Cr³⁺/Eu³⁺ 共掺杂长余辉近红外发光纳米颗粒用于先进细胞成像

摘要

近红外 (NIR) 发光长余辉纳米颗粒已开发为潜在生物成像探针。然而，合成具有长余辉、适合长期成像的均一纳米颗粒仍属空白。本文通过溶胶-凝胶法结合后续无还原气氛煅烧，合成了尖晶石结构的 Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺ (ZGGO:Cr³⁺) 和 Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Eu³⁺ (ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺) 纳米颗粒。通过 XRD、TEM、STEM、选区电子衍射、光致发光激发 (PLE)/光致发光 (PL) 谱和温度依赖 PL 分析等组合技术详细表征。单晶纳米颗粒为均匀固溶体，具均一立方形貌、侧向尺寸 ~80–100 nm。273 nm UV 激发下，ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 在 697 nm 处显示 NIR 发射带 (畸变 Cr³⁺ ²E → ⁴A₂ 跃迁)，无 Eu³⁺ 发射。样品 NIR 持久发光超 7200 s 仍保持强烈强度。Eu³⁺ 掺入增强了 ZGGO:Cr³⁺ 的持久发光强度和余辉时间，但未显著影响热稳定性。所得 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ 纳米颗粒对体外细胞具有优异成像能力。

研究背景

长余辉发光材料可在停止激发后持续发光数小时 [1]。主要因其巨大研究价值，此类荧光粉已商业化为夜间/暗环境视觉材料，广泛应用于安防标识、应急路标、识别标记或医学诊断 [2]。典型长余辉荧光粉为商业化的原色发射体，如红光 Y₂O₂S:Eu³⁺,Mg²⁺,Ti⁴⁺ 或 CaS:Eu²⁺,Tm³⁺,Ce³⁺ [3,4]，绿光 SrAl₂O₄:Eu²⁺,Dy³⁺ 或 MgAl₂O₄:Mn²⁺ [5,6]，蓝光 CaAl₂O₄:Eu²⁺,Nd³⁺ 或 SrMgSi₂O₆:Eu²⁺,Dy³⁺ [7,8]。尽管可见光长余辉荧光粉取得诸多成功，近红外 (NIR) 区 (~700–2500 nm) 长余辉荧光粉的研究开发仍显不足。近年，显示红光或 NIR 发光的长余辉荧光粉潜在应用从夜视安防标识扩展至体内成像系统 [1,9,10]。

带光敏剂的长余辉材料作为体内药物首由 Chen 和 Zhang 尝试用于光动力治疗 [11]。随后 Scherman 等人报告了 NIR 发射荧光粉 Ca₀.₂Zn₀.₉Mg₀.₉Si₂O₆:Eu²⁺,Mn²⁺,Dy³⁺ 用于体内生物成像的里程碑工作 [12]。紧接着同组开发了性能改进的两种新 NIR 发射荧光粉 CaMgSi₂O₆:Eu²⁺,Mn²⁺,Pr³⁺ 和 Ca₂Si₅N₈:Eu²⁺,Tm³⁺ [13,14]。近期，采用固相法制备了具有 NIR 发射和长余辉的 Cr³⁺ 掺杂镓酸盐长余辉荧光粉，包括尖晶石 ZnGa₂O₄:Cr³⁺ 及其变体，如 Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺、Zn₃Ga₂GeO₈:Cr³⁺,Yb³⁺,Er³⁺ 和 ZnGa₂₋ₓ(Ge/Sn)ₓO₄:Cr³⁺ [1,9,10,15–21]。陶瓷片样品在 NIR 区表现高达 360 h 余辉，但块体材料不适合体内生物成像。采用溶胶-凝胶法结合无还原气氛煅烧合成了 ZnGa₂O₄:Cr³⁺ [22,23]、ZnGa₂O₄:Cr³⁺,Sn⁴⁺ [19–21] 和 Zn₂.₉₄Ga₁.₉₆Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Pr³⁺ [9] 等 NIR 发射长余辉纳米颗粒。纳米颗粒粉末在生物透明窗口展现明亮 NIR 发光和超长余辉。PEG 修饰大幅改善纳米颗粒生物相容性和水溶性，极具长期体内生物成像应用潜力，无需原位激发即可获得高信噪比。据信从碱土离子、镧系离子和 Li⁺ 中选取离子与 Cr³⁺ 共掺杂于锌镓酸盐和锌镓锗酸盐中可产生卓越 NIR 长余辉发光 [1]。Eu³⁺ 在氧化物宿主中在短 UV 激发 (250 nm 电荷转移带) 下总表现出 ~700 nm 红光发射 (⁵D₀–⁷F₄ 4f 跃迁) [24]。另一方面，Cr³⁺ 因窄带发射 (通常 700 nm，自旋禁阻 ²E–⁴A₂ 跃迁) 或宽带发射 (650–1600 nm，自旋允许 ⁴T₂–⁴A₂ 跃迁) 成为固体中有利发光中心 [1,20]。鉴于此，Cr³⁺/Eu³⁺ 共掺杂锌镓酸盐和锌镓锗酸盐将产生强烈 NIR 长余辉发光，因 O²⁻-Eu³⁺ 电荷转移带 (CTB) 与 O²⁻-Ga³⁺ CTB 重叠，且 Eu³⁺ ~700 nm 发射 (⁵D₀–⁷F₄) 与 Cr³⁺ 发射 (²E–⁴A₂) 重叠。此外，Eu³⁺ 取代畸变八面体位点 Ga³⁺ 可能产生适合 Cr³⁺ 周围的晶场强度，从而影响 NIR 发射。本工作通过溶胶-凝胶法结合无还原气氛煅烧合成 Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Eu³⁺ (简称 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺) 纳米颗粒，作为未来生物成像的有前景纳米探针。样品经 XRD、TEM、STEM、SAED、PLE/PL 谱和温度依赖 PL 分析等组合技术详细表征。以下章节报告 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 纳米颗粒的合成、表征和应用。

实验部分

合成

起始金属源为 Zn(NO₃)₂·6H₂O、Cr(NO₃)₃·9H₂O、Ga₂O₃、Eu₂O₃ 和 GeO₂，均为 99.99% 纯度，购自国药集团 (上海)。其他试剂为分析纯，购自沈阳化工试剂厂 (沈阳)。Zn(NO₃)₂·6H₂O 和 Cr(NO₃)₃·9H₂O 溶于去离子水。Ga₂O₃ 和 Eu₂O₃ 溶于硝酸溶液。GeO₂ 和乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶于稀氨水。向混合溶液缓慢加入 EDTA 溶液无沉淀，总金属离子与 EDTA 摩尔比保持 1:2。Zn:Ga:Ge:Cr:Eu 原子摩尔比固定为 3:1.984:2:0.01:0.006。终溶液室温剧烈搅拌 1 h，随后 85 °C 烘箱慢干蒸发水分至溶胶最终成凝胶。凝胶 200 °C 加热 3 h 成黑色多孔材料。最后研磨多孔材料，在流动 O₂ 气 (200 mL/min) 下选定温度煅烧 2 h。

表面官能化

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 粉末研磨 30 min，150 mg 样品加入 50 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液。超声 1 h 后室温剧烈搅拌 24 h。所得胶体溶液 1000 rpm 离心 10 min 去除大颗粒，上清液 10,000 rpm 离心 10 min 收集沉淀。所得 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-OH 纳米颗粒用去离子水洗涤三次。

10 mg ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-OH 纳米颗粒在超声辅助下分散于 4 mL 二甲基甲酰胺 (DMF) 10 min。加入 40 µL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES) 室温剧烈搅拌 24 h。所得 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ 纳米颗粒经 10,000 rpm 离心 10 min 收集，用 DMF 洗涤三次除去未反应 APTES。

细胞成像

Hek293T 细胞在 10% FBS 的 DMEM 中培养，接种于 35 mm 培养皿，CO₂ 培养箱中 2 h。所得 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ 纳米颗粒分散于细胞培养基 (50 mg/mL)，经 254 nm UV 灯激发 10 min 后移入处理 1 h 的培养皿。去除培养基后加入 0.1 mL 1% 甲醛-PBS，暗中加入 0.5 mL DAPI 染料染色 10 min。最后用 PBS 多次洗涤细胞以进一步表征。

所有涉及动物研究经大学动物护理使用委员会批准。

表征技术

相鉴定用 XRD (SmartLab; Rigaku, Tokyo) 在 40 kV/40 mA、镍滤波 Cu Kα 辐射、6.0° 2θ/min 扫描速度下进行。产物形貌经 TEM (JEM-2000FX; JEOL, Tokyo) 观察。荧光粉光致发光用 FP-8600 荧光分光光度计 (JASCO, Tokyo) 分析。持久发光信号用 Horiba JY FL3-21 获取。余辉衰减图像在暗室用 Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro 记录。细胞成像用激光扫描共聚焦显微镜 (LEICA TCS SP2, Germany) 进行。

所有涉及动物研究经大学动物护理使用委员会批准。

结果与讨论

首先用 XRD 考察样品相纯度。图 1 (上) 显示 1000 °C 煅烧制备的 ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ XRD 图谱，鉴定为尖晶石结构 Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀ [1,9]。Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀ 晶结构与 ZnGa₂O₄ (JCPDS No. 38-1240) 相同，为 ZnGa₂O₄ 和 Zn₂GeO₄ 固溶体。在 Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀ 结构中 Ge 替代 Ga 有利陷阱形成，ZnGa₂O₄ 为主导晶体结构 [1]。单元格内有两种阳离子；Zn²⁺ 和 Ga³⁺ 分别被四个和六个氧阴离子包围形成四面体和八面体 (图 1 下)。衍射数据计算得 ZGGO:Cr³⁺ 晶胞常数 a = b = ~0.8335 nm，接近尖晶石 ZnGa₂O₄ (a = b = ~0.8335 nm, JCPDS No. 38-1240)。因 Eu³⁺ 离子半径大于 Ga³⁺ (六配位 r_Eu³⁺ = 0.0947 nm, r_Ga³⁺ = 0.062 nm) [25]，ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 观测到较大 a = b = ~0.8336 nm。对 (311) 布拉格反射进行轮廓展宽分析，应用 Scherrer 方程得 ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 平均晶粒尺寸 83 ± 6 nm。图 1 (上) 还显示 900 °C 煅烧产物为尖晶石相 (JCPDS No. 38-1240) 和菱方相 (JCPDS No. 11-0687) 混合物，表明 ≥1000 °C 煅烧温度对获得相纯尖晶石 Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀ 是必要的。

ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ XRD 图谱及尖晶石 ZnGa₂O₄ 晶体结构

图 2 (左) 显示 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ TEM 形貌，清晰指示完全由立方颗粒组成，侧向尺寸 ~80–100 nm。锐利棱角和清晰晶格条纹暗示优异结晶度，~0.29 nm 间距与尖晶石 ZnGa₂O₄ (220) 晶面吻合 (d(220) = ~0.29 nm, JCPDS No. 38-1240) (图 2 插图)。因颗粒尺寸接近 XRD 计算平均晶粒尺寸，所得样品可能为单晶。SAED 分析 (图 2 右) 进一步确认纳米颗粒为单晶。此处纳米颗粒为直接固溶体而非机械混合物。Zn、Ga、Ge、Cr、Eu 元素映射 (图 3) 证实此固溶体：每个颗粒均含所有元素且均匀分布。

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 纳米颗粒 TEM、HR-TEM (左) 和 SAED 图样 (右)

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 纳米颗粒 STEM 颗粒形貌 (明场像) 和元素映射

图 4 显示室温下 ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 粉末激发光谱。监测 697 nm 处的激发谱覆盖极宽谱区 (200–650 nm)，含四主激发带峰值分别为 273、328、410、569 nm。273 nm 带归因于 ZnGa₂O₄ 宿主 O²⁻-Ga³⁺ 电荷转移带，后续带源自 Cr³⁺ 内跃迁：328 nm 为 ⁴A₂ → ⁴T₁(tₑ²)，410 nm 为 ⁴A₂ → ⁴T₁(t²e)，569 nm 为 ⁴A₂ → ⁴T₂(t²e) [19,20]。Eu³⁺ 掺入未显著改变 PLE 带位置但显著增加 Cr³⁺ 内跃迁强度，I₄₁₀/I₂₇₃ 从 0.18 增至 0.56。上述结果表明 Eu³⁺ 掺入有利可见光激发。然而最强激发带 273 nm 也揭示 O²⁻-Ga³⁺ 电荷转移带为最高效激发波长。273 nm 激发粉末给出 697 nm NIR 发射带 (图 5)，源于镓锗酸盐中畸变 Cr³⁺ ²E → ⁴A₂ 跃迁，无 Eu³⁺ 发射。

ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 粉末光致发光激发 (PLE) 谱

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 粉末光致发光 (PL) 谱

ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 纳米颗粒 NIR 持久发光衰减曲线在室温下 254 nm UV 光 (氙灯光源) 照射 5 min 后于 697 nm 监测 (图 6)。结果显示 ZGGO:Cr³⁺ 样品 NIR 持久发光超 7200 s 仍保持可观强度。ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 持久发光强度随 Eu³⁺ 掺入增加。据信镧系离子与 Cr³⁺ 共掺杂锌镓锗酸盐产生卓越 NIR 持久发光，因其在增加反位缺陷 (锌镓锗酸盐宿主中 Cr³⁺ 持久发光的成因) 中起重要作用 [1]。另一方面，ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 样品 NIR 持久发光持续时间长于 ZGGO:Cr³⁺，表明 Eu³⁺ 掺入可增加余辉时间。图 7 显示 Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro 在停止 UV 照射不同时间获得的 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 粉末 NIR 余辉衰减图像，进一步确认余辉超 120 min 且保持强烈 NIR 发射强度。

ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 粉末 254 nm UV 照射 5 min 后 697 nm 监测的 NIR 持久发光衰减曲线

Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro 在停止 UV 照射不同时间获得的 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 粉末 NIR 余辉衰减图像

评估荧光粉应用性能，特别是高功率应用，热稳定性为关键参数。为评估本工作荧光粉热淬火行为，在 298–573 K 范围分析 PL 谱 (图 8)。所有样品升温导致 697 nm 发射强度下降。为全面了解热淬火行为并估算活化能 (E_a)，采用阿伦尼乌斯方程 (式 1) [26,27,28]：

$$ I_T = \frac{I_0}{1 + c \exp(-E_a / kT)} $$ (1)

其中 I₀ 和 I_T 为初始和终温强度；c 为速率常数；E_a 为活化能；k 为玻尔兹曼常数 (8.629 × 10⁻⁵ eV K⁻¹)。图 8 显示 697 nm 发射带 ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 的 ln(I₀/I_T − 1) vs 10,000/T 关系线。计算得相近活化能：ZGGO:Cr³⁺ E_a = 0.23 eV，ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ E_a = 0.25 eV。单位时间非辐射跃迁概率 (α) 按式 (2) 定义 [29]：

$$ \alpha = s \exp(-E_a / kT) $$ (2)

其中 s 为频率因子 (s⁻¹)，k 为玻尔兹曼常数，T 为温度。较低 E_a 导致更大 α。因活化能相近，ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 表现出相近热稳定性，表明 Eu³⁺ 掺入未显著影响热稳定性。但相关声子边带 (PSBs) 在 670 nm 中心随高温变主导，诱导增强发射峰。

ZGGO:Cr³⁺ a 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ b 发射带热淬火活化能。插图显示 298–573 K 温度依赖 PL 谱

我们也考察了 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 水分散体的 PL 激发和发射谱 (图 9)。相比粉末，水分散体 PL 激发和发射曲线轮廓几乎相同，仅 300 和 600 nm 激发强度相对较弱。减弱可能源于水 O-H 振动淬火效应。

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 水溶液室温激发和发射谱。插图显示 254 nm UV 照射下水溶液数码照片

此处用 Hek293T 细胞进行体外成像测试。所得 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ 纳米颗粒分散于细胞培养基 (50 mg/mL)，经 254 nm UV 灯激发 10 min 后移入处理 1 h 培养皿。图 10 (左, 红色) 显示无激发条件下激光扫描共聚焦显微镜采集的细胞发光成像。1 h 后余辉发光信号仍足够强以精确测量，虽随时间逐渐减弱。对比同细胞经 0.5 mL DAPI 染色在另一模式下采集的发光成像 (图 10 右, 同步激发)。相似成像信号表明 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ 纳米颗粒对体外细胞具有优异成像能力。

Hek293T 细胞孵育 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ 纳米颗粒 1 h 后 LSCM 图像 (左, 红色)。右图 (蓝色) 为同细胞 DAPI 染色外观。比例尺 = 25 µm

结论

本工作通过溶胶-凝胶法结合无还原气氛煅烧合成尖晶石结构 ZGGO:Cr³⁺ 和 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 纳米颗粒。经 XRD、TEM、STEM、SAED、PLE/PL 谱和温度依赖 PL 分析等组合技术详细表征。均一立方、侧向尺寸 ~80–100 nm 的纳米颗粒为单晶均匀固溶体。273 nm 激发粉末给出 697 nm NIR 发射带，源于镓锗酸盐中畸变 Cr³⁺ ²E → ⁴A₂ 跃迁，无 Eu³⁺ 发射。ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ NIR 持久发光超 7200 s 仍保持强烈强度。Eu³⁺ 掺入增强 ZGGO:Cr³⁺ 持久发光强度和余辉时间，但未显著影响热稳定性。最终所得 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ 纳米颗粒对体外细胞具有优异成像能力。