新型负载大黄素硬脂酸-g-壳聚糖寡糖纳米胶束的制备与评价

摘要

本研究的目的是制备和表征负载大黄素的硬脂酸-g-壳聚糖寡糖 (CSO-SA/EMO) 并评估其体外抗肿瘤活性。本研究以硬脂酸-g-壳聚糖寡糖为载体，通过不同的方法测定其理化性质。使用 FITC 标记的硬脂酸-g-壳聚糖寡糖检查细胞摄取行为。 CSO-SA/EMO 是使用超声和透析制备的。体外研究了粒径、表面电位、包封率和药物释放行为。使用MTT法和流式细胞术研究CSO-SA/EMO对胃癌细胞的影响。结果表明，与硬脂酸-g-壳聚糖寡糖相比，CSO-SA/EMO 粒径较大，潜力较小。 MGC803 和 BGC823 细胞在 12 h 的胶束摄取是足够的，胶束能够在小鼠的病变部位大量积累，从而实现良好的被动 EPR 靶向。 MTT 和细胞周期停滞试验表明，与游离大黄素相比，CSO-SA/EMO 增强的抗肿瘤活性对 MGC803 和 BGC823 细胞显着。肿瘤体积、苏木精和伊红染色、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记实验证明CSO-SA/EMO在体内对肿瘤组织具有显着的抗肿瘤作用。总之，超声透析法为制备CSO-SA/EMO提供了一种简单有效的方法。使用胶束系统递送大黄素有效地提高了其抗肿瘤作用。

介绍

大黄素（EMO）是一种天然蒽醌衍生物，主要从大黄、虎杖、何首乌等中草药中提取。中药(TCM)因其低毒、副作用少、成本低而被广泛应用于临床研究[1]。

研究表明，EMO具有广泛的药理活性，包括免疫抑制、抗百日咳、抗高血压、抗炎、抗菌和抗癌活性。已发现 EMO 抑制癌细胞的生长 [2,3,4] 并调节相关基因以控制肿瘤细胞凋亡、肿瘤发生、细胞增殖、侵袭和转移 [5,6,7,8,9]。研究表明，EMO可以抑制多种癌细胞，如人结直肠腺癌细胞、肝癌细胞、淋巴细胞白血病细胞[10]、人舌癌SCC-4[11]。 EMO 可以抑制胃癌、乳腺癌和前列腺癌中肿瘤细胞的增殖 [7, 12]。然而，EMO 对正常细胞如正常人牙龈成纤维细胞 [13]、人支气管上皮细胞 [14] 和人乳腺细胞 [15] 没有细胞毒性作用。这些表明与正常细胞相比，EMO对肿瘤细胞表现出选择性的细胞毒性。

壳聚糖是一种天然多糖，是几丁质的脱乙酰形式。这种天然聚合物具有优异的水溶性、生物功能性、血液相容性和微生物降解特性，以其各种生物医学应用而闻名。我们在酸性条件下使用壳聚糖酶降解高分子量壳聚糖（450 kDa）以获得低分子量壳聚糖（CSO，18 kDa）。 CSO 可以强力穿透细胞膜 [16] 并且硬脂酸 (SA) 可以通过糖蛋白途径进入细胞核。以碳二亚胺（EDC）为偶联剂，用SA对CSO进行疏水改性，合成两亲性硬脂酸-g-壳聚糖寡糖（CSO-SA）。

EMO虽然具有广泛的生物活性，但其蒽醌结构难溶于水。由于治疗药物通过血流运输，它们的溶解度直接影响它们的吸收和分布。 CSO-SA 接枝物可以在水溶液中自组装形成内部疏水外部亲水的纳米胶束。我们使用超声探头从聚集状态分散纳米胶束。由于EMO和CSO都是疏水性的，EMO被包裹在胶束的中心。

几种模型药物应用于CSO-SA，这需要模型药物的分子量、结构和疏水性。现有研究包括姜黄素[17]、阿霉素[18]、拉米夫定硬脂酸盐[19]和奥沙利铂[20]，可显着提高抗肿瘤作用。我们探索了 CSO-SA/EMO 的最佳加载条件。 CSO-SA/EMO 创造了具有更高溶解度和利用效率的新剂型。 CSO-SA/EMO可为模型药物或载体的选择及胶束的临床应用提供思路。

实验材料和方法

实验材料

BALB/C+/nu雄性裸鼠购自浙江大学实验动物中心。低分化胃癌细胞系MGC803和BGC823购自ATCC细胞库。 RPMI-1640 培养基和 FBS 购自杭州冬青叶生物科技公司。 EMO、MTT、FITC、Hoechst 33342、DiR、三硝基苯磺酸和芘由 Sigma Aldrich 提供。浙江大学提供CSO-SA。其他购买的试剂均为AR级。

确定CMC和¹ CSO-SA的H NMR光谱

在这份报告中，CSO-SA 的临界胶束浓度 (CMC) 是通过荧光分光光度法测定的，使用芘作为荧光探针。将不同浓度的 CSO-SA 溶液加入芘丙酮溶液中，然后将丙酮蒸发过夜。采用荧光分光光度法分析芘在不同浓度CSO-SA溶液中的发射光谱和峰值。第一个峰值（I 1 =374 nm) 和第三个峰 (I 3 =385 nm) 的光谱被记录下来。我们绘制了对数浓度 (Log C) 作为横坐标和 I 1/我以3为纵坐标，计算聚合物胶束的CMC。

CSO和CSO-SA以10 mg/ml的浓度溶解在D2O中。 ¹ 记录、比较和分析 H NMR 谱的特征 CSO 和 CSO-SA 峰。

检测胺取代度

胺取代度（SD%）采用三硝基苯硫酸（TNBS）法测定。

制备不同浓度的 CSO 和 CSO-SA 溶液，然后依次加入 4% NaHCO3 和 0.1% TNBS。 37 ℃水浴温育2 h后，加入2 mol/L盐酸。超声处理30 分钟后，通过紫外-可见分光光度法在344 nm处测量吸光度。绘制标准曲线并计算CSO-SA样品的SD%。

CSO-SA 粒子大小和潜力

制备 1.0 mg/ml CSO-SA 溶液，并用超声波细胞破坏器探针将胶束完全分散。用粒径和表面电位分析仪测定CSO-SA的粒径和电位。

CSO-SA 的细胞摄取

将 FITC 和 CSO-SA 溶液混合，搅拌过夜，然后转移到透析袋中。未反应的 FITC 和无水乙醇通过用去离子水透析 24 h 去除。最后得到浓度为1.0 mg/mL的FITC标记的CSO-SA(FITC-CSO-SA)溶液。

MGC803 和 BGC823 细胞用作靶细胞以检查 CSO-SA 的细胞摄取。根据细胞增殖率，将细胞接种在 24 孔板中并培养过夜直至它们完全贴壁。然后在设定的时间点加入 80 μL FITC-CSO-SA 溶液。将细胞与 10 μL 的 Hoechst 33342 (1 mg/mL) 孵育 15 分钟以染色细胞核。激光扫描共聚焦显微镜检测FITC-CSO-SA对CSO-SA的摄取。

CSO-SA 的体内分布

CSO-SA 在体内的分布由 DiR 荧光染料染色确定。透析制备CSO-SA/DiR溶液。

六周龄雄性裸鼠作为实验模型。裸鼠皮下接种1×10⁸ /mL MGC803 细胞。 CSO-SA/DiR 通过尾静脉给药，肿瘤细胞体积约为 200 mm³ .然后在设定的时间点麻醉小鼠。使用小动物活体成像仪（波长范围，580-700 nm，曝光时间1000 ms）记录体内CSO-SA/DiR的定时分布。

HPLC 检测 EMO 浓度

EMO浓度通过HPLC测定。将 EMO 应用于带有保护柱（4.6 × 10 mm，5 μm）的 Eclipse XDB-C18 填充柱（4.6 × 250 mm，5 μm）。柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，进样量20 μL。流动相为甲醇/0.1% 磷酸 (85:15, v/v)。 EMO 浓度绘制为横坐标，峰面积为纵坐标。绘制 EMO 的标准曲线以确定最佳线性范围。所有 HPLC 进样样品均通过 0.45 μm 有机过滤器过滤以保护色谱柱。

CSO-SA/EMO 的准备

在这项研究中，EMO 是用超声波探头封装的。 10% (EMO:CSO-SA, w/w) 的初始配方比例被用作起点。将 EMO 溶液以逐滴方式缓慢加入冰浴中的胶束溶液中。然后施加超声波探头20 周期（400 W，工作2 s，停止3 s）。

将载药胶束转移到透析袋（MWCO，3.5 kDa）中，用去离子水透析 24 h，以除去溶剂中的乙醇。透析液离心去除游离EMO，得到纯CSO-SA/EMO。

CSO-SA/EMO 的特性（粒子直径势，TEM，EE%）

用粒度和表面电位分析仪测量了CSO-SA/EMO的粒度和表面电位。

将0.1 mg/ml CSO-SA/EMO溶液滴加到碳膜包覆的铜线上，用2%磷钨酸染色并干燥。透射电镜观察了CSO-SA/EMO的形貌和粒径。

通过有机溶剂萃取和 HPLC 检测 CSO-SA/EMO 的包封率 (EE%) 和载药量 (DL%)。向 200 μL 的 CSO-SA/EMO 胶束溶液样品中加入 1.8 mL 甲醇以分散胶束并提取药物。 EMO 浓度测量为 CEMO。另取400 μL CSO-SA/EMO胶束溶液置于超滤离心管中，离心（12,000 rpm，5 min）得到上清液。 EE%和DL%的计算公式如下：

$$ \mathrm{EE}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V/{M}_{\mathrm{EMO}}\times 100 \% $$$$ \mathrm{DL}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times \mathrm{V}/\left[\left( 10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V+{M}_{\mathrm{CSO}-\mathrm{SA}}\right]\times 100\% $$

其中 C EMO 是胶束中 EMO 的浓度，C 是超滤离心后载药胶束的 EMO 浓度，V 是进行透析的载药胶束体积，M EMO 是载药期间给予的 EMO 量，M CSO-SA为CSO-SA的质量。

药物体外释放评价

使用 PBS (pH 7.2) 作为释放介质研究了 CSO-SA/EMO 的药物释放。将1毫升载药胶束溶液置于两端密封的3.5 kDa透析袋中，然后置于含有管的适当释放介质中。将透析袋置于 37 °C 的卧式恒温振荡器中。在设定的时间点取样并替换为相同体积的新鲜释放介质。采用高效液相色谱法测定样品中EMO的含量，计算EMO的累积释放量。

CSO-SA/EMO 的细胞毒性

MTT法检测CSO-SA/EMO、CSO-SA和EMO处理胃癌细胞的存活率。将细胞以约 10⁵ 的浓度接种于 96 孔板中 /毫升。 CSO-SA/EMO、CSO-SA 和 EMO 以不同的浓度加入。孵育不同时间后，加入20 μL MTT工作液。孵育4 h后，加入200 μL DMSO，酶标仪测定溶液在570 nm处的光密度（OD）。

CSO-SA/EMO 对细胞周期的影响

将两种细胞系的细胞以10⁵ 的密度接种于6孔板中 /毫升。培养12 小时后，加入CSO-SA、CSO-SA/EMO和EMO并孵育24 小时。然后消化、收集和洗涤细胞。然后在每个细胞样品中加入500 μL的PI染色溶液，将细胞沉淀缓慢重悬，将细胞在37 °C避光孵育30 分钟。流式细胞仪在 488 nm 激发波长下检测到红色荧光。用FlowJo软件分析DNA含量。

通过体内和组织学分析评估 CSO-SA/EMO 的抗肿瘤作用

动物实验按照浙江大学动物护理和使用委员会指南进行。 MGC803 细胞 (1 × 10⁶ ) 皮下注射到 5 至 6 周龄雄性裸鼠的右前胁部。允许肿瘤生长到大约 5 mm 的直径。此时，将小鼠随机分为对照组、EMO注射组和CSO-SA/EMO注射组，每组3只。所有小鼠通过尾静脉静脉注射相关试剂，每天一次，持续2 周。使用电子游标卡尺测量肿瘤 (b) 的长 (a) 和短 (b) 直径。根据公式V计算肿瘤体积 =a × b² /2。记录每只小鼠的体重，然后收集肿瘤用于组织学分析。在苏木精和伊红（HE）染色后确定肿瘤组织中的肿瘤抑制率。使用原位细胞死亡检测试剂盒按照厂家说明书进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测回肠末端组织细胞凋亡。

结果与讨论

CMC 和 ¹ CSO-SA的H NMR光谱

两亲聚合物在亲水介质中自组装成胶束。较低的 CMC 导致更多的胶束形成。这有利于静脉给药后胶束结构的维持。当CSO-SA形成胶束时，芘荧光探针很容易进入胶束的疏水核，增加了带电芘的荧光强度，从而增加了发射光谱的强度。此时，我 3 明显快于I 1，因此，I 1/我 3 荧光强度比急剧下降。在 I 中可以观察到一个重要的断点 1/我 3 图和 Log C 值（图 1）。拐点计算表明CMC为179.02 μg/mL。 CMC越小，形成胶束的能力越强，抗稀释能力越强，从而改善静脉给药后胶束结构的保护。

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荧光强度比（I 1/我 3) 与CSO-SA的对数浓度对比

EDC作为交联偶联剂与SA的羧基反应形成活性中间体-OO-酰基异脲衍生物。这可以与 CSO 的伯胺基团反应形成酰胺键。基于核磁共振质子谱确定并确认了CSO-SA的结构。 ¹ H NMR (400 MHZ, D2O) δ 1.06 (m, CH2), 1.02 (m, CH3) 分别对应于SA的亚甲基质子和甲基质子。

氨基组的替代度

CSO-SA 的 SD% 是硬脂酸取代氨基在壳聚糖上的百分比。 TNBS 与壳聚糖上的游离氨基反应生成三硝基苯衍生物，在 344 nm 处有紫外吸收。壳聚糖三硝基苯衍生物的标准曲线通过紫外吸收在344 nm处测定。 CSO-SA 的 SD% 计算为 9.3 ± 8%。这证实了CSO和SA已根据其嫁接比例成功连接。

CSO-SA、CSO-SA/EMO 粒度和潜力

表 1 显示 CSO-SA 的 Z 平均值为 139.3 ± 2.2 nm。 PDI 为 0.179 ± 0.03，表明分散相对均匀。与CSO-SA相比，CSO-SA/EMO的Z-average和PDI增加。加载EMO后，CSO-SA/EMO的表面正电荷高于CSO-SA。

细胞摄取

FITC 不影响 CSO-SA 的理化性质。我们通过将荧光素 FITC 接枝到 CSO-SA 中获得了 FITC-CSO-SA。细胞用 Hoechst 33342 染色后，使用共聚焦激光扫描显微镜观察 FITC-CSO-SA 细胞的摄取。我们发现MGC803的摄取随着时间的增加而逐渐增加并且FITC荧光逐渐增加。 BGC823 的胶束吸收与 MGC803 以时间依赖性方式相似。 FITC-CSO-SA具有良好的细胞穿透能力，在胃癌细胞的细胞质中分布均匀（图2）。

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MGC803 中 CSO-SA 胶束的体外细胞时间依赖性摄取 (a ) 和 BGC823 (b ) 分别为 1、4、8、12 h 的细胞（蓝色，Hoechst 33342；绿色，FITC；比例尺 =50 μm）

CSO-SA 体内分布

近红外 (NIR) 成像技术有利于穿透生物材料和组织。裸鼠尾静脉注射CSO-SA/DiR后，使用小动物活体成像仪观察并记录不同时间CSO-SA/DiR的分布。如图3所示，尾静脉注射后4 h，CSO-SA/DiR的分布与其他胶束相似，主要分布在肝脏、脾脏和肿瘤组织中。随着时间的增加，纳米胶束在肿瘤中的分布强度逐渐增加。这表明CSO-SA移植物具有良好的被动靶向能力，主要是由于纳米胶束的EPR效应（图3）。

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静脉注射后不同时间的 CSO-SA/DiR 全身图像注射

CSO-SA/EMO 的准备

不同pH环境对载药量的影响

我们制备了 CSO-SA 溶液并调节 CSO-SA 的 pH 值以研究 pH 值对载药量的影响。如图 4 所示，CSO-SA 具有良好的载药能力，在 pH 6.4-6.8 范围内呈现抛物线趋势。在 pH 6.6 时可以看到最高水平的载药量，使该值成为载药的最佳 pH 值（图 4）。

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CSO-SA 移植物不同 pH 值对载药量的影响。数据表示为平均值 ± SD (n =3)

封装效率、TEM 和载药量

CSO-SA 自组装成壳核纳米复合胶束。疏水部分自发形成疏水核心结构以排斥亲水介质。这种结构为载药提供了一个关键的载体，因为 EMO 的疏水结构可以很容易地封装在疏水核中。我们通过改变 EMO 的剂量研究了 CSO-SA 对 EMO 负载能力的影响。如图 5 所示，随着 EMO 剂量的增加，载药量增加。当比例为30%时，CSO-SA的负载率高达21.16%（图5）。

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EMO和CSO-SA的不同比例（5-30%）对载药量的影响。数据表示为平均值 ± SD (n =3)

CSO-SA/EMO 用透射电子显微镜放大 30,000 倍。观察并记录纳米胶束的形状和大小。

来自 CSO-SA/EMO 的 EMO 版本

将载药胶束溶液加入3.5 kDa透析袋中，PBS（pH 7.2）用作释放介质。每次取出样品时，更换相同体积的新鲜释放介质。

通过HPLC测定不同时间点的EMO浓度，然后计算累积释放百分比。如图 6 所示，与游离 EMO 相比，CSO-SA/EMO 表现出显着的缓释效果。这些结果表明，在 0.5 h 时，游离 EMO 的释放百分比为 38.4%，而来自 CSO-SA/EMO 的 EMO 释放百分比约为 6.6%。在 4 h 时，游离 EMO 的释放百分比为 83.7%，CSO-SA/EMO 的释放百分比约为 32.5%。在 72 h 内，游离 EMO 的释放率达到 97.2%，而 CSO-SA/EMO 的 EMO 释放率为 78.4%。 EMO通过两种主要方式从CSO-SA/EMO载药胶束中释放：通过EMO从胶束核中解离和从胶束核渗透到释放介质中。

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来自 CSO-SA/EMO 的 EMO 释放曲线超过 72 h。图中的误差条代表标准偏差 (n =3)

CSO-SA/EMO 对胃癌细胞的毒性

MTT 测定是检测细胞活力的标准方法。使用 MTT 测定法测量游离 EMO、CSO-SA 和 CSO-SA/EMO 对 MGC803 和 BGC823 胃癌细胞的细胞毒性。表明EMO和CSO-SA/EMO能够以剂量和时间依赖性方式抑制MGC803和BGC823细胞。然而，在相同浓度下，与游离 EMO 溶液相比，CSO-SA/EMO 对 MGC803 和 BGC823 细胞具有更高的抑制作用。计算了 EMO 和 CSO-SA/EMO 对胃癌细胞的 IC50 值（表 2）。 CSO-SA/EMO的IC50在每个时间点（24 h、48 h、72 h）均显着低于EMO。 CSO-SA的IC50值表明CSO-SA是一种安全的生物载体，生物毒性很小，证实了CSO-SA/EMO的细胞毒性是由EMO引起的（图7）。

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CSO-SA、EMO和CSO-SA/EMO处理24 小时、48 小时和72 小时后MGC803和BGC823胃癌细胞的细胞活力。数据表示为平均值 ± SD (n =3)

表 2 和图 7 显示 CSO-SA/EMO 给药系统的细胞毒性显着高于游离 EMO。然而，当模拟体内环境中CSO-SA/EMO和游离EMO的释放时，0.5 h时游离EMO的释放量达到38.4%，而CSO-SA/EMO的释放量仅为6.6%。总体而言，各时间点游离EMO的浓度均高于CSO-SA/EMO。

这种现象很容易解释。尽管 CSO-SA/EMO 释放 EMO 的速度相对较慢，但 CSO-SA/EMO 的抗肿瘤作用并未减慢或下降。许多研究表明纳米药物递送系统可以提高化疗药物的抗肿瘤活性[21]。

首先，尽管游离 EMO 表现出最初的活性爆发，但 EMO 不能被细胞有效地吸收，而 CSO-SA 通过内吞作用或吞噬作用极大地加速了细胞吸收。

其次，当CSO-SA/EMO接近细胞膜时，纳米粒子与细胞膜之间的相互作用会影响纳米胶束的结构和性质，以及离子通道等生物大分子的功能。因此，CSO-SA/EMO在细胞膜上的附着并不是简单的物理吸附，而是可以改变细胞的动态平衡，从而进一步提高CSO-SA/EMO的细胞毒性。

最后，游离 EMO 具有疏水性蒽醌结构，导致血液中分布不均。 CSO-SA/EMO给药系统增加了EMO的溶解度并改善了溶出度，导致周围细胞中的分子浓度更高。

FCM 检测细胞周期阻滞

细胞周期分析是恶性肿瘤临床治疗的一个重要方面。在药物敏感时期将周期特异性药物应用于肿瘤细胞已被证明具有很大的功效。虽然溴化乙锭类似物不能穿透正常细胞，但它们可以通过穿透受损细胞膜对细胞核进行染色。 PI 嵌入的双链 DNA 产生红色荧光，荧光强度与双链 DNA 的水平成正比。用 PI 染色 DNA 后，通过流式细胞术 (FCM) 测定 DNA 含量。基于DNA含量分布分析细胞周期分布和凋亡。

研究表明，EMO 会影响细胞周期分布 [11, 22]。 FCM分析表明CSO-SA/EMO和EMO可以阻断细胞周期G2/M期MGC803和BGC823细胞。

MGC803 细胞暴露于相同浓度 (20 μM) 的 CSO-SA、游离 EMO 和 CSO-SA/EMO 溶液 24 h。发现 G2/M 期 MGC803 细胞的百分比分别为 8.95%、15.29% 和 23.12%。对照组百分比为6.47%。 20 μM CSO-SA、游离EMO或CSO-SA/EMO在相同条件下处理的G2/M BGC823细胞百分比分别为14.25%、16.79%和35.71%，高于对照组(13.66%)。这些数据表明，在相同浓度下，CSO-SA/EMO 比游离 EMO 更有效、更显着地阻断 MGC803 和 BGC823 细胞的 G2/M 期。 CSO-SA 与对照无差异（图 8）。

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用 EMO 和 CSO-SA/EMO 处理 24 h 的 MGC803 和 BGC823 细胞的细胞周期分布。学生的t 计算测试，数据表示为平均值 ± SD (n =3), (*p <0.05, ^** p <0.005, ^*** p <0.001)

CSO-SA/EMO 体内抗肿瘤作用

为了进一步研究 CSO-SA/EMO 的抗肿瘤作用，在体内评估了肿瘤抑制率和细胞凋亡水平。结果表明，CSO-SA/EMO 和 EMO 对肿瘤生长都有显着的抑制作用（图 9a）。 CSO-SA/EMO组的抑瘤率是EMO组的3倍（图9d）。每组小鼠的体重没有显着变化（图9b）。这表明 CSO-SA/EMO 和 EMO 都相对安全。各组肿瘤组织形态学改变和细胞凋亡显示CSO-SA/EMO具有显着的抗肿瘤作用（图9e、f）。

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CSO-SA/EMO 在体内的抗肿瘤作用。一每组的肿瘤形状。 b 每组小鼠体重。 c 每组的肿瘤体积。 d 肿瘤抑制率。 e 来自每组的 TUNEL 染色肿瘤组织的代表性图像（比例尺 =200 μm）。 f 各组HE染色肿瘤组织的代表性图像（比例尺=200 μm）

结论

在这项研究中，我们用不同的方法检测了 CSO-SA 的结构、CMC、SD%、粒径和潜力。结果证明两亲性 CSO-SA 作为载体表现良好。 Fluorescence intensity of gastric cancer cells showed CSO-SA had been taken up rapidly within 12 h. Nude mice were used as a model to study the distribution of CSO-SA within 72 h. Over time, CSO-SA distribution in lesion became more concentrated exhibiting a good passive targeting effect.

CSO-SA/EMO was prepared with ultrasound-dialysis method. CSO-SA had strong drug-loading capacity. When environment pH was set at 6.6, the level of drug loading reached 21.6% at a 30% formulation ratio. Compared with CSO-SA, CSO-SA/EMO had bigger particle size and zeta potential. The shape of CSO-SA/EMO could be recorded directly using TEM. The release of EMO from CSO-SA/EMO was 78.4% within 72 h, it indicated a smooth and continuous process in body. Considering the antitumor effect of CSO-SA/EMO compared with free EMO, we confirmed it with various experiments.

CSO-SA toxicity to gastric cancer cells was detected by MTT assay. The results showed that CSO-SA was a safe biological carrier. Compared with that of free EMO, CSO-SA/EMO significantly enhanced the antitumor activity against gastric cancer cells. MGC803 and BGC823 cell cycle could be arrested in the G2/M phase more effectively by CSO-SA/EMO. Tumor volume, HE staining, and TUNEL assay proved more significant antitumor effect of CSO-SA/EMO than free EMO.

Based on above results, CSO-SA is both biocompatible and safe carrier. CSO-SA/EMO in this study utilizes a new and effective dosage formulation for the treatment of cancer and exhibits good passive targeting effect in vivo.