PVP包覆BiF₃@Ln（Gd, Yb, Er）纳米粒子快速合成：用于先进低毒性CT成像

摘要

X射线计算机断层扫描（CT）广泛用于临床实践，常用碘海醇等造影剂增强正常与病变组织间CT成像对比度。然而此类造影剂具有一定毒性，急需新型CT造影剂。铋因高原子序数（Z=83）、低成本、良好生物安全性和优异X射线衰减性能（100 keV下5.74 cm²/kg），在纳米级CT造影剂领域备受关注。本文合成了平均粒径约380 nm的BiF₃:Ln@PVP纳米粒子（NPs）。经聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包覆后，BiF₃:Ln@PVP NPs具备良好稳定性和优异生物相容性。同时，与临床造影剂碘海醇相比，BiF₃:Ln@PVP NPs展现出更优的体外CT成像对比度。随后，原位注射BiF₃:Ln@PVP NPs后，肿瘤部位CT值显著高于注射前（注射前48.9 HU，注射后194.58 HU）。口服给予BiF₃:Ln@PVP NPs后，胃肠道（GI）道形态随时间清晰可见。最终，口服给药48 h内BiF₃:Ln@PVP NPs从小鼠GI道完全排出，未对GI道造成明显损伤。总之，易合成的BiF₃:Ln@PVP NPs可作为潜在临床造影剂，在CT成像中具有广阔应用前景。

引言

X射线计算机断层扫描（CT）能以高分辨率和低成本横断面成像内部组织器官，是诊断呼吸、消化、泌尿系统疾病的重要手段。然而CT有时病变与正常组织对比度低，临床广泛使用碘海醇等造影剂专门增强病变组织X射线衰减。但临床造影剂常需大剂量使用（因CT探测器灵敏度低），且商业碘基造影剂在体内代谢极快，有严重副作用（心脏事件、肾毒性），限制临床使用，亟待解决。

纳米材料在环境修复、光伏、催化剂等领域展现广阔前景。例如Balati等利用脉冲激光液相烧蚀（PLAL）结合微波辐射合成异质结光催化剂。纳米材料也广泛用于医学成像和治疗。金、钽、铂等高X射线衰减元素引起研究者兴趣，基于这些元素合成的纳米材料作为潜在CT造影剂研究充分。但其高价和不确定的生物安全性限制进一步应用。铋作为生物安全元素，低成本，临床用于幽门螺杆菌联合疗法及慢性肝病、胃十二指肠溃疡治疗，治疗期间生物安全性和耐受性良好。因高原子序数（Z=83）和优异X射线衰减能力（100 keV下5.74 cm²/kg），铋用于制备纳米级造影剂如HA-BiO NPs、Bi₂S₃、BION、Bi₂Te₃。例如Mohsen Mahvi等通过微波辅助聚醇法合成Bi₂Te₃纳米片，展现出优于商业碘海醇的X射线衰减系数。因此铋是构建高性能CT造影剂的有前景元素。但Bi基纳米造影剂制备复杂。

本文通过简便低成本方案将铋与镧系元素（Gd、Yb、Er）结合制备BiF₃:Ln@PVP纳米粒子，研究其CT成像造影潜力。PVP包覆后，BiF₃:Ln@PVP NPs表现出良好稳定性和低生物毒性。这些样品体外X射线衰减优于商业碘海醇，具有良好体内对比度，提供优异GI道CT成像。重要的是，口服给药48 h后纳米粒子完全排出体外，肝肾等重要器官无明显损伤。我们相信这项工作为纳米级CT造影剂临床应用提供新理论依据。

材料与方法

所有实验方案含动物实验均经厦门大学伦理委员会批准。

材料与试剂

硝酸铋五水合物、氟化铵、硝酸镱六水合物、硝酸铒六水合物、硝酸钆六水合物、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、碘海醇购自Aladdin试剂（上海）。Calcein-AM/PI活死细胞染色试剂盒和CCK-8试剂盒购自Yeasen（上海）。RPMI 1640培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国纽约）。

BiF₃:Ln@PVP NPs制备

采用水热法合成BiF₃:Ln@PVP NPs。详细：1 mmol Ln(NO₃)₃（Ln=Yb、Er、Gd）和1 mmol Bi(NO₃)₃溶解于含5 mL去离子水（DI）和30 mL乙二醇的35 mL溶液中形成透明溶液A。加入0.5 g PVP（Mw=10,000）室温搅拌10 min。20 mmol NH₄F溶于10 mL DI形成溶液B。溶液B倒入溶液A，搅拌20 min形成白色混合溶液C。溶液C置入50 mL高压釜，180°C反应24 h。自然冷却至室温后，离心（8000 rpm, 3 min）并用DI和酒精洗涤除去未反应物质。最终冻干收集样品。

BiF₃:Ln@PVP NPs表征

透射电镜（TEM, TECNAI G20 F30 TWIN, Oxford，300 kV）观察形貌。透射电镜能谱（EDS）含映射分析成分。傅里叶变换红外光谱（FTIR, Thermo Scientific Nicolet iN10 MX, USA）辨别官能团。粉末X射线衍射（XRD, D8 Advance, Cu Kα, 40 kV/40 mA）分析晶体结构和相特征。动态光散射（DLS, Brookhaven Instruments-Omni, USA）测定DI和PBS（pH 7.4）中分散纳米粒子粒径分布。

细胞系与培养：HepG2细胞源自中国科学院细胞库（上海）。含10% FBS和1%双抗的RPMI 1640培养基中，37°C、5% CO₂培养，隔天换液。

BiF₃:Ln@PVP NPs体外细胞相容性

通过活死染色和CCK-8实验评估体外细胞相容性。详细：HepG2细胞收集接种于共聚焦皿（5.0×10⁵），过夜培养。BiF₃:Ln@PVP NPs悬液按不同浓度（100, 200, 400 μg/mL）加入细胞作实验组，无纳米粒子培养基作对照组。共培养24 h后，轻吸原培养基，按厂家方案进行活死染色：活细胞Calcein-AM标记，死细胞碘化丙啶（PI）染色，共聚焦显微镜（Nikon, 日本）观察。

CCK-8实验进一步测定体外细胞毒性。HepG2细胞接种96孔板（3000细胞/孔）过夜。不同浓度BiF₃:Ln@PVP NPs（0, 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL）与细胞混合培养24 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，37°C孵育2 h。用SPECTRA max酶标仪（Bio-Rad 680, 日本）在450 nm测OD值，按厂家公式计算各浓度细胞活力。实验重复三次。

动物

雌性BALB/c裸鼠（4-6周龄）购自厦门大学实验动物中心（厦门）。无菌环境饲养，12 h明暗循环。皮下注射HepG2细胞（1.0×10⁷/mL）诱导成瘤。所有动物实验遵循厦门大学动物护理使用委员会批准方案。

BiF₃:Ln@PVP NPs体内生物相容性

组织学分析观察体内生物相容性。实验组小鼠尾静脉注射BiF₃:Ln@PVP NPs悬液（200 mg/kg），对照组注射等体积PBS。24 h后小鼠处死，立即取心、肝、脾、肺、肾、脑等主要器官。4%多聚甲醛固定12 h，包埋切片，HE染色。体式荧光显微镜（Leica DM2700 P, 德国）评估和拍摄器官形态。

BiF₃:Ln@PVP NPs体外和体内CT性能

研究体外CT成像应用：制备BiF₃:Ln@PVP NPs和碘海醇悬液，稀释至0, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/mL装入0.3 mL EP管。用X射线CT仪（Siemens，50 kV和80 kV）获取CT图像和CT值。研究体内CT成像能力：BiF₃:Ln@PVP NPs悬液（200 mg/kg, 100 μL）肿瘤内注射裸鼠。随后麻醉小鼠，用X射线CT（Siemens, 80 kV, 88 μA）注射前后拍摄CT图像。

BiF₃:Ln@PVP NPs GI道CT成像及组织学分析

进一步探索GI道CT成像价值：小鼠禁食过夜，经胃管口服给予BiF₃:Ln@PVP NPs悬液（300 μL, 20 mg/mL）。腹腔注射氯醛醛麻醉。在80 kV下于不同时间点（0, 15 min, 30 min, 120 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h）拍摄GI图像。最后用CT机重建小鼠3D模型。小鼠处死取胃、小肠、大肠，4%多聚甲醛固定12 h，包埋切片HE染色，评估BiF₃:Ln@PVP NPs GI道毒性。

统计分析

单因素方差分析（ANOVA），P<0.05视为统计学显著（95%置信水平）。

结果与讨论

BiF₃:Ln@PVP NPs制备及理化性质

通过水热反应制备BiF₃:Ln@PVP NPs（方案1）。图1A TEM显示BiF₃:Ln@PVP NPs形貌：均匀球形结构，平均粒径约380 nm，均匀分散（右下角插图显示窄粒径分布）。评估形貌后用EDS分析成分。图1B-F显示元素分析前暗场像。结果显示纳米粒子主要由Gd、Yb、Er、Bi元素组成，表明BiF₃:Ln@PVP NPs成功合成。

PVP是改善纳米材料生物相容性和稳定性的有效稳定剂。按文献[33]用PVP修饰纳米粒子。FTIR光谱确定PVP是否成功包覆纳米粒子表面（图2）。1658和1293 cm⁻¹分别有C=O强吸收峰和C-N峰，源自PVP，表明PVP成功包覆纳米粒子表面。BiF₃:Ln@PVP NPs XRD图谱见图3。图3A显示所有峰与标准卡BiF₃:Ln数据（PDF 74-0144）吻合，进一步证明成功制备。BiF₃结构原子参数可作标准cif卡初始参数（Diamond软件）。标准结构得PDF 74-0144，a=b=c=5.865 Å, V=201.75(3) ų, 密度=8.755。BiF₃晶体结构从C轴看呈垂直于A轴方向层状堆叠（图4B），从A轴看单个结构Bi在原子中心（图4C）。结果表明BiF₃:Ln@PVP NPs晶体结构良好，表面包覆仅轻微影响晶体结构。

BiF₃:Ln@PVP NPs稳定性与细胞相容性

纳米粒子分散粒径影响生物系统相互作用，需研究不同溶液中分散粒径。图4A,B显示BiF₃:Ln@PVP NPs在DI和PBS（pH=7.4）中分布较窄，表明在不同溶液中稳定性好，适合生物应用。

证明稳定性后研究细胞毒性。活死实验评估细胞毒性。BiF₃:Ln@PVP NPs悬液浓度达400 µg/mL与HepG2细胞共培养24 h，未观察到明显红色荧光（对比对照组；图4C），表明实验组无显著细胞死亡。随后CCK-8实验进一步研究细胞毒性。图4D显示HepG2细胞孵育各浓度BiF₃:Ln@PVP NPs悬液24 h后细胞活力，实验组均较高。浓度达400 μg/mL时细胞活力仍高达85.96%。结果证明BiF₃:Ln@PVP NPs具有良好体外生物相容性，可能归因于PVP表面包覆。

BiF₃:Ln@PVP NPs体内生物相容性

除低细胞毒性外，良好体内生物相容性是造影剂临床使用另一必要条件。制备BiF₃:Ln@PVP NPs悬液尾静脉注射小鼠（200 mg/kg, 100 μL），等体积PBS作对照。24 h后处死小鼠，剖检取主要器官。HE染色评估全身毒性。图5显示给药24 h后无明显病理异常。结果表明BiF₃:Ln@PVP NPs生物相容性好，与低细胞毒性一致。

BiF₃:Ln@PVP NPs体外CT成像能力

高原子序数元素通常因优异X射线衰减产生高对比度效应。例如贵金属（Au、Ag等）制备的造影剂有优异CT成像效果。但高成本限制临床应用。铋生物安全性好、低成本、具优异X射线衰减能力。为评价BiF₃:Ln@PVP NPs造影效果，体外比较其与商业碘海醇X射线衰减能力。图6A,B显示不同工作电压（50 kV和80 kV）下BiF₃:Ln@PVP和碘海醇CT图像。图像灰度随悬液浓度增加逐渐由黑变白。但同浓度下BiF₃:Ln@PVP色调更亮，因Bi X射线衰减系数高于I（100 keV下Bi 5.74 cm²/kg，I 1.94 cm²/kg）。

图6C显示CT值（HU）随BiF₃:Ln@PVP NPs和碘海醇浓度增加线性升高（R²>0.99），与工作电压无关。BiF₃:Ln@PVP NPs单位质量浓度CT值远高于碘海醇（50 kV和80 kV分别高1.5倍和1.7倍）。结果表明同等剂量下BiF₃:Ln@PVP NPs提供更好对比效果，确证其良好体外CT成像能力，意义重大：可减少造影剂用量同时保证成像效果，显著降低毒副作用。

BiF₃:Ln@PVP NPs体内CT成像对比效果

BiF₃:Ln@PVP NPs悬液（200 mg/kg, 100 µL）肿瘤内注射裸鼠评估体内CT成像对比效果。给药1 h后同一肿瘤区域检测到强信号强度变化（图7A）。图7B显示注射后CT值（184.58 HU）远高于注射前（48.9 HU）。这是BiF₃:Ln@PVP NPs分布肿瘤组织后X射线衰减系数增加所致。结果表明BiF₃:Ln@PVP NPs具有优异体内CT成像能力。

BiF₃:Ln@PVP NPs GI道CT成像性能及GI毒性

受上述结果鼓舞，进一步评估GI道CT成像潜在应用。CT作为常见无创成像方法，因图像处理方便、无组织损伤、患者无痛，在GI疾病诊断和治疗方案制定中起关键作用。常用硫酸钡造影剂常配合造气粉使用，因两物质产生不同密度，GI道不总能清晰显示导致漏诊，限制临床使用。因此探索无需额外辅助的高效GI造影剂意义重大。本工作探索BiF₃:Ln@PVP NPs对裸鼠GI道影响。

图8A显示口服BiF₃:Ln@PVP NPs悬液（20 mg/mL, 300 μL）15 min后胃和小肠形状可见。30 min随胃蠕动代谢，胃形态减弱。120 min大部分从胃代谢，仅剩胃轮廓。6 h大肠轮廓出现BiF₃:Ln@PVP NPs，表明纳米粒子开始在大肠富集；12 h大肠形态清晰可见。24 h大部分排出仅小部分残留。48 h无法观察GI形态，表明所有BiF₃:Ln@PVP NPs从GI道排出。纳米粒子完全排出后处死小鼠，取胃、小肠、大肠HE染色评估GI毒性。图8B显示口服48 h后胃、小肠、大肠无明显组织学改变，证明BiF₃:Ln@PVP NPs对GI道无显著毒性。结果表明BiF₃:Ln@PVP NPs可作为潜在GI道CT造影剂增强GI道CT成像性能，且对GI道无明显毒性。

这些结果表明BiF₃:Ln@PVP NPs作为肿瘤和胃肠道成像临床CT造影剂具有潜力。但受粒径限制，BiF₃:Ln@PVP NPs无法实现良好增强渗透滞留（EPR）效应。BiF₃:Ln@PVP NPs长期生物安全性和体内代谢过程需进一步研究。

结论

本文通过水热法合成新型CT造影剂。TEM数据显示BiF₃:Ln@PVP NPs均匀球形结构，平均粒径约380 nm。FTIR光谱显示PVP成功包裹纳米粒子表面改善生物安全性。不同工作电压下与碘海醇比较体外CT成像效果，结果表明BiF₃:Ln@PVP NPs X射线衰减能力优于碘海醇。生物相容性研究显示BiF₃:Ln@PVP NPs对体内主要器官无明显毒性。良好X射线衰减能力使BiF₃:Ln@PVP NPs体内具有良好对比成像效果，成功详细可视化GI道且不损伤GI道。因此，本工作提供高效CT造影剂，具良好水溶稳定性、生物安全性和高效率，使其成为临床造影剂潜在候选者。