基于冻干单相溶液法优化甘草酸脂质体：处方前研究、设计与体外评价

摘要

本研究采用冻干单相溶液法成功制备甘草酸（GA）脂质体。处方前研究考察大豆磷脂酰胆碱（SPC）、胆固醇和GA在叔丁醇/水（TBA/水）共溶剂中溶解度。探讨TBA体积分数对升华速率影响，用DSC、XRD、FTIR表征冻干GA。XRD显示GA呈非晶态，FTIR确认无化学变化。溶解度测试显示GA水溶性显著增加。采用Box-Behnken设计和冻干保护剂筛选，确定最优处方——508 mg SPC、151 mg胆固醇、55% TBA、4:1海藻糖/SPC重量比。该条件下重溶脂质体包封率74.87%，平均粒径191 nm。体外释放显示两种介质中持续释放，细胞摄取实验证实Hep G2细胞时间依赖性摄取。

背景

甘草酸（GA）是从甘草根提取的三萜皂苷，具抗菌、抗病毒、抗癌活性，临床用于慢性肝炎和肝癌。按生物药剂分类系统，GA属II类药物；其低极性、高疏水性、差溶解度限制口服生物利用度，并可致剂量依赖性钠潴留钾丢失导致高血压。通过靶向制剂增强吸收维持治疗浓度至关重要。

脂质体以生物相容性、通过增强渗透滞留效应靶向淋巴结和肿瘤、载荷疏水和亲水药物通用性著称。但常规水性脂质体悬液不稳定，易泄漏、融合、磷脂水解，阻碍长期储存。前脂质体——干燥流体粉末，加水即重组为脂质体——提供解决方案。传统喷雾干燥或冻干制备前脂质体有缺陷：喷雾干燥可能损伤热敏性药物，冻干因长时间除水耗时昂贵。

近年创新的冻干单相溶法将脂质、药物、水溶性冻干保护剂溶于叔丁醇/水共溶剂，冻干产生干粉，加水自发形成脂质体。优势包括升华快、一步法适合大规模生产、残留溶剂风险低（TBA属3类）、无菌粉末输出、兼容难溶或不稳定药物。

尽管有这些优势，知识空白仍存：TBA/水浓度对升华速率影响、药物冻干后固态变化、粉末水化组装过程。本研究以GA为模型药物解决这些问题，通过Box-Behnken设计优化处方工艺变量，评估冻干保护剂效应，考察体外释放和细胞摄取。

方法/实验

材料

甘草酸（≥98%纯度）购自大连美仑生物技术有限公司。大豆磷脂酰胆碱（Lipoid S100）和胆固醇分别自Lipoid GmbH和J&K Scientific Ltd.。FITC-PEG-DSPE（MW 2000）购自上海 Ponsure Biotech。叔丁醇（≥98%）及其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。去离子水经Milli-Q系统制备。

溶解度研究

在25-45°C制备GA、SPC、胆固醇在TBA/水混合物中饱和溶液。GA溶解度用HPLC定量，C18柱（4.6×250 mm，5 μm），甲醇/水（90:10 v/v）流动相1.0 ml/min，250 nm检测。SPC和胆固醇溶解度用浊度法估算，监测655 nm吸光度。

冻干单相溶液制备

GA、SPC、胆固醇于45°C溶于TBA；选定冻干保护剂（甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖）于45°C溶于水。混合得各向同性单相溶液（60 ml）。0.22 μm过滤后，分装2.0 ml至10 ml冻干瓶，-40°C预冻12 h，-50°C冻干24 h（室压1-20 Pa）。

粒径与包封率

重溶脂质体：5 mg前脂质体粉末分散于5 ml纯水，涡旋1 min，15 min后重复。动态光散射（Nano ZS90，Malvern）测粒径。超滤离心法测包封率（EE）：1 ml分散液经50 kDa MWCO滤膜过滤，滤液HPLC定量，EE = (1 - W_free/W_total) × 100%。

升华速率与蒸汽压

不同TBA体积分数（10-90%）TBA/水混合物预冻冻干，记录完全升华时间计算速率（μl/min）。静态沸点仪和Antoine方程测蒸汽压。

理化表征

DSC（HSC-1，25-350°C，10°C/min，N₂气氛）评估热跃变。XRD（D8 Focus，Cu-Kα，5°-60°，5°/min）评价结晶度。FTIR（Nicolet 6700，4000-400 cm⁻¹，4 cm⁻¹分辨率）验证化学完整性。

稳定性

前脂质体粉末25°C、氮气、避光储存。6个月后重新评估重溶脂质体EE和粒径。

体外释放

透析法（MWCO 8000-14000 Da）在PBS（pH 7.4）或0.1% Tween 80生理盐水中37°C、300 rpm搅拌研究释放。取样至12 h，补充新鲜培养基，HPLC定量GA。

细胞摄取

FITC标记GA脂质体与HepG2细胞（1×10⁴ cells/mL）孵育0.5、1、2、4 h。洗涤、锌胺蓝猝灭后，Triton X-100裂解细胞。荧光（激发495 nm，发射520 nm）测定并按蛋白含量（BCA法）归一化。

结果与讨论

溶解度与升华

GA在TBA/水中溶解度随TBA体积分数和温度逐步升高；TBA>40%时溶解度超0.5 mg/mL。SPC和胆固醇在35°C以上需减少TBA体积，确认TBA有利溶解效应。

升华速率从10% TBA时4 μl/min增至60% TBA以上10 μl/min以上，归因于更高饱和蒸汽压和光学显微镜观察到的更细针状冰晶。

冻干后理化变化

DSC显示GA熔融峰随TBA含量减少向低温偏移，XRD确认结晶峰完全消失，呈非晶态。FTIR光谱不变，证实化学稳定性。非晶化使水溶性从原始6.36 μg/mL增至19-64 μg/mL（视TBA比例）。

单因素筛选

基于EE和平均粒径综合评分最高，确定最优SPC（480 mg）、胆固醇（120 mg）、TBA（50%）。

Box-Behnken优化

以SPC、胆固醇、TBA为自变量，模型预测最优条件：508 mg SPC、151 mg胆固醇、55% TBA，得EE=68.55%、平均粒径=220 nm。交互作用图确认协同效应。

冻干保护剂筛选

海藻糖优于乳糖、蔗糖、甘露醇。海藻糖/SPC比例4:1最大化EE（74.87%）并最小化粒径（191 nm），冻融循环中保护最优。

透射电镜

图像显示初始水化GA和脂质碎片分散，演变为均匀~200 nm球形脂质体，具双分子层包裹药物。

稳定性

25°C贮存6个月，EE维持72.82%，粒径198 nm，显示良好物理稳定性。

体外释放

PBS和生理盐水均呈持续释放：12 h分别释放65.25%和69.46% GA，快速初期释放后达平台期，确证持释行为。

细胞摄取

HepG2摄取从30 min 1480 ng/mL蛋白增至240 min 2030 ng/mL，荧光显微镜佐证时间依赖性内化。

结论

本工作证明冻干单相溶液法结合Box-Behnken设计和海藻糖冻干保护剂，制得GA负载脂质体包封率74.87%、粒径191 nm、12 h持续释放。该法得稳定干粉适合大规模生产，为疏水性药物递送提供有前景平台。