自噬抑制剂 (LY294002) 和 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 基于组合的纳米脂质体，可增强对食管鳞状细胞癌的疗效

背景

食管鳞状细胞癌 (ESCC) 是一种常见的食管癌类型，在中国等东亚地区更为普遍 [1, 2]。 ESCC 的 5 年生存率约为 25%。手术是 ESCC 治疗的主要治疗选择；但相信辅助化疗会对ESCC的治疗产生很大的影响[3​​, 4]。据报道，由于癌细胞的异质性，基于单一药物方案的化学治疗导致治疗效果不佳[5]。癌细胞通常对单一抗癌药物有抗药性，在自然界中不会有效。在这方面，两种或多种药物的组合将通过靶向不同的细胞靶标以协同方式发挥作用 [6, 7]。据报道，自噬抑制剂可以克服癌细胞的多药耐药性（MDR）。当细胞的营养和生长因子有限时，自噬为癌症环境提供急需的稳态并有助于其存活 [8]。自噬还可以保护癌细胞免受化疗药物的侵害。本研究选用LY294002（LY）作为自噬抑制剂[9]。

多项研究报告称，自噬抑制剂与抗癌药物联合使用时效果最佳。在本研究中，我们选择了 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 作为化疗药物。 5-FU 主要用于治疗鳞状细胞癌，并用于乳腺癌和其他癌症患者 [10]。 5-FU在尿嘧啶的C-5位上有一个氟原子代替氢。 5-FU 的抗癌作用源于对 Bax 和 Bcl-2 等各种分子的调节，并诱导癌细胞凋亡 [11, 12]。尽管 5-FU 和 LY 具有潜在的细胞毒性作用，但这两种药物都存在水溶性差和稳定性问题，导致血浆半衰期短和对正常细胞产生不良毒性作用 [6]。此外，由于药物的随机释放和药物在各种组织中的不受控制的分布，两种抗癌药物的简单鸡尾酒混合物不会产生协同作用 [7]。因此，以程序化和多控制的方式递送两种抗癌药物以提高其治疗效果至关重要。

纳米颗粒已被广泛研究作为用于癌症靶向应用的药物递送载体 [13]。难溶性药物可以稳定地掺入纳米颗粒中，从而提高其溶解性和生物利用度。在所有载体中，脂质体因其适用于全身应用而被广泛研究 [14, 15]。先前的研究表明，有许多商业脂质体制剂可用，包括 Doxil、Myocet、LipoPlatin 等。脂质体的体循环可以通过聚乙二醇（PEG）作为亲水壳的表面结合来改善 [16]。 PEG 的纳米尺寸和亲水层将延长血液循环并减少网状内皮 (RES) 介导的血浆清除率。此外，NP 可以通过增强渗透和保留 (EPR) 效应在肿瘤组织中被动积累 [17, 18]。因此，可以预期，如果将化疗药物和自噬抑制剂整合到单一载体中，将在ESCC中具有协同抗癌作用。

到目前为止，本研究的主要目的是联合 5-FU 和 LY 来治疗 ESCC。为此，将 5-FU 和 LY 稳定地掺入聚乙二醇化纳米脂质体中。预计自噬抑制剂（LY）的早期释放会破坏癌细胞的保护机制，此后5-FU将以更强的方式在癌细胞中发挥作用。载药脂质体的特征在于粒度、形状和释放模式。已经在 ESCC 癌细胞中进行了细胞摄取和细胞活力测定。此外，通过膜联蛋白 V/PI 染色和 Hoechst 33382 染色进行细胞凋亡测定。最后，在携带ESCC细胞的异种移植动物模型中进行了抗肿瘤疗效研究。

方法

材料

5-氟尿嘧啶购自Sigma-Aldrich, China。 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002, LY) 购自北京华丰联合科技有限公司。 L-α-磷脂酰胆碱（蛋/鸡）(EPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 (2000) (DSPE-PEG) 和胆固醇购自中国 Avanti Polar Lipids。所有其他化学品均为试剂级，用于进一步纯化。

双载药纳米脂质体的制备

EPC、DSPE-PEG 和胆固醇在甲醇-氯仿混合物中混合（10:4:1 M 比​​例（总共 10 毫克）），并且在该有机混合物中加入 5-FU（1.5 毫克）和 LY（1.5 毫克）添加。使用旋转蒸发器（Buchi，美国）在 60°C 下蒸发有机溶剂 1 小时。脂质薄膜用 PBS 缓冲液水合 1 小时，然后通过聚碳酸酯膜（200 nm）通过微型挤出机挤出。载药纳米脂质体通过Millipore管过滤，分子量为3500。载药脂质体从上室收集，未包埋的药物通过HPLC法测定。载药量和包封率的计算公式如下：

粒度分析

使用 Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments, UK) 通过动态光散射 (DLS) 技术测定纳米颗粒的粒径和粒径分布。在用蒸馏水适当稀释后，在 25°C 下测量粒度。所有测量一式三份进行。

形态分析

首先通过透射电子显微镜（TEM；H-7600，Hitachi，Tokyo，Japan）在 100 kV 的加速电压下研究 NP 的形态。将样品装入涂有碳的铜网格中并干燥。在原子力显微镜 (AFM) 中进一步观察了 NP 形态。将样品置于云母面上。

体外释放研究

在 37°C 的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中研究了 5-FU 和 LY 从 5-FU 和负载 LY 的聚乙二醇化纳米脂质体（FLNP）的体外释放。将 NP 分散体（在载体中含有 1 毫克每种药物的 1 毫升）置于透析膜（MW ~ 3500）中，并将两端密封。将透析膜置于装有 30ml 释放介质的管中。将含有透析膜的管置于摇床浴中并使其温育至必要的时间点。在特定时间点，取出 100 μl 样品并替换为等量的新鲜缓冲液。通过HPLC方法研究在缓冲液中释放的药物量。使用由 L-2200 自动进样器和 L-2420 紫外-可见检测器组成的高效液相色谱 (HPLC) 系统 (Hitachi, Tokyo, Japan)。 Inertsil C18 色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm 粒径；Cosmosil，Nacalai Tesque Inc.，美国）在流动相等度洗脱下使用，流速为 1.0 mL/min，柱温为 25° C。两种药物均在 0.025 和 2 μg/ml 之间观察到良好的线性，相关系数 (r ² ) 大约 0.9995。 5-FU 和 LY 的 LOD (μg/ml) 分别为 0.020 和 0.050。 5-FU 和 LY 的 LOQ (μg/ml) 分别为 0.070 和 0.150。

细胞培养

食管癌细胞系 EC 9706 在含有 10% FBS 和 100 单位/毫升青霉素、100 毫克/毫升链霉素、5% CO2 和 95% 湿度环境的正常 RPMI 培养基中培养。

细胞摄取分析

通过共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 观察 NP 的细胞摄取。为此，使用带有 HEPES 缓冲液的 Sephadex G-50 柱通过凝胶过滤制备和纯化负载罗丹明 B 的 NP。将细胞接种在 12 孔板中并孵育过夜。然后将细胞暴露于加载罗丹明 B 的 NP (10 μg/ml) 并孵育 2 小时。细胞用PBS洗涤3次，用2%多聚甲醛(PFA)固定，再用PBS洗涤。然后用作为核染色剂的 DAPI 染色细胞。洗涤细胞，在荧光显微镜（Nikon TE2000-E显微镜）下观察。

使用流式细胞仪进一步观察细胞摄取。将细胞接种在 12 孔板中并孵育过夜。然后将细胞暴露于负载罗丹明 B 的 NP 并分别孵育 1 小时和 2 小时。然后提取细胞并用PBS洗涤两次。将细胞重悬于 PBS 缓冲液中，并使用配备 CELLQuest 软件（Becton Dickinson Biosciences，San Jose，CA，USA）的 Calibur 荧光激活细胞分选仪进行分析。

细胞毒性分析

通过 3-(4,5-二甲基-2-噻唑酰基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 测定评估单个制剂的细胞毒性潜力。简而言之，1 × 10 ⁴ 将细胞接种在 96 孔板中并孵育 24 小时。然后将细胞分别暴露于不同浓度的游离 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP，并进一步孵育 24 小时。制备 MTT 溶液 (5 mg/ml)，将 10 μl MTT 溶液加入每个孔中并孵育 4 小时。通过加入DMSO提取甲臜晶体，并使用酶标仪（Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader）（570 nm处）研究吸光度。

细胞凋亡检测

通过膜联蛋白-V/PI 染色方案（BD Biosciences，USA）确定癌细胞的凋亡。简而言之，将 EC 9706 接种在 12 孔板中并孵育 24 小时。将细胞分别与游离 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP 一起温育，并进一步温育 24 小时（1 μg 等效药物浓度）。提取细胞并在室温下用膜联蛋白 V-FITC 和 PI 染色 15 分钟，然后使用 FACS CELLQuest 软件（Becton Dickinson Biosciences，San Jose，CA，USA）通过流式细胞术分析计数。

Hoechst 33342 检测

通过Hoechst 33342染色方案进一步确定癌细胞的凋亡。简而言之，将 EC 9706 接种在 12 孔板中并孵育 24 小时。将细胞分别与游离 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP 一起温育，并进一步温育 24 小时（1 μg 等效药物浓度）。细胞用 2% PFA 固定并与 Hoechst 33342 (1 μg/ml) 孵育 15 分钟。荧光显微镜下观察细胞凋亡。

蛋白质印迹

EC 9706 细胞分别接种并用游离 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP 处理，并进一步孵育 24 小时。然后裂解细胞，上清液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）并印迹到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上。膜用 5% 脱脂牛奶封闭，随后与特定的一抗在 4°C 下孵育过夜。与二抗偶联辣根过氧化物酶孵育后，使用 ECL 系统 (AbClon) 显示印迹以进行信号检测。胶片使用柯达M35-A X-OMAT处理器显影。

体内肿瘤生长抑制

动物研究是按照中国江苏省苏北人民医院动物护理和使用机构委员会著名的指导方针进行的。 6周龄雌性裸鼠接种1 × 10 ⁶ 100 μl 培养基中小鼠右侧的 OE-19 细胞。允许肿瘤生长至 80 mm ³ （第 10 天）。将动物分成五组，每组六只小鼠。在实验的前 10 天，以 5mg/kg 的固定剂量向小鼠注射各自的制剂并给药 3 次。使用游标卡尺根据肿瘤体积测量肿瘤大小，并使用公式估计大小；体积 =(宽度 ² × 长度)/2.

统计分析

数据表示为平均值 ± 标准偏差。使用 t 确定统计显着性 方差检验和分析 (ANOVA)。 P <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

癌细胞通常对单一抗癌药物有抗药性，在自然界中不会有效。在这方面，两种或多种药物的组合将通过靶向不同的细胞靶标以协同方式起作用。据报道，自噬抑制剂可以克服癌细胞的多药耐药性（MDR）。多项研究报告称，自噬抑制剂与抗癌药物联合使用时效果最佳。在这项研究中，我们选择了 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 作为化疗药物，LY294002 (LY) 作为自噬抑制剂。为了解决游离药物的溶解性和稳定性问题，这反过来又会导致血浆半衰期短和不良的毒性作用，我们在聚乙二醇化纳米脂质体中稳定地掺入了 5-FU 和 LY（图 1）。

5-氟尿嘧啶和LY负载聚乙二醇化纳米脂质体的制备示意图

5-FU 和负载 LY 的纳米脂质体的制备和表征

采用薄膜水合法制备双载药脂质体。发现空白脂质体的平均粒径为~ 110 nm，具有优异的分散指数。双载药脂质体（FLNP）的粒径增加到~ 150 nm，具有良好的多分散指数（PDI~ 150）（图2a）。粒径的增加主要是由于脂质体中掺入了疏水性药物。据报道，200 nm 左右的粒径将通过增强的渗透和保留效应 (EPR) 增强药物在肿瘤组织中的积累。载药脂质体表现出长期储存能力，这归因于其表面存在有助于防污效果的 PEG。此外，FLNP 表现出~ 25 mV 的平均表面电荷，表明其胶体稳定性。负表面电荷将避免体循环中的任何相互作用。

FLNP 的物理化学特征。 一 通过 DLS 方法获得的 FLNP 的粒度分布。 b FLNP 的 TEM 图像。 c FLNP的原子力显微镜图像

首先使用 TEM 观察 FLNP 的形态（图 2b）。如图所示，颗粒呈典型的球形并均匀分散在铜网格中。圆周上略带灰色的外壳是由于其表面存在 PEG。与 DLS 相比，从 TEM 观察到的粒径略小。与来自 DLS 的~ 150 nm 相比，来自 TEM 的粒径为~ 130 nm。两种技术的颗粒大小差异可能归因于测量状态。 TEM 测量干燥条件下的颗粒，而 DLS 测量水合条件下的颗粒和 PEG 链伸长率。 AFM 进一步证实了颗粒形态（图 2c）。颗粒呈圆形，在云母表面呈扁平状。

药物加载和体外药物释放

FLNP 对两种药物均显示出高包封率（5-FU 为 92.5%，LY 为 86%），活性载药量约为 ~ 16% w /w .在磷酸盐缓冲盐水 (pH 7.4) 中观察到 5-FU 和 LY 从 FLNP 的体外释放行为。 FLNP 的两种成分在 pH 7.4 条件下以受控方式释放。例如，到 24 小时结束时，~ 30% 的 5-FU 和~ 40% 的 LY 从脂质体中释放出来。药物的释放持续到 90 小时，释放了 ~ 60% 的 5-FU 和 ~ 75% 的 LV（图 3）。应该指出的是，释放速率在 24 小时后显着降低，直到 90 小时，表明药物从 NP 系统缓慢扩散。这种药物的受控释放将有利于癌症靶向应用。此外，在中性条件下药物的缓慢释放表明对正常组织的副作用较小。值得注意的是，与 5-FU 相比，LY 的释放速度相对较快。这将是一个有利的局面，因为LY会使癌细胞对5-FU更敏感，从而增强肿瘤组织中的细胞毒作用。

5-FU 和 LY 从 FLNP 在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中的释放曲线。通过HPLC分析定量药物释放量

细胞内化研究

进行共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 以确定 FLNP 的亚细胞模式。罗丹明 B 用作荧光探针来跟踪 ESCC 中纳米颗粒的细胞内摄取。如所见（图 4），在细胞核周围的细胞质中观察到强烈的红色荧光信号，表明典型的内吞作用介导的细胞摄取。受体介导的细胞摄取将允许药物在酸性环境中逐渐释放。颗粒的纳米尺寸允许 NP 系统容易内化。结果清楚地表明，药物通过特定途径而不是简单的扩散进入癌细胞。通过 FACS 进一步监测细胞摄取。如所见，在孵育 1 小时后观察到 NP 的显着吸收，并且细胞吸收随着孵育时间（2 小时）的增加而增加。 NP的细胞摄取越多，细胞内包封抗癌药物的浓度就会增加，从而进一步提高ESCC的治疗效果。

一 HT-29 癌细胞与 FLNP 孵育 2 小时后的共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 图像。细胞核用 DAPI 染色，罗丹明 B 用作荧光探针。 b 不同时间点培养后FLNP的流式细胞仪分析

体外抗癌作用

通过 MTT 测定研究单个制剂的细胞毒作用（图 5）。如图所示，游离药物以及组合 NP 在 ESCC 中表现出典型的浓度依赖性细胞毒作用。与 LY 相比，5-FU 在癌细胞中表现出相对较高的抗癌作用。与单个药物相比，5-FU 和 LY 的组合导致更高的细胞毒性作用。最重要的是，与游离鸡尾酒组合相比，FLNP 在癌细胞中表现出显着更高的抗癌作用。 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP 的 IC50 值分别为 2.68 μg/ml、5.98 μg/ml、1.54 μg/ml 和 0.58 μg/ml。这可能是因为 LY 可以抑制癌细胞中的自噬并使其对 5-FU 更敏感。应该指出的是，FLNP 比游离鸡尾酒组合更有效，因为药物以受控方式更程序化释放。从 FLNP 更快释放 LY 会导致自噬抑制，从而提高癌细胞对 5-FU 的敏感性，导致更多的细胞死亡 [19]。据报道，5-FU进入癌细胞后，通过一磷酸氟尿苷（FUMP）转化为三磷酸氟尿苷（FUTP）或通过两种不同途径代谢为三磷酸氟尿苷（FdUTP）。 FdUTP 作为胸苷酸合酶 (TS) 的底物并阻断核苷酸合成。 5-FU 代谢物与 TS 的核苷酸结合位点结合并抑制核苷酸合成。该循环导致脱氧胸苷三磷酸 (dTTP) 的消耗，从而阻止 DNA 合成并导致癌细胞死亡增加 [20, 21]。

HT-29 癌细胞在分别与游离 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP 孵育后的细胞活力。 MTT法测定细胞活力

细胞凋亡论文

通过膜联蛋白-V/PI 染色方法评估制剂的细胞凋亡作用（图 6a、b）。这将能够确定个体以及组合药物系统的细胞凋亡效应。与 MTT 分析一​​致，与 LY (~ 12%) 相比，5-FU (~ 20%) 导致癌细胞凋亡更多，而 5-FU + LY 组合诱导更大的凋亡细胞死亡 (~ 30%)。与任何其他组相比，FLNP 诱导了更大的癌细胞凋亡（~ 48%），这表明受体介导的细胞摄取大大增加了抗癌药物的细胞内浓度，从而产生了更高的治疗效果。 FLNP 具有较高抗癌作用的一个重要原因主要归因于包封药物的连续释放，其中 LY 将致敏肿瘤细胞，而 5-FU 将诱导其有效的细胞毒性作用。抗癌疗法通过在不损害周围正常细胞的情况下诱导癌细胞凋亡来发挥作用。 FLNP 显着的凋亡活性主要归因于纳米颗粒通过胞吞作用在细胞中的更高积累和药物在细胞内环境中的顺序释放，从而产生协同治疗效果。预计自噬抑制剂（LY）的早期释放会破坏癌细胞的保护机制，此后5-FU将在癌细胞中发挥更强的作用。

HT-29 癌细胞分别与游离 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP 孵育后细胞凋亡的代表性流式细胞分析结果。左下角，活细胞；右下角，早期凋亡细胞；右上，晚期凋亡细胞；和左上角，坏死细胞

Western Blot 分析

制剂的作用机制由蛋白质印迹分析确定（图 7）。暴露于相应制剂后促凋亡和抗凋亡蛋白水平的表达如图 8 所示。p53 是重要的细胞周期调节剂之一，其下调与癌细胞存活率的增加有关。可以看出，制剂显着下调 p53 的表达水平，表明对 ESCC 细胞的显着影响。据报道，DNA 损伤会导致半胱天冬酶级联反应的激活，从而导致 PARP-1 的裂解，这被认为是细胞凋亡的标志 [22, 23]。我们的结果清楚地表明，5-FU 和 LY 分别增加了 caspase-3 和 PARP 的表达，而正如预期的那样，FLNP 诱导了这些蛋白质标志物的显着表达，表明其具有优越的抗癌效果。一致地，FLNP显着下调抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达，表明其有效提高ESCC的治疗效果。

HT-29 癌细胞分别与游离 5-FU、LY、5-FU + LY 和 FLNP 孵育后的蛋白质印迹分析。测定裂解的 caspase-3、PARP、Bcl-2 和 p53 的蛋白质印迹分析

动物模型体内抗肿瘤药效研究。将不含5-FU、LY、5-FU + LY和FLNP的制剂分别施用于肿瘤小鼠，研究疗效20天

体内肿瘤生长抑制分析

给小鼠注射各自的小鼠制剂，直到第 20 天记录肿瘤体积。如所见（图 8），对照组在每个时间点都显示肿瘤体积稳定增加，直到第 18 天。与对照组相比，游离药物确实控制了肿瘤的生长；然而，情况并不令人满意。两种药物的混合物在控制肿瘤体积方面比单个药物更有效。重要的是，FLNP 显示出显着 (p <0.05； p <0.0001) 与任何其他组相比具有更高的抗肿瘤功效。最终肿瘤体积为~ 500 mm ³ 与 ~ 1400 毫米 ³ 相比 对于未经处理的小鼠。在肿瘤模型中显着更高的抗肿瘤作用归因于纳米尺寸的颗粒，由于增强的渗透和保留作用可能会在肿瘤组织中积累。药物在肿瘤组织中的控释也有助于其更高的疗效[24]。

结论

总之，5-氟尿嘧啶 (5-FU) 和 LY294002 (LY) 负载的聚乙二醇化纳米脂质体已成功制备以靶向食管鳞状细胞癌 (ESCC)。 FLNP 显示出受体介导的细胞摄取，这将允许药物在酸性环境中逐渐释放。与单个药物相比，5-FU 和 LY 的组合导致更高的细胞毒性作用。最重要的是，与游离鸡尾酒组合相比，FLNP 在癌细胞中表现出显着更高的抗癌作用。从 FLNP 更快释放 LY 会导致自噬抑制，从而提高癌细胞对 5-FU 的敏感性，导致更多的细胞死亡。始终如一地，与任何其他组相比，FLNP 诱导了更大的癌细胞凋亡（~ 48%）。蛋白质印迹分析清楚地表明，5-FU 和 LY 分别增加了 caspase-3 和 PARP 的表达，而正如预期的那样，FLNP 诱导了这些蛋白质标记物的显着表达，表明其具有优越的抗癌效果。我们相信自噬抑制剂和化疗药物从单个纳米载体的程序化释放将增加 E​​SCC 抗癌治疗的前景。 A broader study on different squamous cell carcinoma and development of the orthotropic model and patient-derived xenograft (PDX) model will be the subject of future investigation.

缩写

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

FLNP:

5-FU and LY-loaded lipid nanoparticles