10、25、50 μg/mL）标记后。用 LPS (1 μg/mL) 刺激的 DC 用作阳性对照。 d 在不同时间点（6、12、18 和 24 小时）通过 FCS 检查加载了 25 μg/mL SPIO 的凋亡 DC

在次级淋巴结中用 SPIO 增强的 EGFP 信号标记 EGFP-DC

EGFP-DCs 在体外成功地来源于 EGFP 转基因小鼠，共聚焦荧光显微镜图像显示几乎所有的 EGFP-DCs 都表现出绿色荧光（图 3a）。为了研究 EGFP-DC 的绿色荧光是否会受到 SPIO 的影响，进行了 FCS。结果表明，SPIO标记后EGFP荧光的表达没有减弱（图3b，c）。然后，将 25 μg/mL SPIO 标记的 EGFP-DC 注射到 C57BL/6 小鼠的右侧后足垫中，并将未标记的 EGFP-DC 注射到对侧。 EGFP 信号在腘淋巴结 (PLN) 和腹股沟淋巴结 (ILN) 中测量，它们分别是前哨淋巴结和次级淋巴结。结果显示，SPIO标记的EGFP-DCs和未标记的EGFP-DCs在前哨淋巴结中的迁移在第7天达到高峰，两组之间未观察到EGFP信号的显着差异，而检测到显着减少PLN组第14天。ILN组检测到的EGFP信号与第4天和第7天SPIO标记的EGFP-DC组一致，表明SPIO标记的DC迁移到次级淋巴节点（图3d-f）。

用 SPIO 标记后 EGFP-DC 的迁移和定位。 一 孵育 12 小时后，用 25 μg/mL SPIO 纳米粒子标记的 EGFP-DC 的激光扫描共聚焦显微镜。 b , c 12 小时后 SPIO 标记的 EGFP-DC 的荧光强度。在不同天数回输 SPIO 标记的 EGFP-DC 后引流淋巴结的体外光学成像。预先将TNF-α注射到小鼠足垫中，以促进EGFP-DCs的迁移。 d –e 注射有或没有SPIO的EGFP-DCs后不同天淋巴结的体外光学成像和信号强度分析。 f 激光共聚焦显微镜检测引流淋巴结EGFP阳性细胞

不同电荷修饰的 SPIO 影响鼠 DCs 交叉呈现

SPIO 涂有 APTS 或 DMSA。为了验证 SPIO 的表面电荷，我们测量了 zeta 电位特性。 SPIO/A ⁺ 的 zeta 电位 SPIO 为正，而 SPIO/D ⁻ 的 zeta 电位 当 pH 值为 7 时，溶液中显示负电荷（图 4a）。通过 TEM 观察到涂有不同电荷聚合物的 SPIO 标记 DCs 的超微结构。与未处理的细胞相比，用 SPIO 处理的 DCs 出现电子密集，并且许多 SPIO 聚集在细胞质中。 SPIO/A ⁺ 被细胞质中的内体吞没，而更高数量的 SPIO/D ^- 在 DC 的细胞质中发现了这些纳米颗粒，并且几乎所有这些纳米颗粒都被类似于溶酶体的多层膜结构包围（图 4b）。我们检查了带相反电荷的 SPIO 是否可以触发不同水平的 IL-1β。根据我们的结果，加载了 SPIO/A ⁺ 的 DC 和 SPIO/D ⁻ 诱导 IL-1β 的剂量依赖性分泌。无论浓度如何，我们发现 SPIO/D ⁻ 诱导的 IL-1β 水平显着高于 SPIO/A ⁺ （图4c）。由于IL-1β与TLR3通路之间存在明显的相关性，为进一步研究IL-1β对T细胞活化的影响，从TLR3敲除小鼠中提取DC，与SPIO/A ⁺ 共培养 , SPIO/D ⁻ ，和 OVA。加载了 SPIO/A ⁺ 的 DC + OVA 可以有效激活 B3Z T 细胞，这意味着 DCs 中的 TLR3 分子是交叉呈递所必需的（图 4d）。

涂有不同电荷的 SPIO 影响 DC 交叉呈递和 IL-1β 分泌。 一 涂有不同电荷分子的 SPIO 的 pH 依赖性 zeta 电位。 b TEM 下 DCs 中不同电荷的纳米粒子的位置。 c 被不同电荷分子包被的 SPIO 诱导的 IL-1β。 d SPIO/A ⁺ 的交叉展示 +OVA 和 SPIO/D ⁻ + DCs 通过 TLR3 通路的 OVA

用相反电荷涂层修饰的SPIO促进人类DC的抗原交叉呈递并受到IL-1β的影响

为了探讨 IL-1β 与交叉呈递之间的关系，我们选择了 caspase-1 抑制剂 YVAD，发现它在用 50 μM 脂多糖 (LPS) 预处理 3 小时后可以显着抑制人 DCs 的 IL-1β 分泌（图. 5a)此外，我们发现YVAD可以抑制SPIO/A ⁺ 引起的人DCs分泌IL-1β 和 SPIO/D ⁻ （图5b）。然后我们研究了人类 DC 是否可以用作有效的 APC 并将 CMV pp65 交叉呈递给 CEF 特异性 T 细胞。为了测量抗原交叉呈递，引入细胞内染色（ICS）来确定抗原特异性 CD3 ⁺ 的百分比 CD8 ⁺ 干扰素-γ ⁺ 和 CD3 ⁺ CD4 ⁺ 干扰素-γ ⁺ FCS 的 T 细胞。加载了 SPIO/A ⁺ 的 DC 结合CMV pp65蛋白诱导更多CD3 ⁺ CD8 ⁺ 干扰素-γ ⁺ 和 CD3 ⁺ CD4 ⁺ 干扰素-γ ⁺ T 细胞比加载了 SPIO/D ⁻ 的 DCs .我们的数据显示 caspase-1 抑制剂 YVAD 显着增加了由 SPIO/D ⁻ 诱导的 T 细胞反应 + CMV pp65 蛋白，而它部分抑制了由 SPIO/A ⁺ 诱导的 T 细胞反应 + CMV pp65 蛋白（图 5c、d）。这些结果表明，有效的交叉呈递需要中等水平的 IL-1β 激活，而高水平的 IL-1β 激活会抑制 DC 中的交叉呈递。

带有相反电荷的 SPIO 通过 IL-1β 通路影响人类 DCs 的功能。 一 通过 LPS 预处理 3 小时后，将人 DC 与逐渐增加的 YVAD（1、10、25 和 50 μM）浓度一起孵育，然后收集上清液用于 IL-1β 的 ELISA。 b YVAD可通过SPIO/D ⁻ 抑制人DCs分泌IL-1β . SPIO/A ⁺ , 和 SPIO/D ⁻ 影响受 IL-1β 影响的 DC 交叉呈递。 c CD3 ⁺ CD8 ⁺ 干扰素-γ ⁺ 和 d CD3 ⁺ CD4 ⁺ 干扰素-γ ⁺ FCS胞内染色法分析T细胞

讨论

自生物技术发展以来，免疫疗法一直是临床和实验研究的研究重点。然而，先前旨在引发免疫的传统 DC 疫苗的临床试验并未诱导足够的免疫反应 [26]。纳米颗粒代表一种佐剂，可以促进DCs激活T细胞的功能[27]。我们的 SPIO 最典型的特征包括它们的生物相容性和它们作为免疫佐剂的标记 DC 的应用。 TEM 图像显示我们的 SPIO 在干燥状态下的平均尺寸为 8.7 nm，呈球形（图 1a）。普鲁士蓝染色表明SPIO容易被DCs吞噬（图1e），表明其摄取效率。

据报道，SPIO 具有广泛的生物医学应用，例如细胞标记、药物递送、MRI 和磁热疗 [28]，这些都是需要生物相容性的应用。因此，必须研究用SPIO标记的DC是否对DC凋亡有影响。我们的数据表明，当 DC 用低于 50 μg/mL SPIO 标记时，DC 细胞凋亡没有显着差异（图 2b）。在接下来的研究中，我们选择OVA蛋白作为模型蛋白，B3Z T细胞作为有效T细胞来观察SPIO是否会影响DCs的交叉呈递。我们的结果表明，SPIO 标记的 DC 可以显着促进 OVA 的交叉呈递和 B3Z T 细胞的激活。表面分子 CD80 和 CD86 是成熟 DC 的标志物，是 T 细胞活化所必需的两个关键共刺激因子。在 25 μg/mL 时，活化的 B3Z T 细胞随着纳米颗粒剂量的增加而增加并最终稳定（图 2a）。此外，DCs表面CD80和CD86的表达达到最大值（图2c）。因此，我们采用25 μg/mL的浓度，发现DCs的凋亡具有时间依赖性（图2d），证明SPIO具有优异的纳米佐剂功能和生物相容性。

为了检查 SPIO 对 DC 迁移的影响，我们使用在共聚焦荧光显微镜下呈现绿色荧光的 EGFP-DC 与 25 μg/mL SPIO 共培养 12 小时。我们观察到 EGFP 荧光的表达在 SPIO 标记后没有减弱。最终，DC 向次级淋巴器官的迁移是评估基于 DC 的疫苗有效性的关键参数。在我们之前的研究中，在前 24 小时内，在次级淋巴结中未检测到显着数量的 SPIO 标记的 DC [29]。为了进一步确定这种现象是否随时间发生变化，收集了标记和未标记的 EGFP-DCs 并将其注射到小鼠的脚垫中，以评估 SPIO 在 DCs 迁移中的潜力。我们的结果显示绿色荧光在第 4 天和第 7 天出现在 ILN 中（图 3d-f），从而证明 SPIO 可以促进 EGFP-DC 迁移到次级淋巴结。该特性可用于限制肿瘤的转移，激活更多淋巴结中更多的CTL细胞。

在我们的研究中，我们探索了带相反电荷的 SPIO 的佐剂特性以及 DCs 功能变化的可能机制。已证明氧化铁纳米颗粒的表面电荷对细胞吸收效率有影响 [30, 31]。在我们之前的研究中，我们报道了阳离子 SPIO 可以增强抗原交叉呈递，从而增强 T 细胞活化，而阴离子 SPIO 与自噬相关。 [16] 几种金属纳米粒子可以诱发炎症反应 [32, 33]。据报道，氧化铁纳米颗粒可激活 NLRP3，使溶酶体膜破裂，释放组织蛋白酶 B，并诱导 IL-1β 分泌 [34]。因此，我们假设带相反电荷的 SPIO 纳米粒子可以在刺激小鼠和人类 DC 中 IL-1β 的产生方面发挥不同的作用。在图 4a 中，我们的 zeta 电位分析表明，APTS 涂层的 SPIO 带有正电荷，而 DMSA 涂层的 SPIO 带有负电荷。在 TEM 下，我们发现带不同电荷的 SPIO 聚集在细胞质中的不同位置（图 4b）。考察SPIO/A ⁺ 交叉表达的差异 和 SPIO/D ⁻ ，我们探索了由不同电荷的纳米颗粒诱导的鼠 DCs 中的 IL-1β 分泌。我们评估了用 SPIO/A ⁺ 治疗后鼠 DCs 的反应 和 SPIO/D ⁻ .暴露于 SPIO/D ⁻ 与暴露于 SPIO/A ⁺ 相比，诱导 IL-1β 分泌的明显激活 （图4c）。这一现象部分揭示了SPIO/D ^- 诱导的抗原交叉呈递 效率不如SPIO/A ⁺ .除了小鼠 DC 与 SPIO/A ⁺ 共培养后增加的 B3Z T 细胞活化的 CPRG 分析 +OVA 证明带正电荷的纳米粒子在用作免疫佐剂时表现更好。 Toll-like receptors (TLRs) are of importance for triggering immune responses, such as TLR3, and they can ultimately result in the production of inflammasomes, the activation of caspase-1 protein, and secretion of cytokine IL-1β [35]. To demonstrate whether TLR3 is related to the antigen cross-presentation influenced by our nanoadjuvant, TLR3 knockout DCs were employed in our study. TLR3 ^−/− DCs loaded with SPIO/A ⁺ +OVA and SPIO + OVA effectively stimulated the B3Z T cell activation (Fig. 4d), which indicates that the TLR3 molecule in DCs was necessary for cross-presentation. Collectively, these results elucidated that differently charged polymers on the surface of nanoparticles should be considered when investigating their synergistic effects on activated immune responses.

Our data show that the oppositely charged nanoparticles could induce the production of IL-1β, whereas SPIO/D ⁻ could hyperactivate the secretion of IL-1β. However, compared with SPIO/A ⁺ , SPIO/D ⁻ induced a lower level of B3Z T cell activation. Therefore, we speculate that aberrant IL-1β production may contribute to cellular dysfunction in DCs. Most studies on nanomaterial adjuvants exploit DCs from mice, whereas few have used DCs from humans [36, 37]. To further verify our hypothesis, we used YVAD, which has been proven to be an effective caspase-1 inhibitor (Fig. 5a, b), to suppress IL-1β secretion from human DCs. CMV pp65 protein was selected as the model antigen, and CEF-specific T cells expanded in vitro were used as responder cells. The CMV pp65 protein is an immunological dominant protein that readily activates CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells to produce cytokines, particularly IFN-γ [38]. CEF peptide was used as a positive control to verify that the addition of YVAD would not affect the activation of T cells because it can be presented to the T cells directly. Intriguingly, with the use of YVAD, the T cell responses in the SPIO/A ⁺ group were slightly restrained, while the responses in the SPIO/D ⁻ group increased (Fig. 5c, d). The influence of IL-1β on DC cross-presentation provided conclusive evidence that a low level of IL-1β induced by SPIO/A ⁺ is needed for antigen cross-presentation, and a high level of IL-1β in the cytosol will inhibit the function of DCs.

Conclusions

As shown in the graphical abstract in Fig. 6, SPIO can promote the maturation, migration, and cross-presentation of DCs. Moderate IL-1β activity is partly related to the antigen cross-presentation of DCs. In addition, negatively charged nanoparticles can activate excessive IL-1β and subsequently inhibit the functions of DCs. In summary, our results indicate that SPIO exhibit many biological properties and have promising adjuvant potential. These findings will help identify the optimal choice of nanoadjuvants for the development of DC vaccines in the future.

Graphical abstract of SPIO as a nano-adjuvant for DCs. SPIO enhances the function of DCs by promoting the loading of DCs; thus, SPIO-labeled DCs can migrate to the ILNs active in an immune organ and may offer a new approach in cancer immunotherapy. Anionic-charged SPIOs activate protective IL-1β responses by triggering caspase-1 in DCs, thereby impairing antigen presentation to active T cells

缩写

APCs:

Antigen-presenting cells

APTS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

ATP:

Adenosine triphosphate

CPRG:

Chlorophenol red-β-d-galactopyranoside

CTL:

Cytotoxic T cell

DAMPs:

Damage-associated molecular patterns

DC：

Dendritic cell

DMSA:

Meso-2, 3-dimercaptosuccinic acid

EGFP:

Enhanced green fluorescent protein

IL-1β:

Interleukin-1β

MHC-I:

Major histocompatibility complex class I

NLRP3:

NACHT, LRR, and PYD domains-containing protein 3

OVA:

Ovalbumin

PAMPs:

Pathogen-associated molecular patterns

SPIO:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

SPIO/A ⁺ ：

SPIO coated with APTS

SPIO/D ⁻ ：

SPIO coated with DMSA

TLRs:

Toll-like receptors