亲水HBP修饰rGO实现双pH/NIR触发DOX释放用于协同化疗-光热肿瘤治疗

摘要

本文报道一种简便路线，利用氨基端超支化聚合物（NHBP）还原石墨烯氧化物（GO）制备亲水性还原石墨烯氧化物（NrGO）。NrGO表现出优异的水分散性、强近红外（NIR）吸收、高效光热转化和化学稳定性。将化疗药阿霉素（DOX）负载于NrGO得双响应药物载体，在酸性肿瘤样条件或NIR激光照射下加速释放DOX。体外研究证实NrGO生物相容性好，DOX@NrGO对肿瘤细胞抑制优于游离DOX，展现有效化疗-光热协同效应。结果表明DOX@NrGO作为联合癌症治疗及其他生物医学应用的有前景平台。

引言

近红外（NIR）光热治疗（PTT）作为微创癌症治疗策略备受关注，因NIR光（700-1100 nm）组织穿透深、吸收低，在保护正常细胞的同时实现局部加热。PTT要求治疗剂结合高光热转化效率、良好生物相容性和水相胶体稳定性。

石墨烯基材料因其二维结构、大比表面积、可调光学性质成为PTT剂研究热点。但常规化学或水热法制备的还原石墨烯氧化物（rGO）常保留疏水性，限制生物应用。

我们利用水溶性、还原性的氨基端超支化聚合物（NHBP）将GO转化为亲水稳定的rGO（NrGO）。前期工作已证实NHBP能在保持分散性的同时功能化金属纳米颗粒。

此外，将细胞毒性药物负载于光热载体可协同化疗与PTT，热量不仅消融肿瘤细胞还加速药物释放。本文描述NHBP修饰rGO合成、光热性能、DOX负载、pH/NIR触发释放及对HeLa细胞的化疗-光热疗效。

材料与方法

材料

石墨烯氧化物（GO，厚0.8-1.2 nm，宽0.5-5 μm）购自XFNANO。阿霉素（DOX）购自华风联合科技。DMEM、FBS、胰蛋白酶、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）来自Thermo Fisher。MTT、DAPI、PI试剂来自Beyotime。其他试剂为国药分析纯级。

氨基端超支化聚合物（NHBP）制备

按前期方案合成NHBP。简述：四乙烯五胺（94 mL，0.5 mol）氮气保护下搅拌，滴加甲基丙烯酸甲酯甲醇溶液（43 mL，0.5 mol），交替加热冷却后室温搅拌4 h。旋转蒸发150 °C得黄色粘稠聚合物，重均分子量~7759。

NHBP还原GO制备NrGO

GO分散于去离子水超声处理，与NHBP按重量比1:10、1:20、1:30混合超声10 min，90°C搅拌1 h。所得悬浮液（NrGO-10、NrGO-20、NrGO-30）离心水洗三次。

DOX负载NrGO制备DOX@NrGO

NrGO悬浮液与DOX溶液按1:1重量比混合，室温搅拌24 h。离心收集复合材料，洗涤得DOX@NrGO。

表征与测量

透射电镜（TEM，JEOL JEM-2100）观察形貌。傅里叶变换红外光谱（FTIR，Nicolet iS10）扫描400-4000 cm⁻¹（分辨率4 cm⁻¹）。NanoBrook 90plus Zeta仪测ζ电位和流体动力学尺寸。UV-vis-NIR吸收光谱（400-900 nm，分辨率1 cm⁻¹）用Thermo Fisher Evolution 300记录。光热性能用808 nm激光（SFOLT）和热电偶温度计（DT-8891E）评估。样品（0.2 mL）在0.25 cm²光斑下以1 W cm⁻²照射5 min，实时记录温升。

药物释放实验

DOX@NrGO置于透析袋（MWCO 8000）含PBS（pH 7.4或4.0），37°C、100 rpm振荡孵育。NIR组每取样时间点后照射5 min。各间隔取出10 mL PBS补充等量新鲜缓冲液，UV-vis分光光度法测DOX浓度。

细胞毒性与化疗-光热评价

HeLa细胞96孔板种植5×10³/孔，培养至~80%融合。用NrGO（3.125-50 μg mL⁻¹）处理24、48 h，MTT法按式(1)测活力。DOX@NrGO（3.125-50 μg mL⁻¹）孵育4 h后，808 nm激光（0.5 W cm⁻²）照射5 min，继续培养20 h。MTT测活力，DAPI和PI染色共聚焦显微镜观察形态。细胞活力(%) = (OD样品/OD对照)×100%。

结果与讨论

理化表征

NHBP还原GO将棕色悬浮液转为黑色水分散液，确认成功转化。TEM图（图2）显示NrGO-30保留单层片层结构无聚集，表明NHBP未破坏石墨烯形貌。FTIR谱（图3）显示GO的1725 cm⁻¹ C=O峰消失，出现1633 cm⁻¹ C-N酰胺信号，证实NHBP共价连接。ζ电位（图4）由负值（GO）转为正值（NrGO），进一步支持表面功能化。UV-vis-NIR谱（图5）显所有NrGO样品在NIR窗口强吸收，而GO和NHBP单独几无NIR响应。流体动力学尺寸（图6）在不同NHBP比下一致，表明尺寸稳定。