大黄酚负载硬脂酸-接枝-壳聚糖低聚糖纳米胶束：设计、表征与抗肿瘤活性

摘要

本研究旨在制备表征大黄酚负载硬脂酸-接枝-壳聚糖低聚糖 (CSO-SA/EMO) 并评价其体外抗肿瘤活性。以硬脂酸-接枝-壳聚糖低聚糖为载体，用多种方法测定其理化性质。采用 FITC 标记硬脂酸-接枝-壳聚糖低聚糖考察细胞摄取行为。CSO-SA/EMO 经超声和透析法制备。体外研究粒径、表面电位、包封率、药物释放行为。MTT 法和流式细胞术研究 CSO-SA/EMO 对胃癌细胞影响。结果显示 CSO-SA/EMO 粒径较大、电位较小。MGC803 和 BGC823 细胞 12 h 胶束摄取充分，胶束能在小鼠病灶部位大量富集，实现良好被动 EPR 靶向。MTT 和细胞周期阻滞实验显示 CSO-SA/EMO 对 MGC803 和 BGC823 细胞抗肿瘤活性显著优于游离大黄酚。肿瘤体积、HE 染色和 TUNEL 实验证明 CSO-SA/EMO 对体内肿瘤组织有显著抗肿瘤效果。总之，超声-透析法提供制备 CSO-SA/EMO 简单有效方法。胶束系统递送大黄酚有效改善其抗肿瘤效果。

引言

大黄酚 (EMO) 是主要从大黄、虎杖、何首乌等中药提取的天然蒽醌衍生物。中医药 (TCM) 因低毒性、副作用少、成本低广泛用于临床研究[1]。

研究显示 EMO 具有广泛药理活性，包括免疫抑制、止咳、降压、抗炎、抗菌、抗癌活性。EMO 抑制癌细胞生长[2-4]，调控相关基因控制肿瘤细胞凋亡、成瘤、增殖、侵袭、转移[5-9]。EMO 抑制多种癌细胞：人结直肠腺癌细胞、肝癌细胞、淋巴白血病细胞[10]、人舌癌 SCC-4[11]。EMO 抑制胃癌、乳腺癌、前列腺癌肿瘤细胞增殖[7,12]。但 EMO 对正常人牙龈成纤维细胞[13]、人支气管上皮细胞[14]、人乳腺细胞[15] 无细胞毒性。这显示 EMO 对肿瘤细胞较正常细胞具有选择性细胞毒性。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰形式的天然多糖。该天然聚合物具有优异水溶性、生物功能性、血液相容性、微生物可降解性，以各种生物医学应用著称。我们在酸性条件下用壳聚糖酶降解高分子量壳聚糖 (450 kDa) 获得低分子量壳聚糖低聚糖 (CSO, 18 kDa)。CSO 能强力穿透细胞膜[16]，硬脂酸 (SA) 可通过糖蛋白途径进入细胞核。以碳二亚胺 (EDC) 为偶联试剂，CSO 经 SA 疏水修饰合成两亲性硬脂酸-接枝-壳聚糖低聚糖 (CSO-SA)。

尽管 EMO 具有广泛生物活性，但其蒽醌结构水溶性差。治疗药物经血液运输，溶解度直接影响吸收分布。CSO-SA 接枝物在水溶液中自组装形成内疏外亲纳米胶束。我们用超声探针将聚集态纳米胶束分散。因 EMO 和 CSO 均疏水，EMO 封装在胶束中心。

多种模型药物应用于 CSO-SA，需考虑模型药物分子量、结构、疏水性。现有研究包括姜黄素[17]、多柔比星[18]、硬脂酸拉米夫定[19]、奥沙利铂[20] 等能显著改善抗肿瘤效果。我们探索 CSO-SA/EMO 最佳负载条件。CSO-SA/EMO 创造溶解度和利用效率更高的新剂型。CSO-SA/EMO 可为模型药物或载体选择、胶束临床应用提供思路。

实验材料与方法

实验材料

BALB/C+/nu 雄性裸鼠来自浙江大学实验动物中心。低分化胃癌细胞株 MGC803 和 BGC823 购自 ATCC 细胞库。RPMI-1640 培养基和 FBS 来自杭州霍利叶生物科技公司。EMO、MTT、FITC、Hoechst 33342、DiR、三硝基苯磺酸、芘由 Sigma Aldrich 供应。浙江大学提供 CSO-SA。其他试剂均为 AR 级。

CSO-SA 临界胶束浓度 (CMC) 和 ¹H NMR 谱测定

本报告用荧光分光光度法以芘为荧光探针测定 CSO-SA CMC。不同浓度 CSO-SA 溶液加入芘丙酮溶液，过夜挥发丙酮。荧光分光光度法分析不同浓度 CSO-SA 溶液中芘发射光谱和峰值。记录第一峰 (I₁ = 374 nm) 和第三峰 (I₃ = 385 nm)。以对数浓度 (Log C) 为横坐标，I₁/I₃ 为纵坐标绘图，计算聚合物胶束 CMC。

CSO 和 CSO-SA 用 D₂O 溶解至 10 mg/ml 浓度。记录、比较、分析特征 CSO 和 CSO-SA ¹H NMR 谱峰。

胺取代度检测

用三硝基苯磺酸 (TNBS) 法检测胺取代度 (SD%)。

配制不同浓度 CSO 和 CSO-SA 溶液，依次加 4% NaHCO₃ 和 0.1% TNBS。37°C 水浴孵育 2 h，加 2 mol/L 盐酸。30 分钟超声后，紫外-可见分光光度法 344 nm 测吸光度。绘制标准曲线计算 CSO-SA 样品 SD%。

CSO-SA 粒径和电位

配制 1.0 mg/ml CSO-SA 溶液，超声细胞粉碎探针充分分散胶束。粒径和表面电位仪测定 CSO-SA 粒径和电位。

CSO-SA 细胞摄取

FITC 和 CSO-SA 溶液混合，过夜搅拌，转入透析袋。去离子水透析 24 h 去除未反应 FITC 和无水乙醇。最终获得 1.0 mg/mL FITC 标记 CSO-SA (FITC-CSO-SA) 溶液。

以 MGC803 和 BGC823 细胞为靶细胞考察 CSO-SA 细胞摄取。按细胞增殖速率接种 24 孔板过夜至完全贴壁。设定时间点加入 80 μL FITC-CSO-SA 溶液。10 μL Hoechst 33342 (1 mg/mL) 孵育 15 分钟染色细胞核。激光扫描共聚焦显微镜检测 FITC-CSO-SA 摄取。

CSO-SA 体内分布

用 DiR 荧光染料染色测定 CSO-SA 体内分布。透析制备 CSO-SA/DiR 溶液。

6 周龄雄性裸鼠为实验模型。裸鼠皮下接种 1×10⁸/mL MGC803 细胞。肿瘤体积约 200 mm³ 时尾静脉注射 CSO-SA/DiR。设定时间点麻醉小鼠。小动物活体成像仪 (波长 580-700 nm, 曝光 1000 ms) 记录 CSO-SA/DiR 体内时序分布。

HPLC 测定 EMO 浓度

HPLC 测定 EMO 浓度。EMO 用 Eclipse XDB-C18 填充柱 (4.6×250 mm, 5 μm) 和保护柱 (4.6×10 mm, 5 μm)。柱温 30°C，流速 1.0 mL/min，检测波长 254 nm，进样体积 20 μL。流动相甲醇/0.1% 磷酸 (85:15, v/v)。EMO 浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线确定最佳线性范围。所有 HPLC 进样样品经 0.45 μm 有机滤膜过滤保护柱柱。

CSO-SA/EMO 制备

本研究用超声探针封装 EMO。初始处方比 10% (EMO: CSO-SA, w/w) 为起点。EMO 溶液冰浴中缓慢滴加至胶束溶液。超声探针 20 循环 (400 W, 工作 2 s, 停 3 s)。

药物负载胶束转入透析袋 (MWCO, 3.5 kDa)，去离子水透析 24 h 去除溶剂乙醇。透析液离心去除游离 EMO 得纯 CSO-SA/EMO。

CSO-SA/EMO 性质 (粒径、电位、TEM、EE%)

粒径和表面电位仪测定 CSO-SA/EMO 粒径和表面电位。

0.1 mg/ml CSO-SA/EMO 溶液滴加碳膜覆盖铜网，2% 磷钨酸染色干燥。透射电镜观察 CSO-SA/EMO 形貌和粒径。

有机溶剂萃取和 HPLC 检测 CSO-SA/EMO 包封率 (EE%) 和药物负载量 (DL%)。200 μL CSO-SA/EMO 胶束溶液加 1.8 mL 甲醇分散胶束萃取药物，测得 EMO 浓度为 C_EMO。另取 400 μL CSO-SA/EMO 胶束溶液置超滤离心管离心 (12,000 rpm, 5 min) 取上清。EE% 和 DL% 按公式计算：

EE% = (10×C_EMO - C)×V / M_EMO × 100%

DL% = (10×C_EMO - C)×V / [(10×C_EMO - C)×V + M_CSO-SA] × 100%

其中 C_EMO 为胶束中 EMO 浓度，C 为超滤离心后药物负载胶束 EMO 浓度，V 为透析药物负载胶束体积，M_EMO 为负药时给予 EMO 量，M_CSO-SA 为 CSO-SA 质量。

体外药物释放评价

PBS (pH 7.2) 为释放介质研究 CSO-SA/EMO 药物释放。1 mL 药物负载胶束溶液置 3.5 kDa 透析袋两端封口，置含释放介质管中。透析袋置 37°C 水平恒温振荡器。设定时间点取样并等体积替换新鲜释放介质。HPLC 测定样品 EMO 含量计算累积释放量。

CSO-SA/EMO 细胞毒性

MTT 法检测 CSO-SA/EMO、CSO-SA、EMO 处理胃癌细胞存活率。约 10⁵/ml 浓度接种 96 孔板。加入不同浓度 CSO-SA/EMO、CSO-SA、EMO。不同时间孵育后加 20 μL MTT 工作液。4 h 孵育后加 200 μL DMSO，酶标仪测 570 nm 光密度 (OD)。

CSO-SA/EMO 对细胞周期影响

两细胞系细胞 10⁵/mL 密度接种 6 孔板。12 h 培养后加入 CSO-SA、CSO-SA/EMO、EMO 孵育 24 h。消化、收集、洗涤细胞。每样品加 500 μL PI 染色液，缓慢重悬细胞沉淀，37°C 避光孵育 30 min。流式细胞仪 488 nm 激发波长检测红荧光。FlowJo 软件分析 DNA 含量。

体内和组织学分析评价 CSO-SA/EMO 抗肿瘤效果

动物实验按浙江大学动物护理使用委员会指南进行。5-6 周龄雄性裸鼠右前侧腹皮下接种 1×10⁶ MGC803 细胞。肿瘤生长至直径约 5 mm 时随机分对照组、EMO 注射组、CSO-SA/EMO 注射组，每组 3 只。所有小鼠尾静脉每日一次静脉注射相关试剂 2 周。电子游标卡尺测量肿瘤长径 (a) 短径 (b)，公式 V = a × b²/2 计算体积。记录每只小鼠体重后收集肿瘤组织学分析。HE 染色测定肿瘤组织抑制率。原位细胞死亡检测包按说明书进行末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 切口标记 (TUNEL) 检测回肠末端组织细胞凋亡。

结果与讨论

CSO-SA CMC 和 ¹H NMR 谱

两亲性聚合物亲水介质中自组装成胶束。CMC 越低胶束形成越多，有利于静脉给药后维持胶束结构。CSO-SA 形成胶束时，芘荧光探针易进入胶束疏水核心，增加带电芘荧光强度，增强发射光谱强度。此时 I₃ 增加显著快于 I₁，I₁/I₃ 荧光强度比急剧下降。I₁/I₃ 图和 Log C 值可观察到显著拐点（图 1）。拐点计算 CMC 为 179.02 μg/mL。CMC 越小，形成胶束能力越强，抗稀释能力越强，改善静脉给药后胶束结构保护。

CSO-SA 荧光强度比 (I₁/I₃) 随对数浓度变化

EDC 作为交联偶联剂与 SA 羧基反应生成活性中间体 -OO-酰基异脲衍生物。此中间体与 CSO 伯氨基反应形成酰胺键。基于核磁共振质子谱确定确认 CSO-SA 结构。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 1.06 (m, CH₂), 1.02 (m, CH₃) 分别对应 SA 亚甲基质子和甲基质子。

氨基取代度

CSO-SA SD% 为壳聚糖上硬脂酸取代氨基百分比。TNBS 与壳聚糖游离氨基反应生成 344 nm UV 吸收的三硝基苯衍生物。344 nm UV 吸收确定壳聚糖三硝基苯衍生物标准曲线。计算 CSO-SA SD% 为 9.3 ± 8%。证实 CSO 和 SA 基于接枝比成功连接。

CSO-SA、CSO-SA/EMO 粒径和电位

表 1 显示 CSO-SA Z 平均粒径 139.3 ± 2.2 nm。PDI 0.179 ± 0.03 表明分散相对均一。相比 CSO-SA，CSO-SA/EMO Z 平均粒径和 PDI 增加。负载 EMO 后，CSO-SA/EMO 表面正电荷高于 CSO-SA。

细胞摄取

FITC 不影响 CSO-SA 理化性质。将荧光素 FITC 接枝入 CSO-SA 获得 FITC-CSO-SA。细胞 Hoechst 33342 染色后，共聚焦激光扫描显微镜观察 FITC-CSO-SA 细胞摄取。发现 MGC803 摄取随时间逐渐增加，FITC 荧光逐渐增强。BGC823 胶束摄取随时间依赖方式类似 MGC803。FITC-CSO-SA 细胞穿透能力好，在胃癌细胞胞质均匀分布（图 2）。

MGC803 (a) 和 BGC823 (b) 细胞 CSO-SA 胶束体外时间依赖性摄取 1、4、8、12 h (蓝色 Hoechst 33342; 绿色 FITC; 比例尺 = 50 μm)

CSO-SA 体内分布

近红外 (NIR) 成像技术利于穿透生物材料和组织。尾静脉注射 CSO-SA/DiR 后，小动物活体成像仪在不同时间观察记录 CSO-SA/DiR 分布。图 3 显示，尾静脉注射 4 h 后 CSO-SA/DiR 分布类似其他胶束，主要分布肝、脾、肿瘤组织。随时间增加，肿瘤部位纳米胶束分布强度逐渐增强。表明 CSO-SA 接枝物具有良好被动靶向能力，主要归因于纳米胶束 EPR 效应（图 3）。

静脉注射后不同时间 CSO-SA/DiR 全身图像

CSO-SA/EMO 制备

不同 pH 环境对药物负载影响

制备 CSO-SA 溶液调节 pH 考察 pH 对药物负载影响。图 4 显示 CSO-SA 药物负载能力好，pH 6.4-6.8 呈抛物线趋势。pH 6.6 药物负载最高，为最佳药物负载 pH（图 4）。

CSO-SA 接枝物不同 pH 值对药物负载影响. 数据为均值±SD (n = 3)

包封率、TEM 和药物负载量

CSO-SA 自组装成壳-核纳米复合胶束。疏水基团自发形成疏水核心排斥亲水介质。此结构为药物负载提供关键载体，因 EMO 疏水结构易封装于疏水核心。通过改变 EMO 剂量考察 CSO-SA 对 EMO 负载能力影响。图 5 显示，随 EMO 剂量增加，药物负载量增加。30% 比例时 CSO-SA 负载率高达 21.16%（图 5）。

EMO 和 CSO-SA 不同比例 (5-30%) 对药物负载影响. 数据为均值±SD (n = 3)

透射电镜 30,000 倍放大观察记录 CSO-SA/EMO 纳米胶束形貌和尺寸。

CSO-SA/EMO 中 EMO 释放

药物负载胶束溶液加入 3.5 kDa 透析袋，PBS (pH 7.2) 为释放介质。每取样等体积替换新鲜释放介质。

HPLC 测定不同时间点 EMO 浓度计算累积释放百分比。图 6 显示，CSO-SA/EMO 表现显著持释效果，优于游离 EMO。0.5 h 游离 EMO 释放 38.4%，CSO-SA/EMO 仅约 6.6%。4 h 游离 EMO 释放 83.7%，CSO-SA/EMO 约 32.5%。72 h 内游离 EMO 释放达 97.2%，CSO-SA/EMO 释放 78.4%。EMO 从 CSO-SA/EMO 药物负载胶束释放主要两途径：从胶束核心解离、从胶束核心渗透进入释放介质。

CSO-SA/EMO 72 h EMO 释放曲线. 误差线代表标准差 (n = 3)

CSO-SA/EMO 对胃癌细胞毒性

MTT 法为检测细胞活力标准方法。MTT 法测定游离 EMO、CSO-SA、CSO-SA/EMO 对 MGC803 和 BGC823 胃癌细胞细胞毒性。显示 EMO 和 CSO-SA/EMO 能剂量和时间依赖性抑制 MGC803 和 BGC823 细胞。但同浓度下，CSO-SA/EMO 对 MGC803 和 BGC823 抑制效果高于游离 EMO 溶液。计算胃癌细胞 EMO 和 CSO-SA/EMO IC₅₀ 值（表 2）。各时间点 (24 h, 48 h, 72 h) CSO-SA/EMO IC₅₀ 显著低于 EMO。CSO-SA IC₅₀ 显示 CSO-SA 为安全生物载体，生物毒性极低，证实 CSO-SA/EMO 细胞毒性源于 EMO（图 7）。

MGC803 和 BGC823 胃癌细胞经 CSO-SA、EMO、CSO-SA/EMO 处理 24 h、48 h、72 h 细胞活力. 数据为均值±SD (n = 3)

表 2 和图 7 显示 CSO-SA/EMO 递送系统细胞毒性显著高于游离 EMO。但模拟体内环境中 CSO-SA/EMO 和游离 EMO 释放，游离 EMO 0.5 h 释放 38.4%，CSO-SA/EMO 仅 6.6%。总体上，各时间点游离 EMO 浓度高于 CSO-SA/EMO。

此现象易解释。虽 CSO-SA/EMO 释放 EMO 相对缓慢，但抗肿瘤效果不减弱。许多研究显示纳米药物递送系统可提高化疗药物抗肿瘤活性[21]。

首先，虽游离 EMO 初期爆发活性，但难被细胞高效摄取，而 CSO-SA 通过内吞或吞噬大幅加速细胞摄取。

其次，CSO-SA/EMO 接近细胞膜时，纳米颗粒与细胞膜相互作用可影响纳米胶束结构性质及离子通道等生物大分子功能。因此，CSO-SA/EMO 附着细胞膜非单纯物理吸附，可改变细胞动态平衡进一步促进细胞毒性。

最后，游离 EMO 疏水蒽醌结构导致血液中分布差。CSO-SA/EMO 递送系统增加 EMO 溶解度、改善溶出，使周围细胞分子浓度更高。

流式细胞术检测细胞周期阻滞

细胞周期分析是恶性肿瘤临床治疗重要方面。药物敏感期应用周期特异性药物治疗肿瘤细胞显示疗效显著。虽然溴化乙锭类似物不穿透正常细胞，但可穿透受损细胞膜染色细胞核。PI 嵌入双链 DNA 产生红荧光，荧光强度与双链 DNA 水平成正比。PI 染色 DNA 后流式细胞术 (FCM) 测定 DNA 含量。基于 DNA 含量分布分析细胞周期分布和凋亡。

研究显示 EMO 影响细胞周期分布[11,22]。FCM 分析显示 CSO-SA/EMO 和 EMO 能阻滞 MGC803 和 BGC823 细胞于 G2/M 期。

MGC803 细胞同浓度 (20 μM) 接触 CSO-SA、游离 EMO、CSO-SA/EMO 溶液 24 h。MGC803 G2/M 期百分比分别为 8.95%、15.29%、23.12%。对照组 6.47%。同条件下 BGC823 细胞 20 μM CSO-SA、游离 EMO、CSO-SA/EMO 处理 G2/M 期百分比分别为 14.25%、16.79%、35.71%，高于对照组 (13.66%)。数据显示同浓度下 CSO-SA/EMO 比游离 EMO 更高效显著阻滞 MGC803 和 BGC823 G2/M 期。CSO-SA 与对照组无差异（图 8）。

EMO 和 CSO-SA/EMO 处理 24 h 后 MGC803 和 BGC823 细胞周期分布. Student t 检验, 数据为均值±SD (n = 3), (*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001)

CSO-SA/EMO 体内抗肿瘤效果

进一步研究 CSO-SA/EMO 抗肿瘤效果，体内评价肿瘤抑制率和细胞凋亡水平。结果显示 CSO-SA/EMO 和 EMO 均显著抑制肿瘤生长（图 9a）。CSO-SA/EMO 组肿瘤抑制率为 EMO 组三倍（图 9d）。各组小鼠体重无显著变化（图 9b），表明两者相对安全。各组肿瘤组织形态改变和凋亡显示 CSO-SA/EMO 显著抗肿瘤效果（图 9e,f）。

CSO-SA/EMO 体内抗肿瘤效果. a 各组肿瘤形态. b 各组小鼠体重. c 各组肿瘤体积. d 肿瘤抑制率. e 各组 TUNEL 染色肿瘤组织代表图 (比例尺 = 200 μm). f 各组 HE 染色肿瘤组织代表图 (比例尺 = 200 μm)

结论

本研究用多种方法测定 CSO-SA 结构、CMC、SD%、粒径、电位。结果证明两亲性 CSO-SA 作为载体性能良好。胃癌细胞荧光强度显示 CSO-SA 12 h 内快速摄取。裸鼠模型 72 h 内研究 CSO-SA 分布。随时间 CSO-SA 病灶分布更集中，展现良好被动靶向效应。

超声-透析法制备 CSO-SA/EMO。CSO-SA 药物负载能力强。环境 pH 6.6 时，30% 处方比药物负载达 21.6%。相比 CSO-SA，CSO-SA/EMO 粒径更大、zeta 电位更高。TEM 直接记录 CSO-SA/EMO 形貌。CSO-SA/EMO 72 h 内 EMO 释放 78.4%，表明体内平滑持续过程。通过多实验确认 CSO-SA/EMO 抗肿瘤效果优于游离 EMO。

MTT 法检测 CSO-SA 对胃癌细胞毒性。结果显示 CSO-SA 为安全生物载体。相比游离 EMO，CSO-SA/EMO 显著增强对胃癌细胞抗肿瘤活性。CSO-SA/EMO 更有效阻滞 MGC803 和 BGC823 细胞周期于 G2/M 期。肿瘤体积、HE 染色、TUNEL 实验证明 CSO-SA/EMO 抗肿瘤效果显著优于游离 EMO。

基于上述结果，CSO-SA 既生物相容又安全。本研究 CSO-SA/EMO 利用新型有效剂型治疗癌症，体内展现良好被动靶向效应。