抗EpCAM适配体功能化脂质体靶向递送多柔比星：C26结肠癌模型中的疗效研究

摘要

本研究通过后插法将抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）适配体偶联的DSPE-mPEG₂₀₀₀引入Caelyx®（PEG化脂质体多柔比星），构建了抗EpCAM适配体功能化的多柔比星脂质体（ED-lip）。表征结果显示，ED-lip粒径略微增加，多分散指数（PDI）小幅上升，zeta电位显著降低，证实了后插修饰的高效性。流式细胞术和荧光显微镜实验表明，与Caelyx®相比，ED-lip在C26结肠癌细胞系中的细胞摄取率显著增强。细胞毒性实验进一步证实ED-lip具有更强的杀伤效果，验证了抗EpCAM适配体作为靶向配体的有效性。药代动力学和组织分布研究显示，ED-lip未改变多柔比星在小鼠体内的分布特征，但显著提高了肿瘤部位的药物富集，并延长了肿瘤负荷小鼠的生存期。结果提示，抗EpCAM适配体功能化Caelyx®在癌症治疗中具有应用前景，值得进一步深入研究。

引言

粒径100–200 nm的纳米药物递送系统（NDDSs）可通过增强渗透和滞留（EPR）效应被动富集于肿瘤微环境。然而，最新数据显示，给药剂量中不到1%的药物能到达肿瘤部位。原因包括：纳米载体难以穿透肿瘤致密的细胞外基质（ECM）、释放的药物重新进入血液循环、以及肿瘤的异质性。为改善NDDSs的肿瘤富集，研究者们利用内源性和外源性刺激开发了多种响应性策略，包括光响应系统用于肿瘤成像。无机纳米材料虽具抗癌潜力，但其毒性和环境安全性需严格评估。

主动靶向递送是提高NDDSs治疗指数的重要途径，可将药物高效递送至肿瘤并减少脱靶毒性。理想的靶向分子应对癌细胞或组织特异性高表达的细胞表面受体具有高亲和力。上皮细胞粘附分子（EpCAM）是一种跨膜糖蛋白，正常上皮细胞低表达，而癌细胞可高表达达1000倍。癌变过程中，EpCAM表达模式从基底侧膜转移至顶面，这种差异化表达使其成为理想的药物靶点。EpCAM还是癌干细胞（CSC）或肿瘤起始细胞（TIC）的标志物，其过表达与预后不良相关。CSC/TIC具有自我更新能力，在肿瘤发生和转移中起关键作用，且多种实体瘤的CSC中均观察到EpCAM过表达。

近年来，核酸适配体因其独特优势成为NDDSs靶向配体的研究热点。适配体是具有二级/三级结构的DNA或RNA寡核苷酸，能特异性结合细胞表面受体。与抗体相比，适配体无免疫原性、分子量小（8–25 kDa）、化学热稳定性好、合成成本低且易于规模化生产和化学修饰。抗EpCAM适配体功能化纳米载体可有效提高抗癌药物在肿瘤微环境中的递送效率，多项研究已证实其增强肿瘤细胞摄取的能力。

本研究旨在开发抗EpCAM DNA适配体（SYL3C）修饰的PEG化脂质体多柔比星（ED-lip）作为NDDS模型。通过EDC/NHS偶联化学将适配体氨基与DSPE-mPEG₂₀₀₀羧基连接，再经后插法引入脂质体表面（图1）。我们对ED-lip的粒径、zeta电位、包封率、释放谱、细胞毒性进行了表征，并评估了其在C26结肠癌细胞中的体外摄取及小鼠体内的靶向递送效果。

抗EpCAM适配体功能化脂质体靶向递送多柔比星：C26结肠癌模型中的疗效研究 — 图1. 抗EpCAM功能化Caelyx®（ED-lip）的制备。a 抗EpCAM适配体通过氨基与DSPE-mPEG₂₀₀₀羧基共价偶联。b 后插法制备抗EpCAM功能化Caelyx®（ED-lip）

结果与讨论

DSPE-mPEG₂₀₀₀与适配体的偶联

本研究采用EDC/NHS化学将氨基修饰的抗EpCAM适配体共价连接至DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH的活化羧基上。该反应形成稳定的酰胺键，减少非特异性相互作用。适配体可经氨基或巯基修饰分别与羧基或马来酰亚胺基团偶联。巯基化学的局限性在于储存期间巯基易氧化形成二硫键，生成二聚体适配体而无法参与后续反应，降低产率。EDC/NHS法显著提高了偶联产率和后插效率。

适配体相较抗体具有合成简易、可规模化、系统毒性低、无免疫原性等优势。偶联完成后，采用后插法将抗EpCAM适配体引入Caelyx®表面制得ED-lip。后插法操作简便、适配体掺入率高，是脂质体表面功能化的常用策略。

琼脂糖凝胶电泳迁移率分析验证了后插成功（图2）。游离适配因带负电荷在凝胶中迁移显示条带，而ED-lip滞留于加样孔未进入凝胶，无对应条带出现，证实适配体-脂质体偶联物成功后插至脂质体表面。

ED-lip的理化性质表征

Caelyx®和ED-lip的理化参数见表1。修饰抗EpCAM适配体未显著改变粒径（p>0.05）。Caelyx®粒径约96 nm，PDI 0.11；后插后ED-lip粒径增至117 nm，PDI 0.14，仍处于适合肿瘤递送的理想范围。文献亦报道靶向配体引入导致脂质体粒径和PDI增加。ED-lip的zeta电位（-19.25 mV）较Caelyx®（-12 mV）更负，与RNA适配体修饰降低脂质体zeta电位的报道一致。粒径增加和电位更负均提示适配体成功后插至脂质体表面。这与我们前期研究结果吻合。未来可优化孵育时间和温度以获得粒径和PDI更优的后插脂质体。两制剂的多柔比星包封率均为100%。

通过磷酸盐分析法测定脂质体磷脂总量为14 mM。按平均粒径100 nm脂质体含脂质分子数约8×10⁴计算，每毫升脂质体数量约10¹⁴。适配体分子量为g/mol。基于磷酸盐分析法测定的DSPE-mPEG₂₀₀₀-适配体摩尔数，每毫升制剂中适配体分子数约10¹⁵，即每个脂质体表面约修饰10个适配体分子。

多柔比星释放谱

适配体偶联胶束的后插可能影响药物释放行为。我们在含50%胎牛血清（FBS）的5%葡萄糖溶液中（模拟血浆环境）考察了24小时释放谱（图3）。结果显示，Caelyx®和ED-lip的释放曲线无显著差异，仅释放微量多柔比星。这与前期研究一致：适配体后插不影响脂质体膜稳定性和药物释放，主要归因于Caelyx®采用pH梯度远程装载法制备，具有优异的稳定性。

细胞相互作用与摄取（荧光显微镜）

在4℃和37℃下评估制剂的细胞相互作用和摄取（图4）。CHO-K1细胞（EpCAM阴性）经Caelyx®和ED-lip处理后，两温度下平均荧光强度（MFI）无差异（图4a,c）。但C26细胞（EpCAM阳性）对ED-lip的摄取在4℃和37℃均显著高于Caelyx®（图4b,d），37℃差异极显著（p<0.0001）。游离多柔比星自由穿透细胞膜，摄取最高、细胞毒性最强。Caelyx®的PEG化限制了内吞作用，降低细胞毒性；而ED-lip表面的抗EpCAM适配体促进内化，增强细胞毒性。荧光显微镜显示，C26细胞中ED-lip与游离多柔比星的内化水平无显著差异（图5），但半定量评分（表2）显示两者均显著高于Caelyx®（p<0.001）。尽管C26细胞EpCAM表达水平较低，抗EpCAM适配体仍能显著提升脂质体内化率。

细胞毒性研究

MTT法测定游离DOX、Caelyx®、ED-lip对CHO-K1和C26细胞的细胞毒性（图6）。不同浓度处理1、3、6 h后继续培养72 h。结果显示所有制剂均呈时间和剂量依赖性抑制细胞增殖。C26细胞经ED-lip处理后活率显著低于Caelyx®组。CHO-K1细胞对ED-lip响应较低，提示抗EpCAM适配体实现了对靶细胞的特异性递送。这证实了靶向药物递送通过特异性靶向剂可选择性递送药物至靶细胞，减少脱靶副作用。前期研究亦证实，适配体或抗体主动靶向Caelyx®可增强肿瘤靶向和特异性药物递送，提升多柔比星疗效。

生物分布与药代动力学

向皮下接种C26结肠癌的小鼠静脉注射10 mg/kg ED-lip或Caelyx®，测定不同时间点血浆和组织中多柔比星浓度（图7、8）。血浆药时曲线显示两组无显著差异（图7）。药代参数（表3）显示，适配体偶联使循环半衰期（t_½）从39.3 h略降至34.2 h，平均驻留时间（MRT）从47.6 h降至42.9 h，与配体修饰加速脂质体清除的报道一致，可能因蛋白吸附后被单核吞噬细胞系统（MPS）识别清除。

组织分布显示（图8），ED-lip在肝、肺、脾3 h时富集显著高于Caelyx®，可能因后插后粒径和PDI增加，且这些器官血管窦隙较大。心脏分布无显著差异，说明Caelyx®降低多柔比星心脏毒性的优势保留。肿瘤部位两制剂均随时间逐渐富集，12 h达峰值，维持至24 h后下降。关键在于所有时间点ED-lip肿瘤富集均显著高于Caelyx®，证实抗EpCAM适配体主动靶向增强了肿瘤渗透。此外，EpCAM在肿瘤血管内皮细胞过表达也可能促进穿透。CSC/TIC亦为抗EpCAM治疗靶点，ED-lip的抗肿瘤效果部分可能源于对CSC的靶向清除。

体内抗肿瘤活性

C26结肠癌小鼠模型评估治疗效果（图9、表4）。单次静脉注射10 mg/kg制剂，监测近2个月。体重变化组间无差异（图9a）。给药后30天内两脂质体组抑瘤率相当，均显著优于PBS组（图9b）。30天后肿瘤生长加速，但给药组仍慢于对照组。生存分析（Kaplan-Meier曲线，图9c）显示ED-lip显著改善生存曲线。ED-lip组3只小鼠肿瘤完全消退，中位生存时间（MST）未达终点。ED-lip使终点时间（TTE）从41.1天延长至49.7天，肿瘤生长延迟率（TGD%）达90.27%（表4）。

肿瘤体积数据表明ED-lip显著抑制肿瘤生长。生存分析显示ED-lip延长MST和TTE，TGD%更高，优于Caelyx®。这与ED-lip组肿瘤组织中更高的多柔比星浓度一致。适配体偶联改善了脂质体在肿瘤部位的渗透和药物富集，从而增强疗效。综上，抗EpCAM适配体可作为重要靶向配体用于药物递送。

结论

本研究通过后插法用抗EpCAM（SYL3C）适配体功能化Caelyx®制得ED-lip。流式细胞术和荧光显微镜显示ED-lip在C26细胞中DOX摄取显著增强，提示适配体促进内化过程。药代动力学显示适配体后插未改变DOX药代行为；但组织分布显示ED-lip在肿瘤部位富集显著更高，甚至72 h后仍维持优势。体内实验证实ED-lip在C26肿瘤小鼠中具有改善的治疗效果。ED-lip组生存参数改善，提示EpCAM靶向多柔比星脂质体是极具前景的癌症药物递送载体，值得进一步研究。

材料与方法

材料

5'-氨基修饰抗EpCAM DNA适配体（序列：5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3'，SYL3C）购自BIONEER（韩国大田）。DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH购自Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马）。Dowex®树脂、EDC、NHS、青霉素链霉素、含DAPI的Fluoroshield™购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。商业化Caelyx®购自Behestan Darou公司（伊朗德黑兰）。

DSPE-mPEG₂₀₀₀与适配体的偶联

抗EpCAM适配体通过氨基与DSPE-mPEG₂₀₀₀羧基经EDC/NHS化学共价偶联（图1）。简述：DSPE-mPEG₂₀₀₀分散于MES缓冲液（pH 6.5），加入400 mM EDC和100 mM NHS搅拌15 min活化羧基。随后加入适配体，室温避光搅拌2 h。脂质:适配体摩尔比1:1，EDC/NHS:脂质摩尔比10:1。

Caelyx®的抗EpCAM适配体修饰

ED-lip采用后插法制备。将DSPE-mPEG-抗EpCAM适配体胶束加入1 ml Caelyx®，60℃孵育30 min。适配体用量按Bartlett磷酸盐分析法确定。按Caelyx®每毫升约含10¹⁴个脂质体计算，调整适配体体积使每脂质体约修饰10个适配体。琼脂糖凝胶电泳验证后插成功。

理化性质表征

粒径、PDI、zeta电位用动态光散射仪（Nano-ZS，Malvern，UK）测定。用Dowex®树脂吸附游离DOX（旋转60 min），经Poly-Prep柱柱层析除去树脂。荧光分光光度计（LS-45，Perkin-Elmer，UK）测定脂质体包封DOX量（激发/发射 485/590 nm）。

释放实验

1 ml制剂加入9 ml含50% FBS的葡萄糖溶液，37℃下设定时间点（0、1、2、4、6、12、24 h）取样。Dowex®树脂除去游离DOX后，荧光分光光度计测定脂质体内残留药量，计算释放百分比。

细胞培养

C26结肠癌细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）购自伊朗巴斯德研究所。RPMI-1640培养基含10% FBS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，37℃、5% CO₂、95%湿度培养。

细胞相互作用与摄取实验

12孔板每孔种2.5×10⁵细胞，过夜贴壁后加入制剂，4℃和37℃孵育3 h。PBS洗细胞，胰酶消化收集，流式细胞仪（BD FACSCalibur）检测DOX荧光强度，FlowJo 7.0软件分析数据。

荧光显微镜评价

6孔板盖玻片上种1×10⁶ C26细胞，过夜后加入游离DOX、Caelyx®、ED-lip孵育24 h。4%甲醛固定，含DAPI的Fluoroshield™染色封片。每张切片选6个视野（×200），利用DOX内源荧光评估摄取。半定量评分：1: 0–20%，2: 20–40%，3: 40–60%，4: 60–80%，5: 80–100%。

细胞毒性评价

MTT法测定IC₅₀。96孔板每孔种5×10³细胞，过夜后加入系列稀释制剂，37℃孵育1、3、6 h。洗去药物继续培养72 h。微孔板读数仪（Stat-Fax 2100）测OD₅₇₀/₆₃₀，计算IC₅₀。

动物实验

雌性BALB/c小鼠（4–6周，18–20 g），标准饲养条件。腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉。右侧皮下接种3×10⁵ C26细胞（60 μl PBS）。两周后肿瘤达~5 mm³，随机分组（生物分布n=3，抗肿瘤n=5）。方案经马什哈德医科大学动物伦理委员会批准，符合国际动物福利准则。

生物分布与药代动力学研究

接种14天后，尾静脉注射10 mg/kg Caelyx®或ED-lip，对照组注射200 μl PBS。3、12、24、48、72 h处死取血和组织（肝、脾、肾、肺、心、肿瘤）。荧光分光光度计测定各样品DOX浓度。血药浓度-时间曲线进行非室隔模型分析，计算AUC、AUMC、t_1/2、V_d、C_max、T_max、MRT、Cl等参数。

体内抗肿瘤活性评价

接种10天后可触及肿瘤，单次尾静脉注射10 mg/kg Caelyx®或ED-lip，PBS为阴性对照。监测终点时间（TTE）、肿瘤生长延迟率（TGD%）、中位生存时间（MST）、生存率。数显卡尺测量肿瘤体积：体积=(高×长×宽)×0.52。伦理终点：肿瘤>1000 mm³、体重下降>20%或出现虚弱症状即处死。