使用脂质纳米制剂共同递送达卡巴嗪和全反式视黄酸 (ATRA) 对恶性黑色素瘤的协同抗肿瘤功效

摘要

恶性黑色素瘤是一种高度侵袭性的皮肤癌，占死亡率的 80%，转移性黑色素瘤患者的总体中位生存期仅为 6-9 个月。通过在单个纳米载体中同时给予双重药物的联合治疗已被证明在对抗癌症方面是优雅而有效的。在此，我们采用基于达卡巴嗪 (DBZ)、FDA 批准的黑色素瘤药物和全反式维甲酸 (ATRA) 的联合疗法，这是一种有希望的脂质纳米制剂 (RD-LNF) 抗癌剂，作为恶性黑色素瘤的新治疗策略。我们已经成功地将这两种药物封装在脂质纳米制剂中，并随着时间的推移显示出有效载荷的受控释放。我们证明同时递送 DBZ 和 ATRA 可以以浓度依赖的方式有效降低细胞增殖。组合纳米颗粒显着降低了 B16F10 黑色素瘤细胞的集落形成能力。流式细胞仪分析表明，RD-LNF 诱导更大比例的细胞凋亡，并显着抑制细胞周期进程和细胞迁移。这些结果表明RD-LNF在治疗恶性黑色素瘤方面具有良好的潜力。

介绍

恶性黑色素瘤是侵袭性恶性肿瘤之一，主要发生在人类皮肤中[1]。黑色素瘤占所有皮肤癌的 4%，但它导致 80% 的皮肤癌死亡率，并在不发达国家和发展中国家日益受到关注 [2, 3]。黑色素瘤很容易转移到身体的各个部位，包括大脑、心脏和肺，使其成为恶性肿瘤的一种侵袭性形式 [4]。如果在早期确诊，手术切除是潜在的治疗选择。然而，手术干预并不能保证黑色素瘤完全康复 [5]。此外，这种恶性肿瘤的放射状生长期对大多数其他治疗方案（包括化疗和放疗）产生耐药性 [6]。具体而言，肽受体在黑色素瘤癌症的表面过度表达，使其具有诱人的前景。亚型 2 生长抑素受体 (SSTR2) 已被证明在黑色素瘤细胞中高表达 [7]。

达卡巴嗪 (DBZ) 或二甲基-三氮杂-咪唑甲酰胺 (DTIC) 是一种 DNA 烷化剂，是美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的唯一一线化疗药物选择 [8]。 DBZ 是一种强烷化剂，通过将烷基添加到癌细胞的 DNA 或核材料中来杀死癌细胞 [9]。尽管 DBZ 具有强大的作用，但其水溶性较差，并且在血液循环中的半衰期较短（41 分钟），这削弱了其治疗黑色素瘤恶性肿瘤的疗效 [10]。此外，观察到的反应率在 10% 到 25% 之间令人失望，癌症完全康复率低于 5%，这表明单一药物治疗的局限性 [11, 12]。因此，迫切需要开发一种替代策略来提高DBZ的治疗效果。

与单个治疗剂相比，单次给药联合递送多种治疗剂被证明更有效 [13]。在单一载体系统中共同递送治疗剂将赋予协同活性、相似的药代动力学特性和更高的抗癌功效[14]。全反式视黄酸 (ATRA) 是一种很有前途的抗癌剂，可用于治疗多种癌症 [15]。 ATRA 通过与癌细胞核中的视黄酸受体结合从而抑制生长、增殖、分化和最终的细胞死亡来显示其治疗功效 [16]。与其他化疗药物不同，ATRA 不会导致任何不良反应，例如心脏毒性或骨髓发育不良。据报道，当 ATRA 与适当的化学治疗剂联合使用时，可增强抗癌功效。同样，亲脂性 ATRA 水溶性差且全身清除速度快，因此需要稳定的递送系统 [17]。

纳米颗粒递送系统已被证明可以通过将其释放到靶肿瘤组织中并通过使用增强的渗透和保留 (EPR) 效应避免体循环中的脱靶效应来提高封装疗法的治疗效果 [18, 19]。固体脂质纳米颗粒 (SLN) 被认为是许多现有载体的替代品，包括脂质体或胶束，因为它具有增强稳定性、控制药物释放、高负载效率和易于制备/放大等显着特点 [20] . SLN 作为药物递送载体的重要方面之一是具有 GRAS 状态、耐受性良好和生理脂质的脂质的安全性 [21]。药物在脂质核中的稳定掺入提高了水溶性，改善了药代动力学特征并延长了体循环中的生理稳定性[22]。

在这项研究中，我们提出了一种使用脂质纳米制剂联合递送 DBZ 和 ATRA 的有希望的策略，用于黑色素瘤恶性肿瘤的联合治疗。 DBZ 预计将加载到脂质核心中，而 ATRA 预计将成为纳米颗粒结构的一部分。我们研究了组合纳米颗粒的理化特性、细胞摄取和体外细胞毒性。此外，通过细胞凋亡分析、细胞周期分析、集落形成和细胞迁移分析进一步评估了抗癌作用。

结论

总之，我们已经成功地配制了达卡巴嗪和全反式视黄酸负载脂质纳米制剂。我们的结果清楚地表明，RD-LNF 抑制黑色素瘤细胞增殖，诱导显着的细胞凋亡，并抑制细胞周期进程和细胞迁移。未来的工作将侧重于研究临床相关动物模型中的抗癌功效，并开发针对黑色素瘤恶性肿瘤的靶向治疗。这是在黑色素瘤细胞中进行的初步研究，在不同临床相关动物模型中的广泛研究是我们研究工作的下一部分。

材料和方法

DBZ/ATRA-Loaded 脂质纳米制剂的制备

采用超声法制备载药脂质纳米粒。简而言之，将 10 mg DBZ 和 10 mg ATRA 溶解在 2 ml 氯仿溶液中，该溶液含有 50 mg Egg l-α-磷脂酰胆碱 (PC) 和 2 mg DSPE-甲基（聚乙二醇）-2000 (mPEG2000)。使用氩气暴露干燥有机溶剂20分钟。干燥的药物 + 脂质混合物加入 80 mg 三肉豆蔻苷 (Tm)，并在 65 °C 下孵育 1 小时。向该油混合物中加入 5 ml 4% 泊洛沙姆溶液，并立即在 80 W 下探头超声 6 分钟。所得乳液在冰下冷却30分钟。纳米颗粒在 12000×g 下经过 Amicon Ultra 0.5 离心过滤装置（3 kDa 截断值；默克，德国） 20 分钟。用HPLC法评价滤液中游离DBZ和ATRA的含量，计算加载效率和加载能力。 Waters HPLC 系统由 Waters 1525 二元泵、Waters 2487 UV 检测器、Waters 2475 荧光检测器、1500 柱加热器和 Symmetry C18 柱组成，用于药物分析。对于 ATRA，流动相由 90/10 v/v 比率的乙腈和三氟乙酸组成，流速为 1 ml/min，并在 348 nm 处检测。对于 DBZ，使用乙腈和 0.05 M 磷酸氢二钠，比例为 30/70 v/v，其中含有 0.5% 的 TEA。流动相的pH值保持在3.7，流速为1 ml/min。

粒度和形态分析

组合纳米颗粒的粒径分布由 Malvern Zetasizer Nano ZS90 用 He-Ne 激光器（633 nm）评估。所有样品都用蒸馏水稀释，实验在 24 °C 下进行，一式三份。通过透射电子显微镜（TEM；JEOL JEM200CX 在 120 kV）评估纳米颗粒的形态。稀释后的颗粒用2%磷钨酸染色，干燥，透射电镜观察。

载药纳米制剂的体外药物释放

通过透析法评价包封药物的释放。将含有相当于 1 mg ATRA 和 1 mg DBZ 的两毫升载药纳米颗粒密封在透析膜（Spectra/Por，MWCO 3.5 kDa）中。将透析管置于 25 ml 释放缓冲液中，并在 37 °C 下保持 100 rpm 的旋转。在预定的时间间隔直到 72 小时，取出 1 ml 样品并更换为等量的新鲜缓冲液。 DBZ和ATRA的量用上述HPLC法评价。

细胞培养和细胞摄取分析

鼠皮肤黑色素瘤细胞（B16F10）购自中国细胞系资源基础设施（中国北京）。细胞在补充有 10% FBS 和 1% 抗生素混合物的 RPMI-1640 培养基中培养。每 2 天定期更换培养基，并在 90% 汇合后培养。对于细胞摄取分析，将 B16F10 细胞接种在 6 孔板中培养 24 小时。纳米颗粒负载香豆素-6 作为荧光跟踪剂。去除旧培养基并更换为含有 Coumarin-6-lipid 纳米颗粒的新鲜培养基，并以相反的顺序孵育 1-3 小时。用细胞刮刀清洗和刮除细胞。将细胞以 1200 rpm 的速度离心 5 分钟，并将细胞沉淀重悬于 1 ml 冷 PBS 中。样品采用AccuriTM C6流式细胞仪（美国BD公司）进行评估。

体外细胞毒性试验

通过MTT测定评估游离ATRA、DBZ、D-LNF和RD-LNF对B16F10细胞的细胞毒作用。单元格 (1 × 10⁴ ) 接种在 96 孔板的每个孔中并孵育 24 h。这些细胞首先用不同浓度的游离 ATRA 和 DBZ 处理，并测试其对黑色素瘤细胞的抗癌作用。随后，细胞分别用固定浓度的游离 ATRA、DBZ、D-LNF 和 RD-LNF 处理，浓度分别为 25 μg/ml 和 50 μg/ml。将细胞孵育 24 小时，然后小心去除培养基并用 PBS 洗涤两次。最后，用 100 μl 5 mg/ml MTT 溶液处理细胞并孵育 4 小时。小心去除培养基并加入100 μl异丙醇并在振荡条件下温育15分钟。使用酶标仪在 570 nm 处研究溶解的甲臜晶体。未处理的细胞作为对照，根据对照的细胞活力进行计算。

细胞凋亡检测——流式细胞仪

用PE膜联蛋白V和基于7AAD的凋亡试剂盒染色后，评估游离ATRA、DBZ、D-LNF和RD-LNF在B16F10细胞中的凋亡作用。细胞接种于12孔板中，细胞密度为2×10⁵ 细胞/孔，孵育 24 小时。细胞用 25 μg/ml 当量的游离 ATRA、DBZ、D-LNF 和 RD-LNF 制剂处理，未处理的细胞被视为对照。处理暴露 24 小时后，按照制造商的方案对细胞进行染色。 AccuriTM C6 流式细胞仪用于 PE 和 7AAD 表达，在流式细胞仪中至少采集了 10,000 个事件。 PE阳性和7AAD阴性细胞早期凋亡； PE阳性和7AAD阳性细胞凋亡较晚。

细胞周期分析——流式细胞仪

细胞接种于12孔板中，细胞密度为2×10⁵ 细胞/孔，孵育 24 小时。细胞用 25 μg/ml 当量的游离 ATRA、DBZ、D-LNF 和 RD-LNF 制剂处理，未处理的细胞被视为对照。 24 小时后，洗涤并通过胰蛋白酶消化收集处理过的细胞，并在 4°C 下用 70% 乙醇固定 2 小时。然后用核糖核酸酶处理细胞以去除任何 RNA 污染。现在，将细胞在 37 °C 的培养箱中用碘化丙啶 (PI) 染色 30 分钟。 PI 染色细胞的荧光由 AccuriTM C6 流式细胞仪测定。细胞周期分为亚G1期、G1期、S期和G2/M期。

菌落形成分析

细胞接种于12孔板中，细胞密度为2×10⁵ 细胞/孔，孵育 24 小时。细胞用 25 μg/ml 当量的游离 ATRA、DBZ、D-LNF 和 RD-LNF 制剂处理。用细胞计数器对处理过的细胞进行胰蛋白酶消化、洗涤和计数。然后将细胞以 1500 个细胞/孔的密度接种在 6 孔板中。然后将细胞在 37°C 的环境条件下培养 12 天，直到菌落可见。细胞用 PBS 洗涤，并用甲醇与醋酸与水 (1:1:8) 固定 10 分钟，然后用 0.1% 结晶紫染色剂染色 45 分钟。然后在光学显微镜下观察染色的细胞。

细胞迁移分析

具有 8 μm 孔径的 12 孔 Transwell 室用于该测定。开始研究，5 × 10⁴ 细胞/孔接种在上室。上层培养基不含 FBS，而下层培养基由 10% FBS 组成。 24 h 后，将迁移到下膜表面的细胞量固定并用 0.5% 结晶紫染料染色。光镜下随机选取5个视野计数细胞数；记录并分析平均细胞数。

统计分析

除非另有说明，否则数据以平均值 ± SD 表示并一式三份进行。使用未配对的 t 比较两组测试，而使用单向方差分析和土耳其的多重比较测试对两个以上的组进行比较。使用GraphPad Prism软件进行统计，差异p <0.05 被认为是显着的。

结果与讨论

加载 DBZ/ATRA 的脂质纳米制剂的制备和表征

黑色素瘤的治疗仍然是一个重大挑战，标准治疗方案包括化疗或放疗或手术切除仅对预后不良的实体瘤有效。 FDA已经批准了紫杉醇或其组合等药物，但未能改善对患者生存和癌症治愈的整体影响。达卡巴嗪（DBZ）是FDA批准的一线化疗药物；然而，DBZ 的物理化学特性很差，导致响应率在 10% 到 25% 之间令人失望。为了应对这些挑战，我们开发了一种在脂质纳米制剂中结合 ATRA 和 DBZ 的新型治疗策略（图 1）。我们假设两种治疗成分的组合将增强黑色素瘤恶性肿瘤的抗肿瘤功效。值得注意的是，ATRA 虽然表现出抗癌特性，但并未对全身环境造成任何不利影响 [23]。由于 DBZ 本质上是疏水的，我们设计了脂质纳米制剂，可以将疏水药物稳定地掺入脂质核心，ATRA 将作为纳米颗粒的结构组分加载。携带治疗成分的脂质纳米颗粒将有助于输送到体内较深的肿瘤。 DBZ 和 ATRA 的加载效率分别为 91.2±1.25% 和 95.8±1.14%。 DBZ 和 ATRA 在 RD-LNF 中的负载能力分别为 7.07 ± 0.65% w/w 和 7.48 ± 1.05% w/w。观察到 D-LNF 的粒径为 121.5 ± 1.65 nm，多分散指数 (PDI) 为 0.134，zeta 电位为 -23.5 ± 0.85 mV。 RD-LNF 的粒径为 138.2 ± 1.28 nm，PDI 为 0.159，zeta 电位为 - 25.4 ± 0.58 mV。整体粒径的增加主要归因于 ATRA 的结构载荷；然而，由于 EPR 效应，RD-LNF 的最终大小小于 150 nm，允许优先积累恶性黑色素瘤肿瘤。此外，亲水性 PEG 的存在将防止颗粒聚集并减少其被网状内皮系统 (RES) 的吸收，从而提高其在体内的全身性能。 – 25 mV 左右的表面电荷将赋予出色的储存稳定性。通过透射电子显微镜 (TEM) 研究颗粒形态（图 2）。如图所示，D-LNF 和 RD-LNF 都是完美的球形，并且均匀分布在铜网格中。 D-LNF 和 RD-LNF 之间的大小差异与 DLS 观察一致。没有颗粒碎片、小颗粒和聚集，表明配方过程成功。