用于细胞成像的近红外发射 Cr3+/Eu3+ 共掺杂锌镓锗酸盐持久性发光纳米颗粒

背景

持久性发光材料可以在激发停止后持续发光长达数小时[1]。主要由于其巨大的研究兴趣，荧光粉已作为夜间或黑暗环境视觉材料商业化，用于广泛的应用，如安全标志、紧急路线标志、识别标记或医疗诊断 [2]。典型的长余辉荧光粉是商业化的原色发光体，例如红色 Y2O2S:Eu ³⁺ ,Mg ²⁺ ,Ti ⁴⁺ 或 CaS:Eu ²⁺ ,Tm ³⁺ ,Ce ³⁺ [3, 4], 绿色 SrAl2O4:Eu ²⁺ ,Dy ³⁺ 或 MgAl2O4:Mn ²⁺ [5, 6] 和蓝色 CaAl2O4:Eu ²⁺ ,Nd ³⁺ 或 SrMgSi2O6:Eu ²⁺ ,Dy ³⁺ [7, 8] 荧光粉。尽管在可见光持久性磷光体方面取得了许多成功，但对近红外 (NIR) 区域 (~ 700–2500 nm) 中持久性磷光体的研究和开发还不够。近年来，显示红色或近红外发光的持久性荧光粉的潜在应用已经从夜视安全标志扩展到体内成像系统[1, 9, 10]。

Chen和Zhang首先尝试将带有光敏剂的持久发光材料作为体内试剂用于光动力治疗[11]。然后，Scherman 等人。报道了使用 Ca0.2Zn0.9Mg0.9Si2O6:Eu ²⁺ 的近红外发光磷光体进行体内生物成像的里程碑工作 ,Mn ²⁺ ,Dy ³⁺ [12]。不久之后，CaMgSi2O6:Eu ²⁺ 两种新的近红外发光荧光粉 ,Mn ²⁺ ,Pr ³⁺ 和 Ca2Si5N8:Eu ²⁺ ,Tm ³⁺ 同一组[13, 14] 开发了具有改进性能的工具。最近，Cr ³⁺ 具有近红外发射和长余辉的掺杂镓酸盐持久荧光粉，包括尖晶石 ZnGa2O4:Cr ³⁺ 及其变体，例如 Zn3Ga2Ge2O10:Cr ³⁺ , Zn3Ga2GeO8:Cr ³⁺ ,Yb ³⁺ ,呃 ³⁺ , 和 ZnGa2 - x (Ge/Sn) x O4:Cr ³⁺ , 是通过固态方法制备的 [1, 9, 10, 15,16,17,18,19,20,21]。陶瓷圆盘样品在 NIR 区域表现出长达 360 小时的余辉时间，但笨重的材料不适合体内生物成像。 ZnGa2O4:Cr ³⁺ 近红外长余辉发光纳米粒子 [22, 23], ZnGa2O4:Cr ³⁺ ,Sn ⁴⁺ [19,20,21] 和 Zn2.94Ga1.96Ge2O10:Cr ³⁺ ,Pr ³⁺ [9] 是通过溶胶-凝胶法结合随后的无还原气氛煅烧合成的。纳米颗粒粉末的持久发光在生物透明窗口中表现出明亮的近红外发光，具有超长的余辉时间。聚乙二醇化极大地提高了纳米颗粒的生物相容性和水溶性，在无需原位激发的情况下，具有高信噪比的长期体内生物成像应用潜力巨大。据信，选自碱土金属离子、镧系元素离子和Li ⁺ 的离子 与Cr ³⁺ 共掺杂 在没食子酸锌和没食子酸锌中会产生显着的 NIR 持久发光 [1]。欧盟 ³⁺ 在氧化物主体中总是表现出由 ⁵ 引起的~ 700 nm 处的红色发射 D0- ⁷ F4 内 4f 短紫外激发后的电子跃迁到 250 nm 处的电荷转移 (CT) 带 [24]。另一方面，Cr ³⁺ 由于自旋禁止 ² ，它的窄带发射（通常在 700 nm）是固体中的一个有利的发光中心 E- ⁴ 由于自旋允许的 ⁴ ，A2 跃迁或宽带发射（650–1600 nm） T2- ⁴ A2 过渡 [1, 20]。鉴于这些，Cr ³⁺ /Eu ³⁺ 由于O ²⁻ 的电荷转移带(CTB)，共掺杂镓酸锌和镓锗酸锌会产生强烈的近红外持续发光 -Eu ³⁺ 与 O ²⁻ 的 CTB 重叠 -Ga ³⁺ ，以及 ⁵ 在 ~ 700 nm 处的发射 D0- ⁷ Eu ³⁺ 的F4跃迁 与 ² 的重叠 E- ⁴ Cr ³⁺ 的A2跃迁 .此外，Eu ³⁺ 离子取代Ga ³⁺ 畸变八面体位置的离子可能会在 Cr ³⁺ 周围产生合适的宿主晶体场强 离子，从而影响 NIR 发射。在这项工作中，Zn3Ga2Ge2O10:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ （称为 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ ) 纳米粒子是通过溶胶-凝胶法结合随后的还原性无气氛煅烧合成的，这将用作未来生物成像的有前途的纳米探针。通过 X 射线衍射 (XRD)、透射电子显微镜 (TEM)、STEM、选区电子衍射 (SAED)、光致发光激发 (PLE)/光致发光 (PL) 光谱和温度的组合技术对样品进行详细表征依赖 PL 分析。在以下部分中，我们报告了 ZGGO:Cr ³⁺ 的合成、表征和应用 ,Eu ³⁺ 纳米粒子。

实验

综合

起始金属源为 Zn(NO3)2·6H2O、Cr(NO3)3·9H2O、Ga2O3、Eu2O3 和 GeO2，均为 99.99% 纯度的产品，购自国药集团（中国上海）。其他试剂为分析纯，购自沉阳化学试剂厂（中国沉阳）。 Zn(NO3)2·6H2O和Cr(NO3)3·9H2O溶解在去离子水中。 Ga2O3和Eu2O3溶解在硝酸溶液中。 GeO2 和乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶解在稀氢氧化铵中。向混合溶液中缓慢加入EDTA溶液，无沉淀，总金属离子与EDTA的摩尔比保持在1:2。 Zn:Ga:Ge:Cr:Eu 的原子摩尔比固定为 3:1.984:2:0.01:0.006。最终溶液在室温下剧烈搅拌 1 小时，然后在 85°C 的烘箱中加热以缓慢蒸发水，直到溶液变成溶胶，最终变成凝胶。将获得的凝胶在 200°C 下加热 3 小时以形成黑色多孔材料。最后，多孔材料在流动的 O2 气体 (200 mL/min) 下在选定的温度下研磨和退火 2 小时。

表面功能化

ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 将粉末研磨 30 分钟，然后将 150 毫克所得样品加入 50 毫升 0.1 摩尔/升 NaOH 溶液中。超声处理 1 小时后，将悬浮液在室温下剧烈搅拌 24 小时。将所得胶体溶液以 1000 rpm 离心 10 分钟以去除大尺寸颗粒，并将上清液以 10,000 rpm 离心 10 分钟以收集沉淀物。得到的 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ -OH纳米颗粒用去离子水洗涤3次。

十毫克 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 在超声处理 10 分钟的帮助下，-OH 纳米颗粒分散在 4 mL 的二甲基甲酰胺 (DMF) 中。然后，在室温下剧烈搅拌 24 小时下加入 40 μl 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷 (APTES)。得到的 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ -NH2 纳米颗粒通过 10,000 rpm 离心 10 分钟收集并用 DMF 洗涤 3 次以去除未反应的 APTES。

细胞成像

Hek293T 细胞在含有 10% FBS 的 DMEM 中培养，并在 CO2 培养箱中接种于 35 毫米培养皿中 2 小时。得到的 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ -NH2 纳米颗粒分散在细胞培养基 (50 毫克/毫升) 中，用 254 纳米紫外灯激发 10 分钟，然后转移到处理了 1 小时的培养皿中。去除细胞培养基后，加入 0.1 mL 1% 甲醛-PBS，并将细胞用 0.5 mL DAPI 染料在黑暗中染色 10 分钟。最后用PBS洗涤细胞数次以进一步表征。

所有涉及动物的研究均获得大学动物护理和使用委员会的批准。

表征技术

使用镍过滤的 Cu Kα 辐射和 6.0° 2θ 的扫描速度，通过 XRD（模型 SmartLab；Rigaku，Tokyo，Japan）在 40 kV/40 mA 下进行相识别 /分钟。通过 TEM（型号 JEM-2000FX；JEOL，东京）观察产品的形态。荧光粉的光致发光用 FP-8600 荧光分光光度计（JASCO，东京）进行分析。使用Horiba JY FL3-21获得持续发光信号。余辉衰减图像是在暗室中使用柯达体内成像系统 FX Pro 记录的。细胞成像采用激光扫描共聚焦显微镜（LEICA TCS SP2，德国）。

所有涉及动物的研究均获得大学动物护理和使用委员会的批准。

结果与讨论

首先通过XRD研究样品的相纯度。图 1（上）显示了所制备的 ZGGO:Cr ³⁺ 的 XRD 谱 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 在 1000 °C 下煅烧，与尖晶石结构的 Zn3Ga2Ge2O10 一起被鉴定 [1, 9]。 Zn3Ga2Ge2O10的晶体结构与ZnGa2O4（JCPDS No.38-1240）相同，是ZnGa2O4和Zn2GeO4的固溶体。在Zn3Ga2Ge2O10的结构中，Ge起到取代Ga的作用，有利于陷阱的形成，而ZnGa2O4是占主导地位的晶体结构[1]。一个晶胞中有两种阳离子；锌 ²⁺ 和 Ga ³⁺ 被四个和六个氧阴离子包围，分别形成一个四面体和一个八面体（下图 1）。根据衍射数据计算得出 ZGGO:Cr ³⁺ 的电池常数 是 a =b =~ 0.8335 nm，接近尖晶石 ZnGa2O4 (a =b =~ 0.8335 nm，JCPDS No. 38-1240）。由于 Eu ³⁺ 的离子半径较大 （对于六重协调，\( {r}_{{\mathrm{Eu}}^{3+}} \) =0.0947 nm 和 \( {r}_{{\mathrm{Ga}}^{3+} } \) =0.062 nm) [25]，a 的较大值 =b =~ 0.8336 nm 观察到 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ .对于 ZGGO:Cr ³⁺ 的平均微晶尺寸为 83 ± 6 nm，通过应用 Scherrer 方程对 (311) 布拉格反射进行轮廓加宽分析 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 样品。在图 1（上）中，我们还发现在 900°C 下煅烧的产物是尖晶石相（JCPDS No. 38-1240）和菱形相（JCPDS No. 11-0687）的混合物，表明煅烧温度需要≥ 1000°C 才能得到纯相形式的尖晶石 Zn3Ga2Ge2O10。

所制备的ZGGO:Cr ³⁺ 的XRD图谱 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 和尖晶石ZnGa2O4的晶体结构

图 2（左）显示了 ZGGO:Cr ³⁺ 的 TEM 形貌 ,Eu ³⁺ 粒子，清楚地表明它们完全由立方粒子组成，横向尺寸为 ~ 80–100 nm。尖角和解析良好的晶格条纹表明它们具有出色的结晶度，而~ 0.29 nm 的间距与尖晶石结构的 ZnGa2O4 (d) 的 (220) 平面很好地对应 (220) =~ 0.29 nm，JCPDS No. 38-1240)（图 2 中的插图）。由于粒度接近根据 XRD 数据计算的平均微晶尺寸，因此获得的样品可能是单晶的。 SAED 分析（图 2（右））进一步证实了所分析的纳米颗粒是单晶的。这里研究的纳米粒子是直接的固态溶液，而不是机械混合物。 Zn、Ga、Ge、Cr 和 Eu 的元素映射提供了这种固溶体的证据，如图 3 所示 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ .每个粒子不仅含有Zn、Ga、Ge、Cr和Eu，而且所有元素均匀分布在粒子之间。

ZGGO:Cr ³⁺ 的 TEM、HR-TEM（左）和 SAED 图案（右） ,Eu ³⁺ 纳米粒子

ZGGO:Cr ³⁺ 的STEM粒子形态（明场图像，第一张图）和元素映射 ,Eu ³⁺ 纳米粒子

图 4 显示了 ZGGO:Cr ³⁺ 的激发光谱 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 室温下的粉末。在 697 nm 监测的激发光谱覆盖了非常宽的光谱区域（从 200 到 650 nm），由四个主要激发带组成，分别在 273、328、410 和 569 nm 处达到峰值。 273 nm 处的激发带归因于 O ²⁻ 的电荷转移带 -Ga ³⁺ 在 ZnGa2O4 主体中，而后面的带起源于 Cr ³⁺ 的内部跃迁 , 包括源自 ⁴ 的 328-nm 波段 A2 → ⁴ T1(te ² ) 跃迁，源自 ⁴ 的 410-nm 波段 A2 → ⁴ T1(t ² e )，以及源自 ⁴ 的 569-nm 波段 A2 → ⁴ T2(t ² e ) [19, 20]。加入 Eu ³⁺ 没有明显改变 PLE 带的位置，但显着增加了 Cr ³⁺ 的内部跃迁强度 , 与 I 410/我 273 从 0.18 增加到 0.56。上述结果表明 Eu ³⁺ 掺入有利于可见光激发。然而，273 nm 处的最强激发带也表明 O ²⁻ 的电荷转移带 -Ga ³⁺ 是最有效的激发波长。由于 ² ，粉末在 273 nm 处的激发在 697 nm 处产生了 NIR 发射带（图 5） E → ⁴ 畸变 Cr ³⁺ 中的 A2 跃迁 在没有 Eu ³⁺ 的情况下，镓锗酸盐中的离子 排放。

ZGGO:Cr ³⁺ 的光致发光激发（PLE）光谱 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 粉末

ZGGO:Cr ³⁺ 的光致发光(PL)光谱 ,Eu ³⁺ 粉末

ZGGO:Cr ³⁺ 的近红外持续发光衰减曲线 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 在室温下 254 nm 紫外光照射（氙灯作为光源）5 分钟后，在 697 nm 处监测纳米粒子，如图 6 所示。结果表明 ZGGO:Cr ^{3 的 NIR 持续发光+} 样品可以持续超过 7200 秒并且仍然保持可观的强度。 ZGGO的持续发光强度：Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 随着 Eu ³⁺ 的掺入而增加 离子。认为镧系离子与Cr ³⁺ 共掺杂 在镓锗酸锌中，由于其在增加反位缺陷数量方面具有重要作用，反位缺陷是导致 Cr ³⁺ 持续发光的重要原因。 在锌镓锗酸锌宿主中 [1]。另一方面，ZGGO的NIR持续发光：Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 样品寿命比ZGGO长：Cr ³⁺ , 表示 Eu ³⁺ 掺入可以增加余辉时间。图 7 显示了 ZGGO:Cr ³⁺ 的 NIR 余辉衰减图像 ,Eu ³⁺ 停止紫外线照射后，柯达 In-Vivo Imaging System FX Pro 在不同时间获得的粉末，进一步证实余辉可以持续超过 120 分钟，并保持强烈的 NIR 发射强度。

ZGGO:Cr ³⁺ 的近红外持续发光衰减曲线 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 在 254 nm 紫外光照射 5 分钟后在 697 nm 处监测粉末

ZGGO:Cr ³⁺ 的近红外余辉衰变图像 ,Eu ³⁺ 停止紫外线照射后，柯达 In-Vivo Imaging System FX Pro 在不同时间获得的粉末

对于评估荧光粉应用的性能，尤其是高功率应用，热稳定性是一个关键参数。为了评估这项工作中荧光粉的热猝灭行为，在 298 到 573 K 的温度范围内分析了 PL 光谱（图 8）。对于所有样品，升高温度会导致 697 nm 处的发射强度降低。为了更全面地了解热淬火行为并估计其活化能 (E a), Arrhenius 方程（方程（1））被采用如下[26,27,28]：

其中我 0 和 I T 分别是初始温度和最终温度的强度； c 是速率常数； E a 是活化能；和 k 是玻尔兹曼常数 (8.629 × 10 ⁻⁵ eV K ⁻¹ ）。图 8 显示了 In(I 0 / 我 T - 1) vs 10,000 / T ZGGO:Cr ³⁺ 发射带的关系线以 697 nm 为中心 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ .计算出类似的活化能：E 对于 ZGGO:Cr ³⁺ ，a =0.23 eV 和 E 对于 ZGGO，a =0.25 eV：Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ .每单位时间发生非辐射跃迁的概率 (α ) 可以根据等式定义。 (2)如下[29]：

其中 s 是频率因子 (s ⁻¹ ), k 是玻尔兹曼常数，T 是温度。可以看出，较低的活化能（E a) 导致更大的概率 (α ) 的非辐射跃迁。由于活化能相似，ZGGO:Cr ³⁺ 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 表现出闭合热稳定性，表明 Eu ³⁺ 掺入对热稳定性没有显着影响。然而，以 670 nm 为中心的相关声子边带 (PSB) 在较高温度下成为主导，从而导致发射峰增强。

a中发射带的热猝灭活化能 ZGGO:Cr ³⁺ 和 b ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 粉末。插图显示了 PL 光谱从 298 到 573 K

我们还研究了 ZGGO:Cr ³⁺ 水分散体的 PL 激发和发射光谱 ,Eu ³⁺ （图 9）。与 ZGGO 相比：Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 粉末，除了在 300 和 600 nm 处的激发强度相对较弱之外，水分散体表现出几乎相同的 PL 激发和发射曲线。强度减弱可能是由于水的O-H振动的淬灭作用所致。

ZGGO的激发和发射光谱：Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 室温下的水溶液。插图显示了ZGGO的数码照片：Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 254 nm紫外光照射下的水溶液

Hek293T 细胞在这里被用于体外成像测试。得到的 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ -NH2 纳米颗粒分散在细胞培养基 (50 毫克/毫升) 中，用 254 纳米紫外灯激发 10 分钟，然后转移到处理了 1 小时的培养皿中。图 10（左，红色）显示了在没有激发的情况下在激光扫描共聚焦显微镜上收集的细胞发光成像。 Hek293T 细胞的余辉发光信号仍然足够强，可以在 1 小时后进行精确测量，尽管余辉发光信号随着时间的推移逐渐降低。为了进行比较，在激光扫描共聚焦显微镜上通过另一种模式从用 0.5 mL DAPI 染料染色的相同细胞收集细胞发光成像（图 10 中的右侧，同时激发）。类似的成像信号表明 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ -NH2纳米粒子具有良好的体外细胞成像能力。

用 ZGGO:Cr ³⁺ 孵育的 Hek293T 细胞的 LSCM 图像（左，红色） ,Eu ³⁺ -NH2 纳米粒子 1 小时。右图（蓝色）是用 0.5 mL DAPI 染料染色的相同细胞的外观。比例尺 =25 μm

结论

在这项工作中，尖晶石结构的ZGGO：Cr ³⁺ 和 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 纳米颗粒是通过溶胶-凝胶法结合随后的无还原气氛煅烧合成的。通过 XRD、TEM、STEM、SAED、PLE/PL 光谱和温度相关 PL 分析的组合技术对样品进行详细表征。具有均匀立方体形状和~ 80-100 nm 横向尺寸的纳米颗粒是单晶和均匀固溶体。由于 ² ，粉末在 273 nm 处的激发在 697 nm 处产生了 NIR 发射带 E → ⁴ 畸变 Cr ³⁺ 中的 A2 跃迁 在没有 Eu ³⁺ 的情况下，镓锗酸盐中的离子 排放。 ZGGO的近红外持续发光：Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ 可以持续超过 7200 秒，并且仍然保持强烈的强度。 ZGGO的持续发光强度：Cr ³⁺ 余辉时间随着Eu ³⁺ 的掺入而增加 离子。然而，Eu ³⁺ 掺入对热稳定性没有显着影响。最后，获得的 ZGGO:Cr ³⁺ ,Eu ³⁺ -NH2纳米粒子具有良好的体外细胞成像能力。