多浓度铜：银双金属纳米颗粒的开发作为一种有前景的抗生素耐药细菌的杀菌剂，通过分子对接研究进行评估

介绍

由细菌、真菌、病毒和寄生虫组成的各种微生物存在于地球及其环境中。这些物种会导致医疗设备、保健商品、加工食品、水净化系统和家庭卫生产品的生产和使用出现并发症 [1, 2]。医生通常使用抗生素来杀死导致人类和动物疾病的细菌。频繁使用抗生素的缺点是，随着时间的推移，它会使细菌产生耐药性。抗生素还有助于减少体内存在的“好”细菌的数量，这些细菌可以对抗感染。由耐抗生素细菌引起的感染引起的疾病已成为当今医学领域关注的一个主要原因。在这方面，已鉴定出许多细菌具有耐药性 [3,4,5,6,7]。正在开展新的努力来解决耐药细菌的问题，并用更有效的补充疗法替代当前的抗微生物药物。在这方面，纳米技术为纳米材料的生产做出了重大贡献，例如金属和金属氧化物纳米粒子（即，Ag、Cu、CuO、TiO2、SiO2、MgO 和 ZnO），以对抗数量不断增加的抗菌素-耐药微生物。其中，Cu和Ag NPs表现出令人鼓舞的抗菌性能[8,9,10,11,12]。

近年来，双金属纳米颗粒已被开发并用于化学、材料科学、生物技术和环境保护等领域的各种应用。含有铜 (Cu) 和银 (Ag) 的双金属 NPs 具有高比例的表面原子和大的比表面积已被广泛研究 [13]。这些双金属 NP 因其增强的化学、光学、催化、生物、等离子体，尤其是抗菌特性而备受关注 [14,15,16,17,18,19,20]。 Ag 离子可以在 800 到 1000°C 的大气条件下被乙醇还原以获得银 NPs [21, 22]。银纳米粒子具有良好的抗菌功效，因此被用于生产防晒霜和水处理[23]。 Cu NPs是通过在乙二醇中在微波辐射下用肼还原硫酸铜制备的，也可用作抗菌剂[24,25,26]。

Cu 和 Ag 等金属单独不具有良好的光学、催化和结构特性，不能转化为双金属。另一方面，结合这两种金属 (Cu:Ag) 提供了新的机会来调整所得产品的结构和形态，以满足所需的应用。基于其最终结构，例如核壳结构、哑铃结构、双界面结构、随机混合结构或花形结构，双金属纳米颗粒可以表现出一系列的抗菌活性 [27,28,29,30 ,31]。合成双金属纳米颗粒的方法有共沉淀法、溶胶-凝胶法、水热法、还原法、微乳液法和多元醇法[32,33,34,35,36,37]。

本研究以氢氧化铵和去离子水为溶剂，聚乙烯吡咯烷酮为封端剂，硼氢化钠和抗坏血酸为还原剂，通过共沉淀法合成了Cu:Ag双金属纳米颗粒。制备了四种不同浓度的样品。随着制备的双金属纳米颗粒中银浓度的增加，样品对细菌鲍曼不动杆菌的活性增强 这会导致发烧和恶心。合成的材料在快速生长过程中呈现红色，表明抗菌活性随着双金属 NP 中 Ag 浓度的增加而增强。此外，使用分子对接研究进行了计算机模拟预测，以确定 Cu:Ag 双金属 NPs 对 β 的相互作用模式 -细胞壁生物合成途径的内酰胺酶以及脂肪酸生物合成途径的FabI和FabH酶。

方法

本研究旨在通过水热途径在Cu:Ag双金属纳米粒子中合成不同浓度的Ag，研究抗菌剂对抗生素耐药菌的作用。

材料

氯化铜 (II) (CuCl2 0.2H2O, 98.9%) 和硝酸银 (AgNO3) 作为前驱体，聚乙烯吡咯烷酮（PVP，平均分子量为 40,000）作为封端剂，硼氢化钠（NaBH4，99.9%）和 L-本研究使用抗坏血酸（C6H8O6，99.0%）作为还原剂，氢氧化铵（NH4OH）购自美国Sigma Aldrich。

双金属Cu:Ag NPs的合成

双金属 Cu:Ag NPs 使用共沉淀法制备，如图 1 所示。在去离子水中，加入 1.25 g PVP 和 0.5 g 抗坏血酸，并在 100 °C 下剧烈搅拌。分别制备两种 40 mL 氢氧化铵溶液；在一种溶液中加入 1.7 克氯化铜，在另一种溶液中加入 1.7 克硝酸银。然后将这两种溶液一个接一个地倒入加入 0.5g NaBH4 的最初制备的溶液中。然后，将最终溶液在 100°C 搅拌 4 小时以使其均匀，然后以 6000 rpm 离心以完全提取 NP。将获得的双金属 NP 在 100°C 下干燥以完全去除水分和杂质，以确保制备的双金属产品为纯形式 [12]。同样，以固定的Cu比例制备了四种不同Ag浓度（mol 2.5%、5%、7.5%和10%）的样品。

Cu:Ag双金属纳米颗粒的合成示意图

抗菌活性

评估了 Cu:Ag 双金属 NPs 对病原菌 S 的体外杀菌潜力。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌 和A。鲍曼不动杆菌 使用井扩散法从牛乳汁中分离得到。甘露醇盐琼脂、MacConkey琼脂和Lauria Bertani琼脂用分离的细菌活化生长1.5 × 10 ⁸ CFU/毫升。培养基固化后，使用具有 15 毫米直径和 10 微升 (5 µg/mL) 尺寸的黄色移液管制备五个孔。与作为阳性对照的 10 微升阿莫西林 (5 µg/mL) 和作为阴性对照的 50 µl DIW 相比，新鲜制备的 Cu:Ag 双金属 NP 以不同的比例加载到孔中。通过测量在 37°C 下孵育 15 小时后形成的抑菌圈（单位为 mm）来确定合成的 Cu:Ag 双金属 NPs 的杀菌活性。

统计分析

使用 SPSS 20.0 单因素方差分析 (ANOVA) [57] 认为具有抑菌圈 (mm) 测量值的合成纳米颗粒的杀菌活性具有统计学意义。

分子对接研究

抗生素通过细胞壁损伤、破坏生化过程、细胞膜损伤和穿透生物膜来减少细菌生长并导致细菌死亡 [38]。近几十年来，已经报道了大量具有潜在杀菌活性的纳米颗粒，它们通过破坏细胞壁或通过类似于已知抗生素的机制阻断食物来源来杀死细菌 [39,40,41]。因此，属于这些生化途径的酶被认为是抗生素发现的重要且有吸引力的目标[12]。在这里，来自细胞壁生物合成途径的关键酶（即 β -内酰胺酶）和脂肪酸生物合成途径（即 FabH 和 FabI）被选为可能的靶点，以评估 Cu:Ag 双金属纳米颗粒与其作为抑制剂的活性口袋相互作用的机制（见图 2）。

蛋白质靶标 β 的 3D 结构 -内酰胺酶，FabI（来自鲍氏不动杆菌 &S。金黄色葡萄球菌 ) 和来自 E 的 FabH。大肠杆菌

所选酶的 3D 结构参数从蛋白质数据库中获取，PDB 代码为：β 的 4U0X（2.03 Å 分辨率） -内酰胺酶 [42] 和 6AH9； A 中烯酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶 (FabI)​​ 的分辨率为 1.74 Å [43]。鲍米尼 . β -内酰胺酶（3D结构），PDB ID：1MWU；分辨率 2.6 Å [44] 和带有 PDB 代码的 FabI：4CV1； S 的第 1.95 [45] 号决议。金黄色葡萄球菌 而对于来自 E 的 FabH。大肠杆菌 有PDB代码：4Z8D；分辨率 2.0 Å [46]。

使用 ICM Molsoft v3.8-4a 或更高版本（Molsoft L.L.C., La Jolla, CA）软件对 Cu:Ag 双金属 NP 进行分子对接研究，以确定与活性位点关键残基的结合相互作用 [47]。使用ICM的蛋白质/受体制备工具对选定的酶靶点进行优化和结构制备。涉及的步骤包括添加极性 H 原子、删除水分子和使用默认参数最小化能量。去除共结晶的配体分子，为 NPs 的对接提供空间。使用指定结晶配体位置的网格框定义结合口袋。在每种情况下，选择前 10 个对接构象中结合能最低的构象来分析活性口袋内 Ag-Cu 双金属 NP 的相互作用模式和结合趋势。 Pymol 和发现工作室可视化软件被用于分析和结合相互作用的 3D 视图描述 [48]。 Cu:Ag双金属纳米颗粒的结构以.sdf格式从PubChem检索。

特征化

通过将 XRD（PAN 分析型 X'pert pro XRD）与 Cu-Kα 辐射（λ =0.154 nm，20° 至 80°）。使用傅立叶变换红外光谱-FTIR 和珀金埃尔默光谱仪评估对应于各种官能团的振动模式的存在。使用紫外-可见-Genesys 10S 分光光度计获取吸收光谱。 FESEM 结合 EDS 光谱仪 (JSM-6610LV) 和 HR-TEM (JEOL JEM 2100F) 被用来可视化表面形态。分子对接分析采用ICM v3.8-4a及以上（Molsoft L.L.C., La Jolla, CA）软件。

结果与讨论

进行XRD分析以评估配制产品的相组成和晶体结构。图 3a 显示了在 20° 和 80° 之间绘制的 XRD 图案。在双金属 Cu:Ag 中，根据 JCPDS No，观察到的 ~ 38.2°、46°、64.4° 和 77.1° 反射归因于 fcc Ag 相的 (111)、(200)、(220) 和 (311) 面. 04-0783 [32, 49,50,51,52]。而在 Cu 的情况下，在 32.6°、44.2° 和 51° 处出现的衍射表示 (110)、(111) 和 (200) 晶面，分别证实了 fcc 结构的 CuO 和金属 Cu 的存在，和与 JCPDS No. 04-0836 [32, 53,54,55,56] 匹配良好。在提取的图案中，观察到 Ag 和 Cu 峰，这表明存在构成 Ag 和 Cu 相的 NP。此外，具有较低 Ag 含量（例如，1:0.025、1:0.050 和 1:0.075）的样品中存在 CuO 表明，由于较低的 Ag 浓度，Cu NPs 被氧化并在高温下表现出非保护行为。 52]。相反，在具有最高 Ag 含量 (1:0.1) 的样品中，CuO 峰表现出低强度，这表明形成了部分无氧化物的产物 [57]。这表明由于添加了 Ag [52]，双金属 NP 的抗氧化性将得到改善。在仪器检测限内没有检测到额外的杂质峰，而每个晶面都包含基于原子密度的不同能量位点。 Cu 和 Ag NPs 在 (111) 处都具有高原子密度面，用于暴露平面的最大取向 [51, 58]。使用布拉格定律，发现 Ag 和 Cu 的 d 间距分别为 0.24 和 0.21 nm，这对应于两种元素的不同平面 (111)，并且与 HR-TEM 发现一致（图 6）[51, 59 ,60,61,62]。从制备的双金属产品中获得的相应 SAED 环（图 3b-d）显示出明显的环图案，表明产品结晶良好，与 XRD 图案一致。

一 从 Cu:Ag 双金属纳米粒子获得的 XRD 谱，b –d 使用 HR-TEM 获得的 SAED 环用于样品 b 1:0.025，c 1:0.050 和 d 1:0.10，e 制备样品的FTIR光谱

FTIR 光谱在 500 到 4000 cm ^-1 之间记录 如图 3e 所示；位于 600 到 900 cm ^-1 之间的传输波段 是由形成 Cu:Ag 键合引起的 [63]。在 ~ 1200 和 1400 cm ⁻¹ 附近观察到的波段 分别归因于 C-O 和 C-H；峰值出现在 ~ 1800 和 2100 cm ^-1 由于 PVP 和 NH4OH，对应于 C=O 和 N-H 键合 [64]。在 ~ 2800 cm ⁻¹ 附近观察到的透射率 和 3400 厘米 ⁻¹ 归因于C≡N和羟基（O-H）的存在[64]。

图 4a 显示了 Ag-Cu 双金属 NP 的吸收光谱，在 340、410 和 500 nm 处具有清晰的吸收带，这归因于金属 Ag 和 Cu 的表面等离子体共振吸收 [52]。出现在 410 nm 处的谱带通常是由于 Ag NPs 的存在而出现的，位于 510 nm 处的后一个峰归因于 Cu NPs 的存在 [52, 57,58,59, 65,66,67]。可能表明双金属 NPs 是由不同的 Ag 和 Cu 相开发的，而不是如前所述 [52] 所讨论的 XRD 结果也证实的双金属开发。观察到 410 nm 处的吸收带略有红移，并且最大吸收随着 Ag 含量的增加而增加 [58]。使用 Tauc 方程，

$$[\alpha h\nu =K\left( {h\nu - Eg} \right)^{n} ]$$ (1)

其中 α 被认为是吸收系数 [2.303 log(T /d ), T 是透射光，d 显示样品池的厚度], h 表示普朗克常数 (6.62607015 × 10 ⁻³⁴ Js), \(\nu\) 是光的频率，K 显示吸收指数，E g 等于带隙能量，单位为 eV。 “n”的值 ”与带隙的电子跃迁类型有关 [13, 26, 68, 69]。计算所得双金属产品的带隙为 3.2、2.9、2.7 和 2.6 eV，如图 4b-e 所示。

从双金属 b 获得的紫外-可见光谱 –e Tauc图分析

从合成的 Cu:Ag 双金属纳米复合材料的 SEM 图像（图 5a-d）中，观察到小颗粒沉积在大颗粒的表面。 Ag 含量从 2.5% 增加到 7.5% 导致形成具有不同形态的各种颗粒，最终形成厚实的 Cu:Ag NPs。此外，随着掺杂剂浓度的增加，不均匀和微小的 Ag 颗粒的积累增加，表明在其表面上出现了更多分散的块。这表明 Ag 掺杂到 Cu 中对形态的主要影响，这通过 HR-TEM 显微照片进一步证实（见图 5e-h）。

a–d 从制备的产品中获得的 SEM 图像，e–h HR-TEM显微照片

为了进一步详细说明制备的双金属的形态和 d 间距，使用了分辨率为 10 nm 的 HR-TEM。在图 6a 中，Cu NPs 的 d 间距（0.21 nm）对应于 Cu 的（111）面，这在 XRD 结果（图 3a）中也很明显。图 6b 描绘了层间距（0.21 到 0.22 nm）的轻微增加，并显示了与 (111) 平面匹配的具有 0.24 nm 面间距的 Ag NP。类似地，图 6c、d 显示了双金属的计算层间距和分离相，而图 6e 显示了 Ag 和 Cu NP 的颗粒形状。可见 HR-TEM 图像中的颗粒具有核壳结构。在单个颗粒内的图 6d 中，记录了从 Cu 和 Ag 发出的晶格条纹。这强烈表明形成了具有不同 Cu:Ag 比率的核壳双金属 NP，从而产生了不规则的准球形 NP。此外，TEM 图像显示颗粒看起来像暗区和亮区。单个颗粒内对比度的这种变化可能表明存在两种不同的成分材料，表明双金属 Cu:Ag 颗粒的产生 [70, 71]。

a–d 用于所有制备样品的 d 间距测量的 HR-TEM (10 nm) 图像，e 双金属颗粒的低倍图像

EDS 光谱中明显峰的存在和源自双金属的元素组成证实了 Cu:Ag NPs 的成功形成。图 7a 表示从 1:0.050 样品获得的 EDS 光谱，显示出清晰的 Cu 和 Ag 峰。图 7b 取自 1:010 样品，其中在掺杂样品中检测到 C 和 O 的峰。这些出现是因为碳片用于在 SEM 检查期间固定样品和/或由于 SEM-EDS 传感器中的背景计数。

从双金属纳米颗粒获得的 EDS 剖面

表 1 显示了使用琼脂井扩散试验的 Cu:Ag 双金属 NPs 的体外杀菌功效。结果表明合成的 NPs 浓度与抑制区 (mm) 之间存在直接比例关系。统计显着性 (P <0.05) 抑制区记录 (2.5, 5, 7.5 和 10 wt%) Ag 掺杂剂对 S。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌 和A。鲍曼不动杆菌 范围分别为 0.85-2.8 毫米、0.55-1.95 毫米和 0.65-1.85 毫米，参见表 1。所有结果分别与作为阴性和阳性对照的 DIW（0 毫米）和阿莫西林（4 毫米）进行比较。同样，掺杂的 NPs 对 S 的百分比功效增加 (21.2–70%)、(13.7–48.7%) 和 (16.2–46.2%)。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌 和A。鲍曼不动杆菌 ， 分别。总体而言，发现 Cu:Ag 双金属 NPs 对 S 更有效。金黄色葡萄球菌 （即 gram + ive）与 E 相比。大肠杆菌 和A。鲍曼不动杆菌 （即 gram -ive）。

<图>

纳米颗粒的大小、浓度和形状直接影响纳米结构产生的氧化应激。由于增加了阳离子 (++) 的可用性，Ag 掺杂的 Cu 双金属 NP 的重量百分比掺杂量增加，因此抑制区 (mm) 形式的杀菌效力得到提高。在大小和浓度方面的杀菌作用与大小成反比 [58, 59]。纳米尺寸的结构有效地产生活性氧 (ROS)，活性氧存在于细菌细胞膜中，导致细胞器的挤出并最终导致细菌死亡 [60]。除了 ROS 的产生，Ag ⁺ 的阳离子相互作用 和铜 ⁺⁺ 细菌细胞膜带负电荷部分通过细胞裂解和细菌崩溃在增加浓度时提高杀菌效果[58, 61]。

自过去几十年以来，已经广泛研究了各类纳米粒子的生物学应用。由于纳米颗粒的独特特性，它们作为杀菌剂的潜力已被广泛利用，能够替代传统抗生素。 NPs 与细菌细胞相互作用，破坏细胞膜渗透并破坏关键的代谢途径 [72]。纳米颗粒对细菌毒性的具体机制有待探索。据信纳米颗粒与细菌细胞相互作用，涉及静电力、范德华力或疏水相互作用，最终导致细菌死亡。据报道，酶是参与细菌感染的主要毒力因子，靶向它们以抑制其活性有助于解决引起的感染 [73]。在这里，Cu:Ag NPs 针对细胞壁酶靶点以及脂肪酸生物合成途径的分子对接研究确定了这些 NPs 在活性口袋内的结合相互作用模式。考虑到这些 NPs 对 A 的体外抗菌潜力。鲍米尼 ，S。金黄色葡萄球菌 和E。大肠杆菌 ，从这些微生物中选择酶靶点，以深入了解其杀菌活性背后的可能机制。

在具有 β 的 Cu:Ag 双金属 NP 的情况下观察到的最佳对接构象 -来自A的内酰胺酶。鲍米尼 揭示了与 Glu272 (2.8 Å) 和 Ser286 (3.2 Å) 的氢键相互作用以及与 Val292 的金属接触相互作用，而对接分数为 - 4.013 kcal/mol（图 8a）。同样，观察到的 Ag-Cu 双金属 NPs 对 β 的结合评分 -来自S的内酰胺酶。金黄色葡萄球菌 是 - 4.981 kcal/mol，与 Ser403 (3.2 Å)、Tyr519 (3​​.6 Å)、Gln521 (3.0 Å) 和 Asn464 (3.1 Å) 具有氢键相互作用，如图 8b 所示。

活性口袋内 Ag-Cu 双金属 NPs 的结合相互作用模式。 一 β -来自A的内酰胺酶。鲍米尼 , b β -来自S的内酰胺酶。金黄色葡萄球菌 . c , d 活性口袋内Ag-Cu双金属纳米颗粒的结合相互作用模式c 来自A的烯酰-[酰基-载体-蛋白]还原酶(FabI)​​。鲍米尼 , d 来自S的烯酰-[酰基-载体-蛋白]还原酶(FabI)​​。金黄色葡萄球菌 , e 来自E的FabH活性口袋内Ag-Cu双金属NP的结合相互作用模式。大肠杆菌

当前研究 FabI 中选择的第二个酶靶点属于脂肪酸生物合成途径，分子对接预测表明 Cu:Ag 双金属 NPs 作为该靶点的潜在抑制剂。 Cu:Ag 双金属 NP 对来自 A 的 FabI 显示出良好的结合分数 (-3.385 kcal/mol)。鲍米尼 与 Ser201 (2.7 Å)、Ala199 (3.5 Å) 和 Leu198 (3.3 Å) 具有 H 键合，如图 8c 所示。同样，Ag-Cu NPs 与来自 S 的 FabI 活性位点的最佳对接构象。金黄色葡萄球菌 显示与 Gly202 (2.5 Å) 和 Gln155 (2.5 Å) 的 H 键合，结合得分为 - 3.012 kcal/mol（图 8d）。

此外，Cu:Ag 双金属 NPs 对 E.coli FabH 的结合能力 还评估了与 Thr254 (3.5 Å)、HIE244 (2.6 Å) 和 Glu302 (3.0 Å) 的氢键相互作用，观察到的结合分数为 - 4.372 kcal/mol，如图 8e 所示。

结论

Cu:Ag 双金属纳米粒子是通过共沉淀法制备的，用于对抗细菌相关疾病。 XRD 谱证实了 fcc 结构的 CuO 和金属 Cu 和 Ag 颗粒的存在。观察到 Ag 和 Cu 峰，这表示双金属 NPs 需要 Ag 和 Cu 相。在 XRD 分析中观察到的平面与 SAED 环很好地对应。与配方产品相连的化学基团和特征透射带在 600 到 900 厘米之间 ^-1 是由 Cu:Ag 键的形成引起的。绘制的 UV-vis 光谱显示在 410 nm 处有吸收，这通常是由于 Ag NPs 的存在而引起的，而位于 510 nm 处的后一个峰归因于 Cu NPs 的存在。可见 HR-TEM 图像中的颗粒具有核壳结构。 Cu:Ag NPs 清楚地显示出具有不同 Cu:Ag 比率的双金属 NPs 的形成，产生不规则的准球形 NPs。此外，Cu NPs 的 d 间距，即 0.21 nm 对应于 XRD 结果中检测到的 Cu 的 (111) 面。层间距的轻微增加（从 0.21 到 0.22 nm）也表明具有 0.24 nm 层距的 Ag NPs 与（111）面匹配。分子对接研究显示与体外杀菌活性良好一致。 Cu:Ag双金属纳米颗粒对β的结合趋势 细胞壁生物合成途径的β-内酰胺酶以及脂肪酸生物合成途径的FabI和FabH酶均表现出抑制潜力，需要通过酶抑制研究进一步探索。

数据和材料的可用性

所有数据均可按需提供。

缩写

EDS：

能量色散X射线光谱

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

G + ve:

革兰氏阳性

G -ve：

革兰氏阴性

HR-TEM：

高分辨透射电子显微镜

JCPDS：

粉末衍射标准联合委员会

Ag：

银色

UV-Vis：

紫外可见光谱

XRD：

X射线衍射