脂质纳米颗粒共递送达卡巴嗪与全反式维甲酸协同增强抗黑色素瘤效果

摘要

恶性黑色素瘤是高侵袭性皮肤癌，致死率占皮肤癌死亡80%，转移性黑色素瘤患者中位总生存仅6-9个月。单一纳米载体同步递送双药的联合治疗被证明是抗癌的优雅高效策略。本研究基于FDA批准治疗黑色素瘤的达卡巴嗪（DBZ）与极具前景的抗癌药物全反式维甲酸（ATRA），构建脂质纳米制剂（RD-LNF）作为新治疗策略。成功将两药封装于脂质纳米制剂中并实现随时间控释。证明DBZ与ATRA同步递送可浓度依赖性有效抑制细胞增殖。组合纳米颗粒显著降低B16F10黑色素瘤细胞克隆形成能力。流式细胞术显示RD-LNF诱导更高比例凋亡细胞，显著抑制细胞周期进程与迁移。结果提示RD-LNF治疗恶性黑色素瘤具高疗效潜力。

引言

恶性黑色素瘤是主要发生于人类皮肤的侵袭性恶性肿瘤[1]。虽仅占皮肤癌4%，却导致80%皮肤癌死亡[2,3]，在欠发达与发展中国家日益受关注。黑色素瘤易转移至脑、心、肺等多器官[4]，属高度侵袭性恶性肿瘤。早期诊断可手术切除[5]，但手术不能保证完全治愈。放射生长期黑色素瘤对大多数化疗/放疗耐药[6]。特异性，黑色素瘤细胞表面肽受体过表达，亚型-2生长抑素受体（SSTR2）高表达[7]。

达卡巴嗪（DBZ），即二甲基三氮唑咪唑羧酰胺（DTIC），是FDA批准的唯一一线化疗药[8]。DBZ作为强烷化剂，通过向癌细胞DNA/核物质添加烷基杀伤癌细胞[9]。但DBZ水溶性差、血液循环半衰期短（41 min）[10]，削弱治疗效果。单药治疗有效率仅10-25%，完全缓解<5%[11,12]，凸显单药局限。迫切需要替代策略提升DBZ疗效。

单一载体共递送多药物比单药更有效[13]。共递送赋予协同活性、相似药代动力学、更高抗癌疗效[14]。全反式维甲酸（ATRA）是治疗多种癌症的有前景药物[15]。ATRA结合癌细胞核内维甲酸受体，抑制生长、增殖、分化，最终致细胞死亡[16]。与其他化疗药不同，ATRA不致心脏毒性或骨髓增生不良等不良反应。ATRA与适当化疗药联用可增强抗癌疗效[17]。但ATRA疏水性差、全身清除快，需稳定递送系统[17]。

纳米颗粒递送系统利用增强渗透滞留效应（EPR）在靶向肿瘤组织释放药物、避免全身循环脱靶效应，提升包裹药物疗效[18,19]。固体脂质纳米颗粒（SLN）因稳定性增强、控释、高负载、制备/放大容易，成为脂质体、胶束等现有载体的替代选择[20]。SLN作为药物载体的重要方面是脂质安全性：GRAS认可、耐受性好、生理脂质[21]。药物稳定掺入脂质核心改善水溶性、优化药代动力学、延长全身循环生理稳定性[22]。

本研究针对黑色素瘤恶性肿瘤，提出DBZ与ATRA经脂质纳米制剂共递送的联合治疗新策略。预期DBZ负载于脂质核心，ATRA作为纳米颗粒结构组分。研究了理化性质、细胞摄取、体外细胞毒性，并通过凋亡实验、细胞周期分析、克隆形成、细胞迁移分析进一步评价抗癌效果。

材料与方法

DBZ/ATRA负载脂质纳米制剂制备

采用超声法制备。简述：10 mg DBZ与10 mg ATRA溶于2 mL含50 mg卵磷脂（PC）与2 mg DSPE-mPEG₂₀₀₀的氯仿溶液。氩气吹干有机溶剂20 min。干燥药脂混合物加80 mg三十烷酸甘油酯（Tm），65℃孵育1 h。加5 mL 4%普鲁酮（Poloxamer）溶液，探针超声80 W、6 min。所得乳液冰浴冷却30 min。Amicon Ultra 0.5离心滤管（3 kDa截留，Merck）12000×g离心20 min。滤液中游离DBZ、ATRA经HPLC法定量，计算包封效率与负载量。Waters HPLC系统：1525二元泵、2487 UV检测器、2475荧光检测器、1500柱温箱、Symmetry C18柱。ATRA流动相：乙腈/三氟乙酸=90/10（v/v），1 mL/min，348 nm检测。DBZ流动相：乙腈/0.05 M磷酸氢二钠=30/70（v/v）含0.5% TEA，pH 3.7，1 mL/min。

粒径与形貌分析

Malvern Zetasizer Nano ZS90（He-Ne激光633 nm）测粒径分布，样品蒸馏水稀释，24℃三次重复。透射电镜（TEM，JEOL JEM200CX，120 kV）观察形貌，样品2%磷钨酸染色干燥后观察。

体外药物释放

透析法评价释放行为。封装当量1 mg ATRA与1 mg DBZ的2 mL纳米颗粒于透析袋（Spectra/Por，MWCO 3.5 kDa），置于25 mL释放缓冲液中，37℃、100 rpm旋转。预设时间点至72 h取1 mL样品并等量补鲜缓冲液。HPLC法定量DBZ与ATRA。

细胞培养与细胞摄取分析

小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16F10购自中国细胞系基础设施（北京）。RPMI-1640培养基（10% FBS、1%抗生素）培养，每2天换液，90%融合后传代。摄取分析：B16F10接种6孔板24 h，纳米颗粒负载香豆素-6作荧光示踪。除旧液，加含香豆素-6脂质纳米颗粒新鲜培养基，逆序孵育1-3 h。洗涤刮收细胞，1200 rpm离心5 min，沉淀重悬1 mL冷PBS。Accuri C6流式细胞仪（BD）检测。

体外细胞毒性实验、凋亡实验、细胞周期分析、克隆形成实验、细胞迁移实验、统计分析

（详细步骤见原文，此处保留关键参数与结果。）

结果与讨论

DBZ/ATRA负载脂质纳米制剂制备与表征

黑色素瘤治疗仍是重大挑战，标准化疗/放疗/手术仅对实体块状肿瘤有效且预后差。FDA批准紫杉醇或其联合方案但未改善总生存与治愈率。DBZ虽为FDA批准一线化疗药，但理化性质差、有效率仅10-25%。为应对挑战，我们开发ATRA与DBZ脂质纳米制剂联合新策略（图1）。假设双药组合增强抗肿瘤疗效。值得注意的是ATRA虽有抗癌性但无全身不良反应[23]。DBZ疏水，设计脂质纳米制剂稳定掺入疏水药物于脂质核心，ATRA作为纳米颗粒结构组分负载。药物负载脂质纳米颗粒助力深部肿瘤递送。DBZ与ATRA包封效率分别为91.2±1.25%、95.8±1.14%。负载量分别为7.07±0.65%、7.48±1.05%（w/w）。D-LNF粒径121.5±1.65 nm，PDI 0.134，Zeta -23.5±0.85 mV。RD-LNF粒径138.2±1.28 nm，PDI 0.159，Zeta -25.4±0.58 mV。粒径增加主要因ATRA结构负载，但终粒径<150 nm，利于EPR效应在黑色素瘤肿瘤富集。亲水PEG防止聚集、减少网状内皮系统（RES）摄取、改善体内表现。~ -25 mV表面电荷赋予优异储存稳定性。TEM形貌（图2）：D-LNF与RD-LNF均呈完美球形、均匀分布，粒径差异与DLS一致，无碎片/小颗粒/聚集，制备成功。

稳定性分析与体外药物释放

RD-LNF在pH 7.4（PBS）与血清（10% FBS）条件下稳定性优异（图3a）：粒径全程无显著增加，证实纳米颗粒稳定。药物及时释放决定疗效。PBS（pH 7.4）中考察DBZ从D-LNF、RD-LNF及ATRA从RD-LNF释放动力学（图3b）：两系统均无爆发释放或相释放，表明药物稳定包裹于核心而非表面。DBZ从D-LNF与RD-LNF释放无显著差异，ATRA未改变DBZ释放模式。RD-LNF中DBZ释放轻微延迟，或因ATRA增加脂质结构扩散路径。有趣的是ATRA在RD-LNF中释放显著慢于DBZ，24-72 h差异显著，主因ATRA极强疏水性及结构组分身份。总体无爆发释放、控释特性将获益黑色素瘤治疗。

体外细胞摄取

高效细胞摄取决定纳米颗粒治疗功效。B16F10细胞摄取RD-LNF，香豆素-6作荧光示踪（图4）：1 h即观察到显著内化，摄取量持续增加至3 h。脂质载体高摄取特性一致。推测被动扩散与内吞机制共同作用。内吞后纳米颗粒至溶酶体释放药物发挥药理作用。

体外细胞毒性实验

MTT法评价抗癌效果（图5a）。先评价游离DBZ、ATRA单药：DBZ呈浓度依赖性细胞毒性；ATRA在B16F10中展现显著更高细胞毒性。100 μg/mL时DBZ细胞活力~45%，ATRA~22%，显示ATRA优异治疗功效。为验证共递送协同抑制癌症进展，处理RD-LNF（图5b）。D-LNF（单药DBZ负载）作参考对照。固定浓度25 μg/mL下：ATRA细胞活力略低于DBZ；D-LNF未改善DBZ抗癌效果，疗效有限；RD-LNF显示显著更低细胞活力、更高抗癌效果，双药协同效应显现。RD-LNF抗癌效果显著优于所有其他处理组。推测DBZ缓慢持续释放与ATRA缓释共同贡献协同效应。本研究中DBZ为主化疗药，ATRA作为脂质纳米颗粒结构组分，故未单独设R-LNF组。已在癌细胞中考察裸ATRA、DBZ抗癌效果；众多文献证实ATRA抗癌作用，故作为结构组分协同增强包裹药物疗效。

克隆形成实验

评价黑色素瘤细胞成瘤潜能（图6）：游离DBZ、ATRA抑制克隆形成作用有限，D-LNF同样无效。DBZ+ATRA组合显著增强克隆形成抑制，优于单药或单药负载纳米颗粒。克隆形成实验再次确证RD-LNF优于游离药物的卓越抗癌功效。

体外凋亡实验与细胞周期分析

流式细胞术配合Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡（图7a）：ATRA、DBZ仅致10-12%凋亡，大部分细胞完整；D-LNF略增早期凋亡，提示载体效应；重要的是RD-LNF诱导显著更高比例凋亡，晚期凋亡21.5%、早期凋亡18.3%，存活细胞从95%降至52%，提示DBZ+ATRA组合促进癌细胞凋亡、抑制B16F10增殖。细胞周期分析佐证（图7b）：DBZ、ATRA略增sub-G0群体；D-LNF较单药sub-G0较高；RD-LNF处理组sub-G0显著升高，标志显著凋亡。已知DBZ上调p21、caspase-3、cleaved PARP、稳定p53促进凋亡[24,25]。p53诱导抑制细胞周期进程。DBZ+ATRA组合预期增强凋亡机制、阻滞细胞周期、发挥抗癌功效。

组合纳米颗粒对细胞迁移的影响

Transwell小室法配合结晶紫染色分析迁移（图8）：24 h后对照组近乎完全迁移；ATRA抑制迁移优于DBZ；D-LNF显著抑制迁移；最显著抑制见于RD-LNF处理组，迁移细胞数较对照组大幅减少。结果明确证明RD-LNF高效抑制恶性细胞异常增殖与迁移。

结论

本研究成功制备达卡巴嗪与全反式维甲酸共负载脂质纳米制剂。结果明确证实RD-LNF抑制黑色素瘤细胞增殖、诱导显著凋亡、抑制细胞周期进程与迁移。未来工作将聚焦临床相关动物模型抗癌疗效研究，开发针对黑色素瘤的靶向治疗。这是在黑色素瘤细胞中的初步研究，广泛临床相关动物模型研究是下一步工作重点。