BiF3:Ln (Ln =Gd, Yb, Er)@PVP 纳米粒子的简易制造，用于高效计算机断层扫描成像

介绍

X 射线计算机断层扫描 (CT) 可以以高分辨率和低价格对内部组织和器官进行横截面成像 [1, 2]。因此，它是诊断呼吸系统疾病、消化系统疾病和泌尿系统疾病的重要手段[3,4,5,6,7,8]。然而，CT有时在病变组织和正常组织之间具有低对比度。因此，碘海醇等造影剂广泛用于临床实践，以专门增强患病组织的 X 射线衰减。然而，由于CT检测器的低灵敏度，临床造影剂经常以大剂量使用[9]。此外，商业碘造影剂在体内代谢极快，副作用严重，包括心脏事件和肾毒性；这些问题限制了它们的临床应用，亟待解决[10,11,12,13,14,15]。

纳米材料在环境修复、光伏应用、催化剂等方面显示出广阔的应用前景[16,17,18,19,20,21]。例如，Balati 等人。 [22] 使用液体脉冲激光烧蚀 (PLAL) 和微波照射合成了异质结构光催化剂 (HBTiO2/RBIHM-MoS2)。纳米材料也被广泛应用于医学，包括成像和治疗。

金 (Au)、钽 (Ta)、铂 (Pt) 和其他具有高 X 射线衰减的元素引起了研究人员的兴趣，由这些元素合成的纳米材料已被充分研究为 CT 成像的潜在造影剂。 1、12、13、14、15、23、24]。然而，它们的高价格和不确定的生物安全性限制了它们的进一步使用。铋 (Bi) 是众所周知的低成本生物安全元素。它已用于临床实践，并在幽门螺杆菌的联合治疗中发挥关键作用 和其他疾病，包括慢性肝病以及胃和十二指肠溃疡。它在治疗过程中具有很好的生物安全性和耐受性[7, 25]。此外，由于其高原子序数 (Z =83) 和出色的 X 射线衰减能力 (5.74 cm ² kg ⁻¹ 在 100 keV) [26,27,28,29]。

例如，Mohsen Mahvi 等人。通过微波辅助多元醇工艺合成的 Bi2Te3 纳米薄片显示出比商业碘海醇更好的 X 射线衰减系数 [29]。因此，Bi 是构建高性能 CT 造影剂的有前途的元素。然而，Bi基纳米造影剂的制备较为复杂[30, 31]。

在这里，我们通过一种简便且低成本的方案将 Bi 与镧系元素（Gd、Yb、Er）结合来制造 BiF3：Ln@PVP 纳米颗粒（NPs）。然后我们研究了它为 CT 成像生成对比度的潜力。用 PVP 包覆样品后，BiF3:Ln@PVP NPs 表现出良好的稳定性和低生物毒性。这些样品在体外表现出比商业碘海醇更好的 X 射线衰减，具有良好的体内对比度，并提供出色的胃肠 (GI) 道 CT 成像。重要的是，在口服 BiF3:Ln@PVP 48 小时后，纳米颗粒完全从体内排出体外，对肝脏和肾脏等重要器官没有明显损害。相信我们的工作可能为纳米级CT对比剂的临床应用提供新的理论依据。

方法

包括动物实验在内的所有实验方案均经中国福建省厦门大学伦理委员会批准。

材料和试剂

五水合硝酸铋(Bi(NO3)3·5H2O, ≥ 99.99%)、氟化铵(NH4F, ≥ 99.99%)、六水合硝酸镱(Yb(NO3)3·6H2O, ≥ 99.99%) NO3)3·6H2O, ≥ 99.9%)、硝酸钆六水合物(Gd(NO3)3·6H2O, ≥ 99.9%)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP, ≥ 99.0%)、碘海醇(≥0% 99.0%)购自上海， 中国）。活死细胞染色试剂盒和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自Yeasen（中国上海）。 RPMI培养基1640、青霉素、链霉素、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。

BiF3 的制造：Ln@PVP NPs

BiF3:Ln@PVP NPs 是通过水热法合成的。详细地，将 1 mmol Ln(NO3)3、(Ln =Yb、Er 和 Gd)和 1 mmol Bi(NO3)3 溶解到 35 mL 溶液中，该溶液包括 5 mL 去离子水 (DI) 和 30 mL乙二醇形成透明溶液 A。然后将其与 0.5 g PVP (MW =10,000) 混合并在室温下搅拌 10 分钟。将 NH4F (20 mmol) 溶解在 10 mL DI 中形成溶液 B。然后将溶液 B 倒入溶液 A 中，搅拌 20 分钟后形成白色混合物溶液 C。然后将溶液 C 放入 50 毫升高压釜中并加热至 180°C 24 小时。 24 小时后温度自然下降到室温。最后，将样品离心（8000 rpm，3 分钟）并用去离子和酒精冲洗以洗去未反应的物质。最后的样品通过冷冻干燥收集。

BiF3 的特征：Ln@PVP NPs

BiF3：Ln@PVP NPs 的形态通过透射电子显微镜（TEM，TECNAI G20 F30 TWIN，Oxford）在 300 kV 的工作电压下进行检测。通过 TEM 中的能量色散谱 (EDS) 分析纳米粒子的组成，包括图谱分析。傅里叶变换红外光谱（FTIR，Thermo Scientific Nicolet iN10 MX 光谱仪，美国）用于区分样品的官能团。 BiF3:Ln@PVP NPs 的晶体结构和相特征在 40 kV 和 40 mA 条件下使用粉末 X 射线衍射（XRD，D8 Advance）和 Cu Kα 辐射。通过动态光散射（DLS，Brookhaven Instruments-Omni，USA）研究分散在DI和PBS（pH 7.4）中的纳米颗粒的尺寸分布。

细胞系和细胞培养：HepG2 细胞来自中国科学院细胞库（中国上海）。细胞在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI 培养基 1640 中在 37°C 和 5% CO 2 条件下培养。培养基每隔一天更换一次。

BiF3 的细胞相容性：Ln@PVP NPs 体外

BiF3:Ln@PVP NPs 在体外的细胞相容性通过活死试验和 CCK-8 试验进行评估。具体而言，收集HepG2细胞并以5.0 × 10 ⁵ 接种于共聚焦培养皿中。 .然后将细胞培养过夜。接下来将 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液以不同浓度（100、200 和 400 μg/mL）添加到细胞中，并设置为实验组。同时加入不含纳米颗粒的培养基作为对照组。随后，实验组和对照组均培养 24 小时。 24 小时后，我们轻轻去除原始培养基，然后根据制造商提供的方案进行活死检测。简而言之，活细胞用 Calcein-AM 标记，死细胞用碘化丙啶 (PI) 染色；然后在共聚焦显微镜（Nikon，Japan）下观察细胞。

进行 CCK-8 测定以进一步确定 BiF3:Ln@PVP NPs 的体外细胞毒性。具体而言，收集 HepG2 细胞并接种在 96 孔板中，每孔 3000 个细胞，并在培养箱中培养过夜。将不同浓度的 BiF3:Ln@PVP NP（0、25、50、100、200 和 400 μg/mL）与细胞混合并培养 24 小时。将 CCK-8 试剂 (10 μL) 添加到每个孔中并在 37°C 条件下孵育 2 小时。随后，通过SPECTRA max Microplate Reader（680型，Bio-Rad，Tokyo，Japan）在450nm处测量每孔的OD值，并根据制造商提供的公式计算每个浓度的细胞活力。这些实验重复3次。

动物

雌性 BALB/c 裸鼠（4 至 6 周龄）获自厦门大学实验动物中心（中国厦门）。小鼠在无菌环境中饲养并维持 12 小时的光/暗循环。给动物注射 HepG2 细胞（1.0 × 10 ⁷ /mL) 皮下注射以诱导肿瘤形成。本工作中的所有动物实验均按照厦门大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。

BiF3 的生物相容性：Ln@PVP NPs In Vivo

组织学分析用于观察 BiF3:Ln@PVP NPs 在体内的生物相容性。实验组小鼠通过尾静脉注射 200 mg/kg 的 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液；对照小鼠静脉注射相同体积的 PBS。 24 小时后，处死小鼠后立即取出主要器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑。所有器官用 4% 多聚甲醛固定剂固定 12 小时，然后包埋在石蜡中并切片。最后，进行苏木精-伊红 (H&E) 染色。采用立式荧光显微镜（Leica DM2700 P，德国）对器官的形态进行评估和捕获。

BiF3 的 CT 性能：Ln@PVP NPs 体外和体内

为了研究 BiF3:Ln@PVP NPs 在体外 CT 成像中的应用，制备了 BiF3:Ln@PVP NP 和碘海醇悬浮液并稀释至 0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 和 20.0 mg/mL，然后移入0.3 毫升 Eppendorf 管。 BiF3:Ln@PVP NP 和碘海醇悬浮液的 CT 图像和相应的 CT 值是通过 X 射线 CT 仪器（西门子）获得并记录的，操作电压分别为 50 kV 和 80 kV。接下来，研究了BiF3:Ln@PVP NPs在体内的CT成像能力； BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液以 200 毫克/千克（100 微升）的浓度被瘤内注射到荷瘤裸鼠中。随后，小鼠被麻醉，并使用X射线CT机（西门子，80 kV，88 μA）拍摄BiF3：Ln@PVP给药前后的CT图像。

BiF3 的 CT 性能：胃肠道和组织学分析中的 Ln@PVP NPs

为了进一步探索 BiF3:Ln@PVP NPs 在 CT 成像中的价值，小鼠禁食过夜并通过胃管口服 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液（300 μL，20 mg/mL）。然后用水合氯醛腹膜内麻醉小鼠。接下来，在 80 kV 下捕获不同间隔（0、15 分钟、30 分钟、120 分钟、6 小时、12 小时、24 小时和 48 小时）的 GI 图像。最后，通过CT机重建小鼠的3D模型。然后处死小鼠，取出胃、小肠和大肠，并用 4% 多聚甲醛固定 12 小时。然后将它们包埋在石蜡中并在H＆E染色前切片以评估BiF3：Ln@PVP NPs的胃肠道毒性。

统计分析

日期使用单向方差分析； P 值 <0.05 被认为在所有分析中具有统计学意义（95% 置信水平）。

结果与讨论

BiF3 的制造和理化性质：Ln@PVP NPs

首先，BiF3:Ln@PVP NPs 是通过水热反应制备的（方案 1）。图 1A 显示了 BiF3：Ln@PVP NP 的 TEM 形态。 BiF3:Ln@PVP NPs 具有均匀的球形结构。 BiF3:Ln@PVP NPs 的平均尺寸约为 380 nm，并且分布均匀。插入图显示纳米粒子具有相对较窄的粒度分布（右下）。在评估 BiF3:Ln@PVP NPs 的形态后，通过 EDS 分析 BiF3:Ln@PVP NPs 的组成。图 1B-F 显示了在元素分析之前拍摄的 BiF3：Ln@PVP NP 的暗场图像。结果表明，我们的纳米颗粒主要由Gd、Yb、Er和Bi元素组成，表明BiF3:Ln@PVP纳米颗粒合成成功。

BiF3:Ln@PVP NPs合成工艺及其应用示意图

BiF3：Ln@PVP NPs 的形态和粒径。 A BiF3:Ln@PVP NPs 的 TEM 图像及其粒度分布（右下）。 B –F BiF3：Ln@PVP NPs 图像的暗场TEM 和Gd、Yb、Bi 和Er 的相应TEM 元素图

PVP 是一种有效的稳定剂，可以提高纳米材料的生物相容性和稳定性[32]。因此，我们如先前报道的那样用 PVP 修饰了我们的纳米粒子 [33]。 FTIR 光谱用于确定 PVP 是否成功涂覆在纳米粒子的表面上（图 2）。在 1658 和 1293 cm ^-1 处有 C=O 基团强吸收峰和 C-N 基团峰 ， 分别。这些来自 PVP，表明纳米粒子表面的 PVP 涂层是完整的 [34]。 BiF3:Ln@PVP NPs 的 XRD 图如图 3 所示。图 3A 显示所有峰与标准卡 BiF3:Ln 数据（PDF 74-0144）完全匹配，进一步证明 BiF3:Ln@PVP NPs 制备成功。 BiF3结构的原子参数可以通过Diamond软件作为标准cif卡的初始参数。标准结构生成 PDF 74-0144，a =b =c =5.865 Å, V =201.75(3) Å，密度 (c ) =8.755。从 C 轴观察的 BiF3 晶体结构具有在垂直于 A 轴的方向上堆叠的层（图 4B），从 A 轴观察的单个结构显示 Bi 位于原子的中心（图 4C)。这些结果表明BiF3:Ln@PVP NPs具有良好的晶体结构，表面涂层对BiF3:Ln@PVP NPs的晶体结构影响很小。

BiF3:Ln@PVP NPs 的 FTIR 光谱。蓝线代表 BiF3:Ln 的初始吸收峰。红线代表PVP修饰纳米粒子表面后的吸收峰

BiF3:Ln@PVP NPs 的 XRD 图。 A BiF3:Ln 的所有峰都与标准卡 BiF3:Ln 数据 (PDF 74-0144) 匹配良好。 B 从C轴和C看原子分布 显示沿A轴的坐标

BiF3 的稳定性和细胞相容性：Ln@PVP NP。 A BiF3的流体动力学直径：DI和B中的Ln@PVP NPs PBS (pH 7.4)。 C 活死试验和D 用不同浓度的 BiF3:Ln@PVP NPs 处理 24 h 的 HepG2 细胞的 CCK-8 测定

BiF3 的稳定性和细胞相容性：Ln@PVP NPs

由于纳米粒子的分散尺寸会影响与生物系统的相互作用，因此有必要研究纳米粒子在不同溶液中的分散尺寸[33]。图 4A、B 显示 BiF3:Ln@PVP NPs 在 DI 和 PBS 中的分布相对较窄（pH =7.4），表明 BiF3:Ln@PVP NPs 在不同溶液中具有良好的稳定性。因此，它们适用于生物学应用。

在证明BiF3:Ln@PVP NPs在不同溶液中具有良好的稳定性后，研究了BiF3:Ln@PVP NPs的细胞毒性。活死实验评估了 BiF3:Ln@PVP NPs 的细胞毒性。当 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液的浓度达到 400 µg/mL 并与 HepG2 细胞一起培养 24 小时时，未观察到明显的红色荧光（与对照组相比；图 4C）。这表明实验组中没有显着的细胞死亡。随后，进行了 CCK-8 测定以进一步研究 BiF3:Ln@PVP NPs 的细胞毒性。图 4D 显示了 HepG2 细胞与不同浓度的 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液孵育 24 小时的细胞活力，HepG2 细胞的实验组都具有相对较高的细胞活力。此外，当 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液的浓度达到 400 μg/mL 时，细胞活力高达 85.96%。这些结果表明BiF3:Ln@PVP NPs在体外具有良好的生物相容性，这可能与PVP包覆在BiF3:Ln@PVP NPs表面有关。

BiF3 的生物相容性：Ln@PVP NPs In Vivo

除了低细胞毒性外，良好的体内生物相容性是造影剂临床使用的另一个必要条件[35]。因此，制备了 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液并通过尾静脉以 200 mg/kg (100 μL) 注射到小鼠体内。注射相同体积的PBS溶液作为对照组。 24 小时后，处死小鼠，并在尸检过程中切除主要器官。进行 H&E 染色以评估系统毒性。图 5 显示 BiF3:Ln@PVP NPs 给药 24 小时后没有明显的病理异常。这些结果表明BiF3:Ln@PVP NPs具有良好的生物相容性，这与上图所示的低细胞毒性相一致。

BiF3 前后主要器官的 H&E 染色图像：Ln@PVP NPs 给药（比例尺 200 µm）

BiF3 的能力：Ln@PVP NPs 体外 CT 成像

具有高原子序数的元素通常具有高对比度效果，因为它们的 X 射线衰减很大。例如，由具有高原子序数的贵金属（Au [36]、Ag [37] 等）制备的造影剂具有先前报道的优异 CT 成像效果。因此，可以考虑一种有前途的造影剂。然而，它们的高成本限制了它们进一步的临床应用。铋具有良好的生物安全性和低成本，具有很强的X射线衰减能力[38,39,40,41]。在此，为了评估 BiF3:Ln@PVP NPs 的造影剂效果，我们在体外比较了 BiF3:Ln@PVP NPs 与商业造影剂 Iohexol 溶液的 X 射线衰减能力。图 6A、B 显示了 BiF3：Ln@PVP 和碘海醇在不同工作电压（分别为 50 kV 和 80 kV）下的相应 CT 图像。图 6A、B 表明，随着悬浮液浓度的增加，图像的灰度逐渐从黑色变为白色。然而，在相同浓度下，BiF3:Ln@PVP 的色调比 Iohexol 更亮，因为 Bi 的 X 射线衰减系数更高 I（Bi 为 5.74 cm ² kg ⁻¹ 我是 1.94 厘米 ² kg ⁻¹ 在 100 keV) [42]。

BiF3:Ln@PVP NPs和碘海醇体外CT成像效果比较。 A , B BiF3：Ln@PVP NPs 和碘海醇在不同工作电压（分别为 50 和 80 kV）下的体外 CT 成像。 C BiF3:Ln@PVP NPs 和 Iohexol 分别在 50 和 80 kV 下的相应 CT 值

图 6C 显示 CT 值（Hounsfield Unit，HU）随着 BiF3:Ln@PVP NPs 和碘海醇浓度（均 R ² > 0.99) 与工作电压无关。 BiF3:Ln@PVP NPs 单位质量浓度的 CT 值远高于碘海醇（分别比 50 kV 和 80 kV 高 1.5 倍和 1.7 倍）。这些结果表明，与商业碘海醇相比，BiF3:Ln@PVP NPs 在相同剂量下可以提供更好的对比效果；这些数据证实了BiF3:Ln@PVP NPs具有良好的体外CT成像能力，这具有重要意义，因为它可以在保证良好成像效果的同时减少造影剂用量。可显着降低毒副作用。

BiF3 的对比效应：Ln@PVP NPs 体内 CT 成像

接下来将 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液瘤内注射到荷瘤小鼠体内（200 mg/kg，100 µL），以评估 BiF3:Ln@PVP NPs 体内 CT 成像的对比效果。在施用 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液 1 小时后，在同一肿瘤区域中检测到与基线相比强烈的信号强度变化（图 7A）。同时，图 7B 显示注射后的 CT 值（184.58 HU）远高于注射前（48.9 HU）。这是由于BiF3:Ln@PVP NPs分布在肿瘤组织中后肿瘤组织的X射线衰减系数增加。结果表明，BiF3:Ln@PVP NPs具有良好的体内CT成像能力。

BiF3：Ln@PVP NPs 体内 CT 成像效果。 A BiF3 前后 CT 图像：Ln@PVP NPs 注入和 B 相应的 CT 值。红色圆圈表示肿瘤组织

BiF3的胃肠道CT成像性能：Ln@PVP NPs及其胃肠道毒性

受到上述有希望的结果的鼓舞，我们有动力进一步评估 BiF3：Ln@PVP NPs 在 CT 成像中的潜在应用。 CT作为一种常见的无创影像学方法，由于其图像处理方便、无组织损伤、患者无痛等特点，在胃肠道疾病的诊断和治疗方案的制定中发挥着至关重要的作用[43, 44]。常用的硫酸钡造影剂通常与气源粉一起使用。由于两种物质产生的密度不同，胃肠道不能始终清晰显示，导致漏诊，从而限制了其在临床上的应用[45]。因此，探索不需要额外辅助的高效胃肠造影剂具有重要意义。在这项工作中，我们探索了BiF3：Ln@PVP NPs对裸鼠胃肠道的影响。

图 8A 显示在口服 BiF3:Ln@PVP NP 悬浮液（20 毫克/毫升，300 微升）15 分钟后，胃和小肠的形状变得可见。在 30 分钟时，BiF3:Ln@PVP NPs 随着胃的蠕动被代谢。胃形态变弱。在 120 分钟时，大部分 BiF3:Ln@PVP NPs 从胃中代谢出来，只有剩余的胃轮廓可见。 BiF3:Ln@PVP NPs 在第 6 小时开始出现在大肠的轮廓中，表明纳米颗粒开始在大肠中富集；大肠的形态在 12 小时时清晰可见。大多数 BiF3:Ln@PVP NP 被排出体外，只有一小部分保留在 24 小时。我们无法在 48 小时内观察到 GI 形态，表明所有 BiF3:Ln@PVP NPs 都从胃肠道排出。在纳米颗粒完全从胃肠道排出后，处死小鼠，取出胃、小肠和大肠进行 H&E 测定，以评估 BiF3:Ln@PVP NPs 的胃肠道毒性。图 8B 显示在口服 BiF3:Ln@PVP NPs 48 小时后，胃、小肠或大肠没有明显的组织学变化，这表明 BiF3:Ln@PVP NPs 对胃肠道没有明显的毒性。这些结果表明，BiF3:Ln@PVP NPs可作为潜在的胃肠道CT造影剂，增强胃肠道CT成像性能，同时对胃肠道无明显毒性。

A 口服 BiF3 后胃肠道的 CT 图像：不同时间间隔（0、15 分钟、30 分钟、120 分钟、6 小时、12 小时、24 小时和 48 小时）的 Ln@PVP NP。 B 口服 BiF3 前后胃、小肠和大肠的 H&E 染色图像：Ln@PVP NPs（比例尺，200 µm）。 “S”、“SI”、“LI”分别代表胃、小肠、大肠

这些结果表明 BiF3:Ln@PVP NPs 具有作为肿瘤和胃肠道成像的临床 CT 造影剂的潜力。然而，由于粒径的限制，BiF3:Ln@PVP NPs 无法实现良好的增强渗透性和保留（EPR）效果[46]。 BiF3:Ln@PVP NPs的长期生物学安全性及体内代谢过程有待进一步研究。

结论

在此，我们通过水热法合成了一种新型 CT 造影剂。 TEM 数据显示 BiF3:Ln@PVP NPs 具有均匀的球形结构，平均尺寸约为 380 nm。 FTIR光谱表明PVP成功包裹在纳米粒子表面，提高了纳米粒子的生物安全性。然后我们比较了不同工作电压下碘海醇的体外 CT 成像效果。结果表明，BiF3:Ln@PVP NPs 比碘海醇具有更好的 X 射线衰减能力。生物相容性研究表明，BiF3:Ln@PVP NPs 对体内主要器官无明显毒性。最后，良好的X射线衰减能力使BiF3:Ln@PVP NPs在体内具有良好的对比度成像效果，能够成功地对胃肠道进行细节可视化，而不会对胃肠道造成损伤。因此，我们的工作提供了一种具有良好水溶性稳定性、良好生物安全性和高效率的高效 CT 造影剂。这些特点使其成为临床造影剂的潜在候选者。

数据和材料的可用性

当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求向相应作者索取。

缩写

CT：

计算机断层扫描

PVP：

聚乙烯吡咯烷酮

GI：

肠胃

PLAL：

液体中的脉冲激光烧蚀

Bi：

铋

Gd：

硝酸钆

Yb：

镱

呃：

铒

Au：

黄金

Ta：

钽

点：

白金

我：

碘

NP：

纳米粒子

CCK-8：

细胞计数试剂盒-8

RPMI：

罗斯威尔公园纪念研究所

FBS：

胎牛血清

Ln：

镧系元素

DI：

去离子水

TEM：

透射电子显微镜

EDS：

能量色散谱

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

XRD：

粉末X射线衍射

DLS：

动态光散射

PI：

碘化丙啶

H&E：

苏木精-伊红

HU：

亨斯菲尔德单位

EPR：

增强渗透性和滞留性