高效肿瘤靶向光化疗诊疗一体化纳米颗粒：青蒿琥酯负载、ICG修饰人血清白蛋白

摘要

报道一种肿瘤特异性诊疗一体化平台，将四种临床批准药物——青蒿琥酯（Arte）、人血清白蛋白（HSA）、叶酸（FA）和吲哚菁绿（ICG）——整合为单一纳米颗粒（FA-IHA NPs）。这些纳米颗粒展现卓越光理化稳定性。ICG赋予近红外（NIR）荧光成像能力，并在单一808 nm激光下赋予光热（PTT）和光动力（PDT）治疗能力。同时808 nm照射触发受控Arte释放，增强化疗功效。体外和体内研究证实快速细胞摄取和选择性肿瘤富集，经共聚焦显微镜和HepG2异种移植小鼠NIR成像验证。单次NIR照射（808 nm，1 W/cm²）联合FA-IHA NPs完全抑制肿瘤生长且无复发。确立FA-IHA NPs作为影像引导光化疗临床转化有前景平台。

背景

影像引导光化疗（IGPC）作为个性化肿瘤学引人注目策略崭露头角，融合精准肿瘤定位与多模态治疗同时最小化附带损伤（1-4）。成功IGPC平台须：(i) 多功能性，集成诊断治疗模式；(ii) 生物相容、稳定、肿瘤靶向（5-8）。荧光成像因高灵敏度和良好时间分辨率常用于实时引导（9-16）。

光热治疗（PTT）和光动力治疗（PDT）可在NIR照射下统一，同时递送热量和活性氧（ROS）消融肿瘤细胞（17-19）。但单一疗法常因残留病灶失败导致复发（17-19）。传统化疗虽提供全身细胞毒性但缺乏特异性并伴随毒副作用（20-22）。因此IGPC结合局部光疗与靶向化疗有望克服这些局限。

纳米医学产出多种IGPC诊疗剂，含吲哚菁绿（ICG）、金属基纳米颗粒、碳纳米材料、聚合物体系（23-27）。ICG作为FDA批准NIR染料广泛用于心输出量、肝功能、眼血管造影临床诊断（28-29）。其800 nm强吸收促进高效PTT-PDT。但游离ICG不稳定、体内快速清除、自漂白、缺乏肿瘤特异性（31-32）。胶束、聚合物或蛋白纳米结构等载体封装改善其性能，但更生物相容、靶向ICG基复合物需求犹存（33-34）。

本文通过共价连接FA和ICG至HSA纳米颗粒同时包裹Arte——一种具有抗肝癌、肺癌、乳腺癌活性的天然抗疟化合物（35）——构建肿瘤靶向IGPC制剂。所得FA-IHA NPs利用FA介导受体摄取、HSA优异生物相容性、ICG和Arte双重治疗功效。此多功能构建体提供NIR成像、PTT-PDT和可控化疗递释，定位为临床转化多功能平台。

方法

材料

试剂含EDC、NHS、Arte（≥99%）源自Sigma-Aldrich；DAPI和CCK-8源自Aladdin；NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH和NH₂-PEG₂₀₀₀-FA源自西安瑞熙；DMEM和PBS源自Gibco；ICG-NHS源自同仁堂。所有化学品开瓶即用。

FA-IHA NPs合成与表征

Arte溶于DMSO后加入15 mL水。加入HSA（10 mg）室温搅拌3 h，随后用150 µL 0.5%戊二醛交联。对蒸馏水透析（MWCO 8-12 kDa）24 h得Arte负载HSA（Arte-HSA）。用EDC/NHS活化HSA羧基后与NH₂-PEG₂₀₀₀-FA偶联（3 h，4°C）再接枝ICG-NHS（30 min，室温）。最终FA-ICG-HSA@Arte（FA-IHA NPs）经去离子水透析24 h纯化。Arte和ICG负载率经UV-vis分光光度法定量（负载% = W₁/W₂ × 100%）。

形貌经透射电镜（TEM，日立）评估。流体动力学尺寸和ζ电位经动态光散射（DLS，Malvern Zetasizer）测定。吸收光谱记录于岛津UV-vis分光光度计。光热响应用808 nm连续激光（1 W/cm²）配合福禄克热电偶监测温度测量。光稳定性和荧光持久性分别经5次循环和30天评估。

热和pH触发Arte释放

FA-IHA NPs（50 µg/mL）在pH 6.5、pH 7.4、pH 6.5+NIR（808 nm，1 W/cm²，1 min脉冲）条件下孵育36 h。上清液287 nm UV-vis定量Arte释放。

单线态氧产生检测

DPBF（15 µL）与1 mL 10 µg/mL ICG或FA-IHA NPs混合照射（808 nm，1 W/cm²，5 min）。410 nm吸光度随时间下降反映单线态氧生成。

细胞培养与细胞摄取

HepG2细胞（ATCC）在含10% FBS、1%青霉素-链霉素DMEM中37°C、5% CO₂培养。摄取研究中细胞与游离ICG、IHA NPs或FA-IHA NPs（0.05 mg/mL ICG）孵育6 h，洗涤、固定、DAPI染色、共聚焦显微镜成像。流式细胞术定量内化率。

细胞内ROS产生检测

HepG2细胞（2×10⁵ cells/mL）经PBS、Arte、FA-HA-NPs、游离ICG、IHA-NPs或FA-IHA NPs处理12 h，照射（808 nm，1 W/cm²，5 min）。加入DCFH-DA（5 µg/mL）30 min，经流式细胞术和荧光显微镜评估ROS水平。

体外肿瘤联合光化疗

HepG2细胞（2×10⁴ cells/well）经游离ICG、Arte、IHA NPs或FA-IHA NPs（Arte 0-30 µg/mL）处理6 h，照射（808 nm，1 W/cm²，5 min）或不照射。24 h后CCK-8测细胞活力。Calcein-AM/PI活死染色经共聚焦成像确认细胞毒性。

动物模型与体内荧光成像

Balb/c裸鼠（n=5）皮下接种1×10⁶ HepG2细胞。IVIS Spectrum成像（Caliper）追踪尾静脉注射游离ICG、IHA NPs或FA-IHA NPs后10 min、6 h、12 h、24 h、48 h NIR荧光。

体内肿瘤联合光化疗

小鼠随机分六组（n=5）：PBS、Arte、FA-IHA NPs、ICG+NIR、IHA+NIR、FA-IHA+NIR（等量Arte剂量）。NIR照射（808 nm，1 W/cm²，5 min）于24 h和48 h施用。肿瘤体积每4天记录并相对基线表达。治疗后主要器官收获H&E组织学检查。

结果与讨论

FA-IHA NPs合成与表征

图1示意FA-IHA NPs设计与治疗流程。纳米颗粒经简单生物相容方法组装，集成ICG用于NIR成像和光疗、Arte用于化疗作用。

透射电镜显示单分散球形颗粒（~131.2 nm）。动态光散射确认水、PBS、细胞培养基中流体动力学直径131±2.3 nm，ζ电位稳定-29.2±1.13 mV。7天粒径不变，指示PEG和HSA包覆赋予稳健胶体稳定性。UV-vis光谱显示Arte和ICG特征峰，确认成功负载（Arte 98.6±3.1%，ICG 56.9±2.4%）。荧光光谱匹配游离ICG，确认光物理特性保留。

光热评估显示FA-IHA NPs（等ICG含量）808 nm（1 W/cm²）照射5 min内温升~36°C，游离ICG显示相似升温而水仅<4°C。光稳定性测试显FA-IHA NPs五次照射循环吸光度保持，游离ICG强度下降，凸显共价偶联和HSA/PEG封装保护作用。4°C下30天荧光持久性显FA-IHA NPs衰减28%对比游离ICG 88%下降，突显优异光稳定性。

DPBF测定显FA-IHA NPs 5 min NIR暴露产生58%标准单线态氧产率，超越游离ICG（35%）。此增强反映双重光疗协同效应。

酸性条件（pH 6.5）和NIR照射下FA-IHA NPs Arte释放从11.6%（pH 7.4）增至68.4%（pH 6.5+NIR）。双重触发——HSA热膨胀和质子介导表面电荷改变——促进可控药物释放（37-38）。

细胞摄取与细胞内ROS检测

共聚焦成像显FA-IHA NPs处理HepG2细胞呈现显著红色ICG荧光，超越游离ICG和IHA NPs。流式细胞术定量FA-IHA NPs摄取率52.3%，显著高于IHA NPs（25.2%）和游离ICG（3.9%）——明确指示FA介导受体靶向（39-41）。

DCFH-DA评估ROS产生，5 min NIR照射后FA-IHA NPs处理组显著高于所有其他组，确认增强光动力活性（图6a,b）。

体外肿瘤联合光化疗

FA-IHA NPs 5 min NIR暴露后在所有处理中达最高温升（~31°C），关联优异光热性能（图7a）。无照射时Arte、IHA NPs、FA-IHA NPs呈浓度依赖性细胞毒性，游离ICG惰性。照射后FA-IHA NPs组细胞活力大幅下降，归因协同化疗-光热效应。Calcein-AM/PI双染色确认FA-IHA NPs+NIR近乎完全细胞死亡，其他组保留存活细胞（图7d）。

体内荧光成像

IVIS成像显所有制剂注射10 min内全身强荧光。肿瘤荧光24 h峰值，FA-IHA NPs每个时间点展现最高信号，确认FA驱动肿瘤富集（图8b）。24 h体外器官分析显所有组以肝脏摄取为主，符合肝脏清除途径（图8c）。

体内肿瘤联合光化疗

注射24 h后NIR照射下热成像显FA-IHA NPs温升最大（~22.1°C），确认强光热转换（图9a,b）。两次照射（第0天和第2天）导致FA-IHA+NIR组肿瘤完全消退，90天无复发且100%存活率，其他组均未达持续抑制（图9c,d）。组织学检查显FA-IHA+NIR组主要器官无显著病理改变，凸显可忽略全身毒性（图10）。

结论

构建多功能诊疗一体化纳米颗粒，共价偶联FA和ICG同时在HSA中包裹Arte。FA-IHA NPs展现稳健胶体和光热稳定性，保留NIR荧光，NIR照射触发Arte释放。FA介导受体靶向产生高细胞摄取和肿瘤富集，实现光热-光动力-化疗协同攻击，体外体内根除肿瘤且无复发。结果确立FA-IHA NPs为影像引导肿瘤靶向光化疗临床转化极具前景平台。

缩略语

Arte:

青蒿琥酯

FA:

叶酸

HSA:

人血清白蛋白

ICG:

吲哚菁绿

NIR:

近红外

PDT:

光动力治疗

PEG:

聚乙二醇

PTT:

光热治疗