Cu:Ag 双金属纳米颗粒：对耐药菌株的增强抗菌疗效——分子对接研究

摘要

本研究旨在评估不同浓度的银（Ag）掺杂在 Cu:Ag 双金属纳米颗粒中的影响，探讨其作为针对耐药细菌的潜在抗菌剂的前景。采用共沉淀法，以氢氧化铵和去离子水为溶剂，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为封端剂，硼氢化钠和抗坏血酸为还原剂，合成了四种不同 Ag 浓度比例（2.5、5.0、7.5 和 10 wt%，标记为 1:0.025、1:0.050、1:0.075 和 1:0.1）的 Cu:Ag 双金属纳米颗粒。通过多种表征技术对合成产物进行了分析：XRD 确认了相纯度，检测到属于 Cu 和 Ag 相的面心立方（fcc）结构；FTIR 光谱确认了各官能团的振动模式及双金属特征峰；UV-Vis 光谱显示随着 Ag 含量增加，带隙减小；SEM 和 HR-TEM 显示 Ag 掺杂 Cu 双金属呈球形形态，存在大小团聚，尺寸和层间距各异。抗菌实验表明，不同浓度 Ag 掺杂剂对 Staphylococcus aureus、Escherichia coli 和 Acinetobacter baumannii 的抑菌圈（0.85–2.8 mm、0.55–1.95 mm、0.65–1.85 mm）具有统计学显著性（P < 0.05）。总体而言，Cu:Ag 双金属纳米颗粒对革兰氏阳性菌（S. aureus）的杀菌效果优于革兰氏阴性菌。分子对接研究显示，Ag–Cu 双金属纳米颗粒可与 S. aureus（结合得分：−4.981 kcal/mol）和 A. baumannii（−4.013 kcal/mol）的 β-内酰胺酶、A. baumannii（−3.385 kcal/mol）和 S. aureus（−3.012 kcal/mol）的 FabI、以及 E. coli（−4.372 kcal/mol）的 FabH 发生结合相互作用，提示其为这些关键酶的潜在抑制剂。建议进一步开展体外酶抑制实验，为新型抗生素发现开辟新途径。

引言

细菌、真菌、病毒和寄生虫等微生物广泛存在于自然环境中，给医疗器械生产、医疗用品、食品加工、水净化系统及家用卫生用品带来污染风险。抗生素虽常用于治疗细菌感染，但长期滥用导致细菌耐药性增加，同时破坏人体有益菌群。耐药菌感染已成为现代医学面临的重大挑战。纳米技术为开发新型抗菌材料提供了契机，其中铜（Cu）和银（Ag）纳米颗粒展现出良好的抗菌性能。双金属纳米颗粒因具有高比表面积和丰富的表面原子，在化学、材料学、生物技术和环保等领域应用广泛。Cu:Ag 双金属纳米颗粒结合了两种金属的优势，可调控结构形貌（如核壳、哑铃、双界面、随机混合、花状等），从而调节抗菌活性。本研究采用共沉淀法合成 Cu:Ag 双金属纳米颗粒，并通过分子对接预测其对细胞壁合成途径（β-内酰胺酶）及脂肪酸合成途径（FabI、FabH）关键酶的结合模式，探讨抗菌机制。

材料与方法

材料

前驱体：氯化铜（CuCl₂·0.2H₂O，98.9%）、硝酸银（AgNO₃）；封端剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP，平均分子量 40,000）；还原剂：硼氢化钠（NaBH₄，99.9%）、L-抗坏血酸（C₆H₈O₆，99.0%）；溶剂：氢氧化铵（NH₄OH）。均购自美国 Sigma-Aldrich 公司。

Cu:Ag 双金属纳米颗粒合成

按图 1 流程进行共沉淀合成：去离子水中加入 1.25 g PVP 和 0.5 g 抗坏血酸，100 ℃剧烈搅拌。分别配制两份 40 mL 氢氧化铵溶液，一份加入 1.7 g 氯化铜，另一份加入 1.7 g 硝酸银。依次将两溶液倒入初始溶液中，同时加入 0.5 g NaBH₄。最终溶液于 100 ℃搅拌 4 h 均匀化，6000 rpm 离心分离纳米颗粒，100 ℃干燥除去水分杂质。同法制备四组不同 Ag 浓度（摩尔比 2.5%、5%、7.5%、10%）样品，Cu 比例固定。

抗菌活性测定

采用牛乳腺炎奶分离的 S. aureus、E. coli、A. baumannii，以奥氏琼脂孔扩散法评价体外杀菌效力。细菌浓度调整至 1.5 × 10⁸ CFU/mL 涂布于甘露盐琼脂、麦康凯琼脂和 LB 琼脂。制孔直径 15 mm，加入 10 μL（5 µg/mL）纳米颗粒悬液，阿莫西林（5 µg/mL，10 μL）作阳性对照，去离子水（50 μL）作阴性对照。37 ℃培养 15 h 后测量抑菌圈直径（mm）。

统计分析

抑菌圈数据经 SPSS 20.0 单因素方差分析（ANOVA），P < 0.05 为显著差异。

分子对接研究

抗生素通过破坏细胞壁、干扰生化代谢、损伤细胞膜、穿透生物膜等杀菌。纳米颗粒杀菌机制与之类似，故选取细胞壁合成关键酶 β-内酰胺酶、脂肪酸合成关键酶 FabI 和 FabH 为靶点。从蛋白质数据库获取 3D 结构：A. baumannii β-内酰胺酶（PDB: 4U0X，2.03 Å）、A. baumannii FabI（PDB: 6AH9，1.74 Å）、S. aureus β-内酰胺酶（PDB: 1MWU，2.6 Å）、S. aureus FabI（PDB: 4CV1，1.95 Å）、E. coli FabH（PDB: 4Z8D，2.0 Å）。使用 ICM Molsoft v3.8–4a 软件对接，蛋白预处理包括添加极性氢、去除水分子、能量最小化。定义结合口袋，取结合能最低的前 10 个构象分析相互作用模式。PyMOL 和 Discovery Studio 可视化结合模式。Cu:Ag 双金属纳米颗粒结构从 PubChem 获取（.sdf 格式）。

表征方法

XRD（PANalytical X'pert Pro，Cu-Kα，λ=0.154 nm，20°–80°）分析相纯度与晶体结构；FTIR（Perkin Elmer）检测官能团振动模式；UV-Vis（Genesys 10S）获取吸收光谱；FESEM-EDS（JSM-6610LV）和 HR-TEM（JEOL JEM 2100F）观察表面形貌；分子对接用 ICM v3.8-4a。

结果与讨论

结构表征

XRD 图谱（20°–80°）显示：~38.2°、46°、64.4°、77.1° 对应 Ag fcc 相（111）、（200）、（220）、（311）晶面（JCPDS 04-0783）；Cu 峰位于 32.6°、44.2°、51°，对应（110）、（111）、（200）晶面，确认 fcc 结构 CuO 和金属 Cu（JCPDS 04-0836）。两相峰共存证实双金属相形成。低 Ag 含量样品（1:0.025、1:0.050、1:0.075）存在 CuO 峰，表明 Cu 纳米颗粒在高温下氧化；高 Ag 含量（1:0.1）CuO 峰强度降低，提示 Ag 改善了抗氧化性。无杂质峰。Bragg 方程计算 Ag 和 Cu 的 d-spacing 分别为 0.24 nm 和 0.21 nm，对应（111）晶面，与 HR-TEM 一致。SAED 环形图案显示产物结晶良好。

FTIR 分析

500–4000 cm⁻¹ 范围内：600–900 cm⁻¹ 透射带归因于 Cu–Ag 键形成；~1200 cm⁻¹（C–O）、~1400 cm⁻¹（C–H）；~1800 cm⁻¹（C=O）、~2100 cm⁻¹（N–H）源于 PVP 和 NH₄OH；~2800 cm⁻¹（C≡N）、~3400 cm⁻¹（O–H）。

UV-Vis 光谱与带隙

吸收峰位于 340、410、500 nm，分别对应 Ag 和 Cu 的表面等离子体共振吸收。410 nm 峰属 Ag，510 nm 峰属 Cu，表明形成了具有独立 Ag 和 Cu 相的双金属纳米颗粒，而非合金化，与 XRD 结果吻合。随 Ag 含量增加，410 nm 峰轻微红移且最大吸收增强。Tauc 方程计算带隙依次为 3.2、2.9、2.7、2.6 eV。

形貌分析

SEM 显示小颗粒沉积在大颗粒表面，Ag 含量从 2.5% 增至 7.5% 导致形貌多变，最终形成块状 Cu:Ag 颗粒；Ag 掺杂显著影响形貌。HR-TEM 进一步确认：核壳结构明显，单颗粒内同时观测到 Cu 和 Ag 晶格条纹，d-spacing 测量值与 XRD 一致（Cu 0.21 nm 对应（111），Ag 0.24 nm 对应（111））。颗粒呈不规则准球形，明暗对比区域提示两种组分共存。

EDS 成分分析

EDS 谱图显示 Cu 和 Ag 特征峰，证实双金属形成。C、O 峰源于碳载网背景信号。

抗菌效力评价

琼脂孔扩散法结果（表 1）：抑菌圈随 Ag 掺杂浓度增加而增大，呈正相关。四个浓度梯度对三菌株的抑菌圈范围及抑制率（相对阿莫西林 4 mm）如前所述。Cu:Ag 双金属纳米颗粒对 S. aureus（革兰氏阳性）效力最强。机制上，纳米尺寸效应促进活性氧（ROS）产生，破坏细菌细胞膜；Ag⁺ 和 Cu²⁺ 静电吸附细菌膜负电荷基团，导致细胞裂解；阳离子浓度随掺杂量增加而升高，增强杀菌力。

分子对接结果

对接揭示结合模式：

• A. baumannii β-内酰胺酶：与 Glu272（2.8 Å）、Ser286（3.2 Å）形成氢键，与 Val292 金属接触，得分 −4.013 kcal/mol。
• S. aureus β-内酰胺酶：与 Ser403（3.2 Å）、Tyr519（3.6 Å）、Gln521（3.0 Å）、Asn464（3.1 Å）氢键，得分 −4.981 kcal/mol。
• A. baumannii FabI：与 Ser201（2.7 Å）、Ala199（3.5 Å）、Leu198（3.3 Å）氢键，得分 −3.385 kcal/mol。
• S. aureus FabI：与 Gly202（2.5 Å）、Gln155（2.5 Å）氢键，得分 −3.012 kcal/mol。
• E. coli FabH：与 Thr254（3.5 Å）、HIE244（2.6 Å）、Glu302（3.0 Å）氢键，得分 −4.372 kcal/mol。

理论计算表明 Cu-Ag 双金属纳米颗粒可抑制上述酶，与体外抗菌结果一致，提示其通过靶向细胞壁与脂肪酸合成途径发挥杀菌作用。

结论

共沉淀法成功制备 Cu:Ag 双金属纳米颗粒。XRD、SAED、FTIR、UV-Vis、HR-TEM、EDS 多技术表征确认了双金属相形成、核壳结构、Cu–Ag 键存在及带隙可调控。抗菌实验证实 Ag 掺杂浓度正相关增强杀菌效力，且对革兰氏阳性菌更优。分子对接预测其可靶向 β-内酰胺酶、FabI、FabH 关键酶，为抗菌机制提供理论支撑。未来需开展酶抑制体外实验及毒理学评价，推动其作为新型抗菌剂的临床转化。