DNA 四面体递送增强多柔比星诱导的 HT-29 结肠癌细胞凋亡

背景

多柔比星(Dox)是应用最广泛的抗肿瘤药物之一，大量临床研究表明，多柔比星通过抑制RNA和DNA的合成，可以显着阻碍肿瘤细胞在各种细胞生长周期中的生长[1, 2]。以往的研究表明，肿瘤细胞的增殖在G1期被有效阻断，转移也被一定浓度的Dox抑制[3]。此外，与其他抗癌药物相比，可以在相对较小的剂量下实现有效抑制[4]。然而，由于缺乏对肿瘤细胞的特异性靶向以及对DNA和RNA的非选择性抑制，Dox通常会引起副作用，严重限制了临床应用[5, 6]。同时，低细胞摄取能力减少了肿瘤细胞中Dox的积累[7]。因此，应开发一种高效的Dox递送系统，使Dox具有更特异性和更有效的靶向性，更易于封装，并具有良好的摄入能力和生物相容性。

纳米药物载体，如脂质体和无机纳米粒子，可以促进 Dox 穿透肿瘤细胞膜，提高靶向效率[8]。尽管如此，由于靶向性相对较差，基于脂质体的递送并不能减少对正常细胞的副作用；同时，无机载体，如介孔二氧化硅纳米粒子，在体内不能完全生物降解，阻碍了进一步的药物吸收过程并带来潜在的生物毒性。对于这些功能性递送系统，制备的复杂性、纳米颗粒结构的不均匀性和低封装效率阻碍了临床扩展 [9,10,11]。作为一种具有优异药物递送性能的纳米级药物载体，基于 DNA 的结构，如 DNA 四面体（DNA tetra），可以通过避免带负电的 DNA 与质膜之间的不相容性而穿透膜 [12,13, 14,15,16,17]。药物和靶向分子都可以共价连接到 DNA 四面体上。此外，DNA四面体序列的易吸收和生物降解避免了长时间保留。富含鸟嘌呤的适体药物，如 AS1411，已成功递送到 A549 肿瘤细胞中，并作为靶向剂和抑制剂发挥作用 [18]。免疫调节因子，如 CpG 和 siRNA，也可以通过 DNA tetra 载体递送至肿瘤细胞以调节免疫反应 [19]。 DNA tetra具有毒性低、生物相容性好、靶向可调等优点，显示出生物安全性和Dox递送潜力。

在这项研究中，设计、合成和表征了 DNA 四面体的功能颗粒，其中 DOX 作为抗癌药物，叶酸作为特异性识别分子 [20]。考虑到细胞膜表面的叶酸受体显着上调，对结肠癌细胞的抗癌效率进行了评估。具体而言，测定了HT-29细胞系的细胞摄取水平、Dox诱导的细胞凋亡程度和对细胞增殖的抑制。

方法

摄政和装备

DNA寡核苷酸链购自中国大连的TAKARA。 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (DMEM) 和胎牛血清购自美国纽约的 Gibco。青霉素和链霉素购自中国上海的 Beyotime biotechnology。叶酸、阿霉素、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H 溴化四唑 (MTT) 和琼脂糖购自美国密苏里州的 Sigma-Aldrich。所有抗体均购自中国上海的 Abcam 公司。其他试剂购自中国上海国药化学试剂有限公司。

紫外可见分光光度计（Thermo Evolution 201）和恒温培养箱购自美国赛默飞世尔；离心机（GT10-1）购自北京时代北力离心机有限公司；荧光分光光度计（UV-1800）购自岛津制作所。共聚焦激光扫描显微镜（Visitech）购自徕卡公司；聚合酶链反应仪（PCR，T100）、蛋白电泳仪、核酸电泳仪购自Bio-Rad公司；动态光粒度仪购自贝克曼公司； 96孔或24孔细胞培养板购自道康宁公司。 C18色谱柱高效液相色谱（HPLC，Agilent 1200）购自安捷伦科技公司。

将人结肠癌细胞系 HT-29 维持在补充有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 中，在含有 95% 空气和 5% 二氧化碳的潮湿气氛中，温度为 37°C .

DNA四面体的合成与纯化

在这项研究中，合成遵循图 1 中的示意性程序，DNA 四面体的单链 DNA (ssDNA) 序列也在图 1 中提供。具体而言，将每个ssDNA溶解在0.5×TE缓冲液中，并通过紫外分光光度计在260 nm处测定DNA的相应光密度（OD）值。补充额外的 TE 缓冲液以制备相同浓度的四个链。 100 μL 中 1 μM 的四种 ssDNA 的混合比例为 1:1:1:1。反应在聚合酶链式反应 (PCR) 机器中进行，循环条件为：95°C，10 分钟，自然冷却至 4°C。所有单链 DNA 均通过 HPLC 纯化，260 nm 作为特征吸收峰。在HPLC谱中，DNA tetra的峰时间比单链的峰时间快，在相应的时间点收集到产物。

叶酸-DNA tetra-Dox、DNA tetra-Dox 和叶酸-DNA tetra 的示意图。提供了DNA四面体的单链DNA序列。描述了靶向肿瘤细胞、穿透细胞膜、插入DNA的过程

叶酸-DNA tetra-Dox 的合成和表征

Dox 和叶酸的游离氢基团用叠氮基团修饰，然后通过点击化学反应与 ssDNA 的 3'-OH 偶联 [21]。当添加不同数量的官能团标记 ssDNA 时，官能团的比例可以通过侧链的特定杂交进行化学计量控制。合成叶酸-DNA四面体时，将叶酸与DNA四面体的摩尔比设为1:1。 DNA tetra-Dox 的合成中，Dox 与DNA 四面体的摩尔比设为4:1。合成叶酸-DNA tetra-Dox时，叶酸、DNA四面体和Dox的摩尔比分别设为1:1:3。所有合成均在 37°C 下以微摩尔水平进行，然后在 4°C 下储存 [22]。

在本研究中，该系列 DNA tetra 复合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 与 8% 分离凝胶 (39% Acr-Bis) 进行表征，以检查纯度和相对分子大小。样品由不同的 DNA 四结构体和 6x 上样缓冲液组成，混合比例为 2:1。样品在 110 V 凝胶电泳 90 分钟后进行染色和分析。为了找出粒径的差异，还使用动态光散射 (DLS) 仪器对 DNA tetra 样品进行了动态光扫描。

DNA 四促进细胞摄取

对于本研究中设计的不同偶联结构，通过比较 HT-29 细胞的摄取率来计算药物递送效率。利用 Dox 的特征荧光光谱（即 470 nm 的激发光和 590 nm 的发射光）评估和量化细胞摄取效率。 HT-29 细胞在 2 × 10 ⁵ /mL 接种在 24 孔板中并培养 24 小时。将细胞与 10 μM 的各种 DNA 四结构体再孵育 24 小时。然后弃去培养基，用PBS漂洗细胞3次。细胞固定时，立即加入4%多聚甲醛，室温共孵育30分钟，再次用PBS漂洗细胞3次。最后通过激光共聚焦显微镜观察24孔板，比较基于发射光强度的细胞摄取效率。

细胞毒性和抗癌效率

使用 MTT 测定法评估细胞毒性和抗癌效率，其中 DMSO 中的 MTT 与细胞内琥珀酸脱氢酶之间发生氧化还原反应。 HT-29细胞接种于96孔培养板培养24 h。

对于 DNA tetra 作为药物载体的细胞毒性，加入含有 0–100 μM 浓度的 DNA tetra 结构的培养基，再孵育 24 或 48 小时。然后，将 100 μL MTT 溶液 (5 mg/mL) 添加到每个孔中，并将混合物在 37°C 下孵育 4 小时。然后除去液体，将细胞裂解并用 200 μL DMSO 溶解。通过 Microreader 在 570 nm 处测量上清液的吸光度。未处理的HT-29样品作为对照组。

对于与叶酸或Dox偶联的DNA四面体，一方面的研究重点是稳定性、生物安全性和抑制效率；另一方面，还探讨了 DNA tetra-Dox 的 Dox 是否具有与以前相当的抗肿瘤特性。因此，评估了 DNA 四复合物的细胞毒性和抗肿瘤效率。分别为 100 μM 的复合物与 HT-29 细胞一起温育。每 6 小时收集一次细胞样品，然后通过 MTT 法检测以评估潜伏期的影响。特别关注结构变异导致的抗癌效率差异。此外，通过 MTT 测定评估了 0-200 μM 叶酸-DNA tetra-Dox 处理后浓度对 HT-29 抑制的影响。

Western Blot 和流式细胞术

为了表征由 DNA tetra 递送促进的 Dox 诱导的细胞凋亡，使用热解液加热和裂解处理细胞的蛋白质样品，在 100 V 恒流条件下通过 12% SDS-PAGE 分析以分离样品，然后印迹到 0.22 微米直径的 PVDF 膜上 1 小时。样品用脱脂牛奶封闭 1 小时。 PBST 洗涤 3 次后，用兔抗 caspase-3 孵育过夜。然后，用山羊抗兔 IgG 二抗探测样品 1 小时，然后用 PBST 洗涤并通过 Bio-Rad 蛋白质成像系统成像。进一步选择GAPDH作为内参蛋白，因为它在细胞中稳定表达。

流式细胞术进一步用于通过 MTT 测定在选定的浓度和时间点量化细胞凋亡水平。 HT-29细胞与抑制剂孵育一段时间后，采用Annexin V-PI双染法定量流式细胞仪检测。

细胞增殖定量

细胞计数方法用于量化细胞增殖随时间的变化。具体来说，用100 μM的叶酸-DNA tetra-Dox处理一段时间后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞30 s，然后加入等体积的完全培养基终止反应。在 1000 rpm 离心 3 分钟后丢弃上清液，并用完全培养基重新悬浮细胞。用细胞计数板在光学显微镜下记录各检测点的细胞数，绘制细胞增殖曲线。

统计分析

在这项研究中，差异的显着性是使用学生的 t 检验（双尾；两个样本等方差）。 P <0.05 表示不同组之间存在显着差异。

结果

叶酸-DNA tetra-Dox 的制备

在具体的合成过程中，Dox与DNA四面体按不同比例混合，完成Dox的加载和组装（w 米 =543.52) 和叶酸 (w 米 =441.4）。如图 2a 所示，由于 Dox 和叶酸是分子量相对较低且相似的单体，四面体中的 DNA 和具有一个功能分子的缀合物具有大致相当的分子量。然而，Dox 或叶酸与四面体的所有四个 DNA 顶点组装使 DNA tetra 的分子大小明显增加。如图 2b 所示，大部分 DNA 四面体单体尺寸小于 15 nm。随着偶联基团的增加，DNA tetra 的对称结构被破坏，化合物的粒径介质显着增加。特别是叶酸-DNA tetra-Dox 的尺寸扩展将介质直径扩展到20 nm。

具有不同成分的 DNA tetra 的表征。 一 从左到右：DNA 阶梯、DNA tetra、叶酸-DNA tetra、叶酸-DNA tetra-Dox 和 DNA tetra-Dox 在 8% SDS-PAGE 中成像。 b 动态光散射检测DNA tetra、叶酸-DNA tetra、叶酸-DNA tetra-Dox、DNA tetra-Dox 的粒径分布

药物递送效率

与不同的DNA四结构体孵育24 h后，用荧光成像评估Dox的胞内效率，其中胞内红色荧光为Dox的特征荧光；因此，DNA tetra 培养的细胞没有表现出任何荧光信号，如图3a 所示，叶酸-DNA tetra-Dox 和DNA tetra-Dox 复合物培养的细胞的红色信号明显高于Dox，这意味着DNA tetra 导致Dox 的细胞摄取效率显着提高，促进了膜的渗透，以及Dox 与DNA tetra 结合物的细胞内稳定性。

HT-29 细胞与不同复合物孵育 24 小时后的摄取效率。 一 共聚焦显微镜检测（红色是 Dox 的荧光激发光，比例尺 =10 μm）。 b 细胞荧光强度。 **P <0.05 与 DNA tetra 组相比

荧光强度的进一步定量分析（图 3b）证明了视觉发现，叶酸-DNA tetra-Dox 和 DNA tetra-Dox 复合物之间没有显着差异（P <0.05）。药物和细胞共孵育的方法阻碍了叶酸靶向能力的完全展现。相对较高的浓度证实了叶酸受体的特异性识别，理论上在复杂循环系统的体内应用中更为明显。总之，DNA tetra 传递保证了Dox 的抗癌效率。

细胞毒性和抗癌效率

首先，HT-29 细胞与不同浓度的 DNA tetra 共孵育的活力使用 MTT 测定进行了检查。 DNA tetra 处理在 HT-29 细胞中以 0-100 μM 处理 24 和 48 小时没有明显的细胞毒性（图 4a）。因此，纳米尺寸的DNA四面体提供了一个生物安全的药物载体平台。

Dox 复合物和 DNA tetra 对 HT-29 细胞的细胞毒性和抗肿瘤效率。 一 HT-29 细胞与不同浓度的 DNA tetra 孵育 24 或 48 小时的活力。 b Dox 复合物在 100 μM 时的抗肿瘤效率。 c HT-29 细胞与不同浓度的叶酸-DNA tetra-Dox 孵育 24 或 48 小时后的存活率

其次，由于 Dox 递送效率的差异，叶酸-DNA tetra-Dox 和 DNA tetra-Dox 在 48 小时内表现出更显着的抑制效率（图 4b）。由于缺乏有效的抗癌成分，DNA 四叶酸在 48 小时共孵育期间导致存活率的降低可以忽略不计（<10%）。由于 Dox 不能客观地穿透细胞膜，Dox 引起的细胞活力下降小于其他组。特别是叶酸-DNA tetra-Dox 在孵育后 6 h 表现出更早、更显着的下降，证明叶酸靶向帮助药物定位在膜上，使 Dox 起效更及时。相比之下，DNA tetra-Dox 在孵育后 12 小时开始明显起效，表明靶向组的重要性。

此外，用 0-200 μM 的叶酸-DNA tetra-Dox 处理 HT-29 细胞以检测有效浓度（图 4c）。 HT-29 细胞的细胞活力随着复合物浓度 (0-100 μM) 的增加而迅速下降，但 100 和 200 μM 的浓度之间没有显着差异，表明叶酸-DNA 四- Dox，其中 100 μM 可被视为抗肿瘤作用的有效浓度。此外，10、20 和 50 μM 组的细胞活力从 24 小时到 48 小时显着变化，表明孵育时间也是影响基于叶酸-DNA tetra-Dox 的抗癌效率的一个因素。

叶酸-DNA tetra-Dox 诱导的细胞凋亡

因此，基于蛋白质印迹分析（图 5a），叶酸-DNA tetra-Dox 和 DNA tetra-Dox 诱导的 caspase-3 表达显着增加，证明细胞凋亡是 Dox-诱导细胞死亡。

不同复合物作用后细胞凋亡相关caspase-3的表达(a ) 和 HT-29 细胞与 DNA tetra、Dox、DNA tetra-Dox 和叶酸-DNA tetra-Dox 孵育后的流式细胞术 (b –e )

流式细胞术（图 5b-e）进一步证明，与 100 μM 的叶酸-DNA tetra-Dox 孵育 6 小时可诱导 68.7% 的细胞凋亡。同时，同样培养条件下，Dox和DNA tetra-Dox诱导的细胞凋亡率分别为32.8%和60.5%。

抑制细胞增殖

根据 MTT 分析，100 μM 是诱导细胞凋亡的有效浓度，并在细胞增殖实验中选择。如细胞增殖曲线所示（图6），由于细胞摄取过程耗时，在共培养早期并未完全显示对细胞增殖的抑制。与叶酸-DNA tetra-Dox 孵育 6 小时以上后出现显着抑制作用，证明 DNA tetra-enhanced 内吞作用的存在。同时，6 h 是与图 4b 中检测到的有效时间段的比较时间段。

100 μM 叶酸-DNA tetra-Dox 孵育不同时间对细胞增殖的抑制

讨论

点击化学反应作为DNA修饰的常用手段，具有反应效率高、控制良好、操作简便等优点[21]。显示单一品牌的电泳图（图2a），表明通过点击化学反应共价偶联获得了高纯度的产品。 Dox 的荧光特性使其在体外和体内均可追踪；同时，肿瘤细胞内的荧光间接证明了叶酸-DNA tetra-Dox在穿透细胞膜过程中的稳定性。因此，叶酸-DNA tetra-Dox具有良好的生物医学应用能力和稳定性。

DNA tetra 具有将药物输送到细胞中的能力。本研究中使用的所有 DNA 序列均未针对任何遗传信息进行编码。因此，在所有检查中都没有报告对基因表达和细胞代谢的副作用。同时，由于肿瘤细胞表面叶酸受体的高表达，因此选择叶酸作为给药系统的特异性靶向分子，以提高DNA tetra复合物的摄取效率。然而，在DNA tetra浓度较高的情况下，叶酸受体靶向的优势在体外并未得到充分体现。因此，对于体内应用，叶酸具有提高复杂循环系统靶向效率的潜力。

目前，抗癌药物通常会带来意想不到的副作用，因此提高肿瘤细胞靶向能力和递送效率的研究一直是一个热门话题[23,24,25]。以往的研究表明，DNA四面体携带药物的能力是基于其良好的相容性。 DNA四面体是一种具有良好修饰和适当生物相容性的人工容器。本研究中，Dox、叶酸与DNA四面体的成功偶联取得了令人满意的抑制效果，并导致HT-29细胞明显凋亡。由于DNA tetra可以被修饰并与药物和靶向分子偶联，实现了肿瘤细胞局部药物浓度的富集。以上结果证明了DNA tetra递送对肿瘤细胞的良好识别和相应增强的抑制作用，该纳米级药物递送系统可以得到更广泛的应用。

结论

作为一种新开发的药物递送策略，纳米尺寸的DNA结构具有成本低、稳定性高、合成可行性高等优点；同时，由于缺乏外源性免疫活性，它是生物安全的。 DNA四面体偶联策略促进了Dox的靶向递送，提高了Dox对结肠癌细胞的抗癌效率，为药物设计提供了有希望的启示和思路。