氧化锌/多孔阳极氧化铝复合膜的制备和抗菌膜特性

背景

众所周知，细菌可以粘附在固体表面并在适当的环境中形成光滑的生物膜[1]。通常，细菌生物膜牢固地粘附在材料表面，例如不锈钢 [2]、橡胶 [3]、玻璃 [4] 和聚苯乙烯 [5]。生物膜会导致设备腐蚀[6]和食品污染[7]，造成巨大的经济损失。许多研究表明，生物膜粘附受材料表面特性的影响，如粗糙度 [8,9,10,11]、微观结构 [12, 13]、亲水性 [14,15,16,17] 和抗生素成分[18,19,20]。 Bohinc 等人。 [10]指出细菌粘附会随着玻璃表面粗糙度的增加而增加。辛格等人。 [12]证明高表面粗糙度可以提高蛋白质吸附并加速细菌粘附和生物膜形成。邦萨利亚等人。发现单核细胞增生李斯特菌 粘附在亲水表面（例如不锈钢和玻璃）上比粘附在疏水表面（例如聚苯乙烯）上更好 [14]。其他研究也证明疏水表面不利于生物膜粘附[16, 17]。一些研究表明，抗生素成分可以抑制生物膜的形成 [18,19,20]。三百四不锈钢表面具有很好的抗菌和抗生物膜特性，利用了铜元素的抗菌活性[18]。总之，表面性质对材料的抗生物膜性能至关重要。

铝材料得到了广泛的应用，近年来多孔阳极氧化铝（PAA）在光电功能、催化功能和传感功能等领域受到越来越多的关注[21,22,23,24]，其抗菌活性越来越受到关注。报道。费拉兹等人。 [24] 报道说，PAA 可以诱导单核细胞/巨噬细胞的粘附活化，因为它们的基质相和纳米孔隙率。

此外，氧化锌 (ZnO) 薄膜已被研究为抗菌和抗真菌的优良材料。 铜绿假单胞菌的粘附 对具有纳米棒表面结构的 ZnO 薄膜的影响弱于玻璃和溅射的 ZnO，而更多的 P。绿脓 在 ZnO 薄膜中被杀死 [25]。同时，一项研究指出，ZnO 涂层的表面显着限制了生物膜的形成，羟基自由基的产生在抗生物膜活性中起关键作用，但锌离子的存在不重要 [26]。此外，ZnO 复合膜可用于许多领域以限制生物膜的形成，并将在水产品保鲜中具有良好的应用前景 [27]。 ZnO 是亲水性的，而疏水性薄膜则擅长抑制生物膜的粘附。因此，有必要提高ZnO薄膜的疏水性能。

由于微生物腐败，水产品非常容易腐烂 [28]。在有氧储存条件下，假单胞菌 属和腐败希瓦氏菌 被称为优势腐败生物 [29]。 腐败希瓦氏菌 具有嗜冷性质，可还原三甲胺-N -氧化物转化为三甲胺 [30]。所以，腐败希瓦氏菌 将作为本文的指示菌。

ZnO 薄膜的微观结构会因它们的 PAA 基而不同，从而影响抗生物膜性能。在这项工作中，在具有不同形态的 PAA 上制备了 ZnO 薄膜，并对其进行了改性以提高疏水性。 腐败希瓦氏菌的抗生物膜特性 研究了 ZnO/PAA 复合薄膜的性能。研究结果为在食品包装、食品加工设备等抗菌功能材料领域的应用提供了潜在价值。

材料和方法

材料

本研究所用试剂均为分析纯。去离子无菌水用于制备电导率低于 0.5 mS/cm 的溶液。 腐败希瓦氏菌 ATCC8071 购自美国典型培养物保藏中心。 0.3mm厚、铝纯度99.99%以上的铝箔购自盛世达金属材料有限公司（中国）。

ZnO/PAA 复合薄膜的制备

多孔阳极氧化铝 (PAA) 薄膜的制备

将高纯铝箔切成10 × 30 mm ² 的小尺寸 并通过抛光机（WV80，Positec Machinery Co., Ltd., China）用 50 nm 二氧化硅抛光膏抛光，并在丙酮中以 53 kHz、280 W 超声脱脂 15 分钟（SK8210HP，Kudos Ultrasonic Instruments Co. Ltd. 。， 上海）。然后，分别用乙醇和水洗涤箔两次。以预处理过的铝箔为阳极，等面积石墨片为阴极，0.3 mol/L的草酸溶液为电解液。第一次阳极氧化是在 30 °C 和 40 V 的条件下进行 90 分钟。之后，将铝板浸入 6.0 重量％ H3PO4 和 1.8 重量％ H2CrO4 的混合溶液中，在 60°C 下浸泡 4 小时以去除氧化铝层。然后在相同条件下进行第二次阳极氧化，但分别进行 0、40、60 和 80 分钟。获得了具有不同端口模型的多孔阳极氧化铝（PAA）薄膜。

ZnO/PAA 复合薄膜的制备

首先将等体积的 0.02 mol/L 醋酸锌乙醇溶液和 0​​.04 mol/L NaOH 乙醇溶液在 70°C 快速搅拌下混合 5 分钟，然后将 PAA 薄膜（铝箔）浸入混合溶液中在- 0.085 MPa的真空度下。之后，将溶液加热至沸腾。变成稀薄的蓝色溶胶后，取出铝箔，用去离子水冲洗。然后，将样品在- 0.085 MPa、80℃下真空干燥6小时，在空气气氛中在480℃下煅烧2小时后制备ZnO/PAA复合膜。同时制备氧化锌粉末。最后，ZnO/PAA 复合膜和粉末在 65°C 下用 1.0 wt% Si69 乙醇溶液改性 2 小时，然后在 - 0.085 MPa、40°C 下真空干燥 12 小时。

ZnO/PAA 复合薄膜的表征

使用 X 射线粉末衍射仪（Rigaku Ultima IV，Rigaku，Japan）以 0.02°和 2θ 的步长对氧化锌粉末进行 X 射线衍射 10°–80° 范围内，CuKa 辐射为 40 kV，50 mA。通过热重/差热分析仪（TG/DTA，Perkin Elmer Diamond）分析样品的热变化和失重。使用 Scimitar 2000 Near FT-IR Spectrometer (Agilent, American) 在 4000–400 cm ^-1 范围内记录傅里叶变换红外 (FT-IR) 光谱 . PAA 薄膜和 ZnO/PAA 复合薄膜的表面显微照片通过场发射扫描电子显微镜 (FESEM, S-4800, Hitachi, Japan) 成像。通过场发射透射电子显微镜（FETEM，Jem-2100F，JEOL，日本）和选区电子衍射（SAED，Jem-2100F，EOL，日本）测量从 ZnO/PAA 复合薄膜上刮下的纳米颗粒形态。样品进行了检查。复合膜（改性前/改性后）的水接触角 (CA) 使用 3.0 μL 去离子水液滴（SL200B，美国）在每个样品表面的几个不同位置通过静滴法测量。

ZnO/PAA 复合膜的抗菌膜特性

培养腐败希瓦氏菌 生物膜

二次激活腐败希瓦氏菌的菌悬液 (OD595 ≈ 0.5) 和 3% (m/v) NaCl 的碱性蛋白胨水 (APW) 以 1:200 (v /v ）。将 ZnO/PAA 复合膜（0.5 × 0.5 cm）浸入 3 mL 稀释的接种物中，并在 28°C 下孵育一定时间。在这种情况下，腐败希瓦氏菌 生长良好，增殖能力强。

腐败希瓦氏菌的附着力测定 ZnO/PAA 复合膜上的生物膜

腐败希瓦氏菌菌悬液培养后 一段时间后，将带有生物膜的 ZnO/PAA 复合膜转移到另一个无菌离心管中，用 1 mL 0.85% (m/v) 无菌 NaCl 溶液洗涤 3 次以去除游离细菌。生物膜用 1 mL 0.2%w/w 染色 结晶紫在室温下放置 15 分钟，然后用 1 mL 0.85% (m/v) 无菌 NaCl 溶液洗涤 3 次以去除多余的结晶紫。然后，将染色的生物膜以 33% (v /v ) 200 μL 乙酸，53 kHz，280 W 10 分钟。通过 VICTOR™ X3 酶标仪（Perkin Elmer，美国）在 96 孔微量滴定板中记录上述溶液的 OD595（595 nm 处的光密度）。结果以三次平行实验的“平均值 ± 标准差”表示。

腐败希瓦氏菌的细菌总数测定 ZnO/PAA 复合膜上的生物膜

将带有生物膜的 ZnO/PAA 复合膜用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4；137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4 和 1.8 mmol/L KH2PO4）洗涤 3 次至去除漂浮的细菌，然后在 10 mL 无菌 PBS 中以 53 KHz、280 W 超声剥离染色的生物膜 10 分钟。随后，通过平板计数法测量生物膜中的细菌总数。三次平行实验，结果以“平均值 ± 标准差”表示，绘制生物膜细菌菌落生长曲线。

腐败希瓦氏菌的显微照片测量 生物膜

去除漂浮的细菌后，将带有生物膜的 ZnO/PAA 复合膜浸入 2.5% (w /v ) 戊二醛在 4°C 下保持 4 小时。随后，样品每 30 分钟脱水一次，浓度为 50、70、80 和 90% (v /v ) 乙醇，分别。在无水乙醇中浸泡 1 小时后，样品在洁净的工作台上自然风干。样品表面显微照片由FESEM（S-4800，Hitachi，Japan）在3 kV下溅射镀金40 s后成像。

腐败希瓦氏菌的 CLSM 测量 生物膜

将带有生物膜的ZnO/PAA复合膜用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH =7.4）洗涤3次以去除漂浮的细菌，样品在0.01wt%的混合溶液中避光染色15分钟吖啶橙（AO，Sigma，美国）和 0.1wt% 碘化丙啶（PI，Sigma，美国）。之后，样品用PBS洗涤3次以去除多余的染色溶液，去除过多的水分。将 10 微升抗荧光淬灭封闭剂（Biosharp BL701A，中国）滴在生物膜上，并将样品在 4°C 下避光保存。用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM，TCS-SP5 II，德国徕卡仪器有限公司）观察生物膜活细胞和死细胞的比例[31, 32]。

结果与讨论

氧化锌薄膜的表征

溶胶-凝胶法制备的 ZnO 粉末的 XRD 表征

氧化锌的抗菌和抗生物膜特性受其晶体结构的影响 [33, 34]。图 1 显示样品的晶体结构在煅烧后发生转变。在煅烧之前，样品包含在 ZnO 的六方纤锌矿结构中。 2θ在31.70°、34.52°、36.31°、47.68°、56.82°、62.92°和67.92°处的衍射峰 对应于氧化锌的 (100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103) 和 (112) 晶面 (PDF # 36-1451, a =b =3.250 和 c =5.207)，分别。宽的衍射峰表明低结晶度和小颗粒的 ZnO。同时，杂质较少的峰揭示了样品中的中间体。在 230°C 煅烧后，杂质峰消失，测得的噪声降低，但衍射峰的宽度不变。这意味着中间体消失，结晶度增加。随着煅烧温度的升高，ZnO的衍射峰变尖，表明结晶度增加，晶粒长大。

不同温度煅烧氧化锌粉体的XRD图

Zn(CH3COO)2的乙醇溶液中仅生成Zn(CH3COO)2·2H2O的结合水，CH3COO ⁻ 水解 被抑制。首先水解Zn(CH3COO)2，得到中间产物。

4Zn(CH3COO)2·2H2O → Zn4O(CH3COO)6 + 2CH3COOH + 3H2O(1)

在加热过程中，NaOH的乙醇溶液和CH3COO ⁻ 的空间位阻效应促进了collosol ZnO胶溶胶的稳定性非常重要。同时，CH3COOH与NaOH发生中性反应。

5Zn4O(CH3COO)6 + 22NaOH + 13H2O → 4Zn5(OH)8(CH3COO)2·2H2O + 22CH3COONa(2)

CH3COOH + NaOH→CH3COONa + H2O(3)

Spanhel 和 Anderson [35] 指出氧化锌醇凝胶是由氧化锌颗粒通过聚集和奥斯特瓦尔德生长（老化）形成的。然后，中间体 Zn5(OH)8(CH3COO)2·2H2O 被加热分解成 ZnO 相 [36, 37]。因此，ZnO的六方纤锌矿结构是煅烧前干燥明胶的基础。

Zn5(OH)8(CH3COO)2·2H2O → 5ZnO + 2CH3COOH + 5H2O(4)

细野等人。 [37] 已经证实了这种反应机制。 Zn(CH3COO)2·2H2O 的乙醇溶液在 60°C 加热时变成胶体产物，XRD 结果表明明胶的干燥产物是结晶 ZnO 和 Zn5(OH)8(CH3COO)2·2H2O 的混合物。回流48小时后，颗粒转变为纤锌矿ZnO。

TG/DTA 分析

氧化锌明胶的TG/DTA结果如图2所示，TG曲线可分为三个阶段。在第一阶段，从室温到 100°C 的质量损失为 68.6%，在 62°C 处存在吸热峰。它对应于氧化锌明胶中失去的乙醇溶剂和水。在第二阶段，从 100 到 400°C，质量损失仅为 3.8%。 XRD 结果表明，分别在 230、280 和 360°C 煅烧后，杂质消失，结晶度增加，晶粒生长。少量的质量损失可能是孔隙水的损失和杂质的转变。从 400 到 850°C，没有质量损失和吸热峰，表明在此阶段没有晶体转变。同时，XRD 结果显示晶体在 480°C 下煅烧后生长。 TG/DTA结果与XRD结果一致。

氧化锌明胶的TG/DTA图

未改性/改性氧化锌薄膜的 FT-IR 表征

图 3 显示了未改性和疏水改性 ZnO 薄膜的 FT-IR 光谱。 3600–3300 cm ⁻¹ 处的宽峰 归因于 -OH 的伸缩振动，在 1651 cm ^-1 处出现峰值 分别归因于 –OH 的弯曲振动，表明样品中吸收了水和毛细管水 [38]。 2360 和 2328 cm ⁻¹ 处的峰值 归因于空气中的二氧化碳。 2943 和 2864 cm ⁻¹ 处的峰值 分别是由于 -CH2 的不对称和对称伸缩振动。 1475 cm ⁻¹ 处的更强峰 归因于-CH2 基团的面内弯曲振动或剪切振动[39]，峰值位于 895 cm ^-1 归因于 Si-O 基团的伸缩振动 [40]。大约 440 和 414 cm ^-1 处的峰值 归因于未改性/改性 ZnO 的 Zn-O 基团的骨架振动 [41]。结果表明，改性使Si69的-S-S-键断裂，三乙氧基甲硅烷基丙基接枝在样品上，因此ZnO薄膜的疏水性能增加。 Wang [42] 报道了通过化学反应对Si69 和接枝在纳米ZnO 颗粒表面的Si69 进行原位改性，可以改善纳米ZnO 的分散性。这与我们的分析结果一致。

未改性/改性氧化锌薄膜的红外光谱

PAA 薄膜的微观形貌分析

PAA 薄膜的形貌受第二次阳极氧化时间的影响。如图 4 所示，在去除第一次阳极氧化的氧化铝层后，PAA 膜是一个带有 5-10 nm 纳米孔的串联六角蜂窝框架（图 4a）。两步阳极氧化 40 分钟后，纳米孔转化为多层壳框架（图 4b）。两步阳极氧化 60 分钟后，多层壳框架逐渐消失，纳米孔的直径扩大到 20-40 nm，同时表面有脊（图 4c）。将两步阳极氧化时间延长至 80 分钟，纳米孔扩大至 60-70 纳米，脊消失（图 4d）。

不同二次阳极氧化时间a的多孔阳极氧化铝(PAA)的SEM图 0 分钟，b 40 分钟，c 60 分钟和 d 80 分钟

根据酸性场辅助溶解（AFAD）理论[43]，在阳极氧化过程中，阻挡层的氧化膜变得不均匀，并形成脊。在这些点上，加重的AFAD促进了微孔的形成和发展。随着第二次阳极氧化时间的延长，表面逐渐形成有序的通孔，然后多层壳框和脊消失（图4b-d）。结果与 Reddy's 相似，后者在 0.3 mol/L 草酸中通过两步阳极氧化工艺制备 PAA [44]。

氧化锌薄膜的微观形貌分析

材料表面的抗生物膜特性受其形态和物质的影响 [12]。如图 5 所示，在第二次阳极氧化时间不同的情况下，在 PAA 薄膜上制备的 ZnO 薄膜的形貌有显着差异。在具有 5-10 nm 纳米孔的 PAA 膜表面上，20-30 nm 的团聚大颗粒密集附着并形成厚的 ZnO 膜（图 5a）。在通过两步阳极氧化持续 40 分钟制备的 PAA 膜表面上，多层壳框架保留在 ZnO 膜上（图 5b）。如图 5c 所示，ZnO 颗粒已附着在 PAA 膜的骨架上并形成较大的孔。在具有 60-70 nm 纳米孔的样品上，10-20 nm 的 ZnO 颗粒附着在 PAA 孔的边缘，部分颗粒进入纳米孔（图 5d）。这可能是胶溶胶在真空条件下进入较大的孔，然后形成 ZnO 颗粒。以上结果表明，PAA的纳米孔径越小，ZnO的粘附率越高。吴等人。 [45]认为由于溶胶粒子的负性和PAA孔壁的正性，在孔壁上容易形成溶胶粒子。该发现也与 Bousslama 等人的研究一致。 [46]。 PAA薄膜在锌溶胶中浸泡24h后，溶胶仅附着在孔壁上，然后48h孔内充满，说明溶胶颗粒优先附着在孔壁上。

不同时间两步阳极氧化时间在PAA上制备的ZnO薄膜的SEM图像a 0 分钟，b 40 分钟，c 60 分钟和 d 80 分钟

上述结果表明，在真空条件下，胶体颗粒容易进入大孔并附着在内表面；然而，胶溶胶颗粒仅附着在具有小孔的PAA外表面的骨架上。

从 ZnO/PAA 复合薄膜上刮下的 ZnO 薄膜的 TEM 图像如图 6 所示。在仅通过一步阳极氧化制备的 PAA 表面上，分层的 ZnO 颗粒约为 10 nm，但颗粒为 20-30 nm 显示在 SEM 图像中（图 5a），表明 ZnO 颗粒团聚。在通过两步阳极氧化制备的 PAA 表面上，分层的 ZnO 颗粒约为 20 nm，部分颗粒在各个位置发生团聚。这表明ZnO颗粒首先附着在PAA孔的边缘（图6c，e，f）。

TEM 图像 (a , c , e , f ) 和 SAED 模式 (b , d )不同两步阳极氧化时间在PAA上制备的ZnO薄膜a , b 0 分钟 c , d 40 分钟； e 60 分钟；和 f 80 分钟

六方纤锌矿结构 ZnO 的晶面 (100)、(101)、(102)、(110) 和 (103) 以 SAED 图案显示（图 6b、d），表明 ZnO 是六方纤锌矿。结果与XRD分析一致。

ZnO 薄膜表面的疏水性-亲水性表征

为减少材料的细菌粘附，对制备的不同微观形貌的ZnO薄膜进行处理以提高疏水性，改性前后薄膜表面的水接触角见表1。

在改性之前，由于 ZnO 颗粒上的表面羟基，ZnO 薄膜是亲水的。亲水性最好，因为它的多孔结构是在 PAA 表面制备的，两步阳极氧化持续时间为 40 分钟。对于其他两步阳极氧化持续时间为 60 和 80 分钟的样品，由于 ZnO 的粘附量较低，亲水性逐渐降低。对于一步阳极氧化时间的样品，低亲水性是由于其无孔结构。

改性后，ZnO 薄膜转化为疏水性。根据 FT-IR 分析，在 Si69 的 –S–S– 键断裂后，三乙氧基甲硅烷基丙基接枝在样品上。同时，这可能是由于其多孔结构和更多的 ZnO 颗粒；该薄膜具有最高的疏水性，两步阳极氧化持续时间为 40 分钟。

腐败希瓦氏菌的特征 生物膜

Chi 等人[47] 报道阳极氧化铝对革兰氏阴性菌（大肠杆菌 和P。绿脓 ）和革兰氏阳性菌（粪链球菌 和金黄色葡萄球菌 ）。然而，ZnO 具有优异的抗菌和抗生物膜活性 [25,26,27]，并且抗菌和抗生物膜活性之间存在正相关关系 [48, 49]。此外，ZnO 的抗菌性能受其微观结构的影响 [50, 51]。为了获得优异的抗生物膜活性表面，在PAA薄膜上制备了不同微观结构的ZnO薄膜，采用不同的二次阳极氧化时间，并测定了其抗生物膜性能。

生物膜的粘附性和生物膜细菌的生长曲线

细菌生物膜的形成和发展可分为五个阶段：细菌最初可逆地粘附在表面；从可逆粘合到不可逆粘合的转化；生物膜的初始形成；成熟生物膜的发展；生物膜退化，细菌恢复到浮游状态[52]。

如图 7(1) 所示，在 2 小时内，Shewanella putrefaciens 的粘附 ZnO 薄膜上的生物膜迅速增加，说明细菌从可逆粘附转变为不可逆粘附。 2~12 h，生物膜的附着力逐渐增强，为生物膜的生长阶段。 12~24 h，生物膜的粘附性略有增加或下降，表现为生物膜的成熟阶段。 24 h 后，生物膜的附着力下降，生物膜进入退化阶段。图7(2)表明生物膜细菌的变化趋势与生物膜的粘附性一致，表明生物膜的发育依赖于生物膜细菌。

腐败希瓦氏菌的粘附 生物膜 (1 ) 和生物膜细菌的菌落生长曲线 (2 ) 在不同时间的两步阳极氧化持续时间 (a) 0 分钟、(b) 40 分钟、(c) 60 分钟和 (d) 80 分钟下在 PAA 上制备的 ZnO 薄膜

此外，对于在 PAA 表面制备的 ZnO 膜，两步阳极氧化持续时间为 80 分钟，生物膜的附着力和生物膜细菌的总量在四个样品中都是最高的。然而，对于在 PAA 表面制备的 ZnO 膜，两步阳极氧化持续时间为 40 分钟，其抗生物膜性能是最佳的。这可能是因为生物膜粘附受到最高疏水性的抑制，然后较少的胞外多糖 (EPS) 和其他营养物质会抑制生物膜细菌的生长。两步阳极氧化时间为80分钟在PAA表面制备的ZnO薄膜，其亲水性有利于生物膜的初始粘附，较少的ZnO颗粒不会抑制生物膜细菌的生长。同时，更多的生物膜粘附材料滋养生物膜细菌，生物膜细菌繁殖迅速。与我们的研究一致，在生物膜形成的初始阶段，ZnO 膜的较高疏水性抑制了生物膜的粘附[49]。生物膜的粘附受材料的疏水性和亲水性影响 [14, 53, 54]。邦萨利亚等人。 [14] 报道 L.单核细胞增生症 与疏水表面相比，更容易粘附在亲水表面上。许多研究发现疏水表面减少或抑制细菌粘附[47, 54]。沙尔等人。 [54] 表明疏水性聚阳离子可以防止功能化骨科硬件上的生物膜定植。陈等人。 [55] 还提出生物膜可以被低表面自由能抑制。结果与我们的结果相符。

The Morphological Characteristics of Shewanella putrefaciens Biofilm

The microtopographies of Shewanella putrefaciens biofilm at various stages are shown in Fig. 8.

SEM images of the biofilms on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

After cultivated for 2 h, there are less adhesive materials on the ZnO film prepared on PAA without two-step anodization (a) and with two-step anodization duration for 40 min (b), but more adhesive materials and a few bacteria on the other two (c, d). It is indicated that the anti-adhesive properties of the former two are better than the latter two, it is consistent with Fig. 7. After cultivated for 12 h, more and more EPS and bacteria are attached to ZnO films, signifying the rapid growth of the biofilm. At 24 h, the EPS films are thickened gradually and biofilm bacteria grew well, indicating mature biofilms. At 36 h, the deciduous EPS films and dead bacteria illustrate the biofilm degenerating stage.

According to the antibacterial mechanisms of dissolved metallic ions, the dissolved zinc ions are combined with active proteinase of bacteria, make proteinase lose its bioactivity, and damage its bacterial cells to death [34, 56]. Thus, the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to the latter two (c, d) due to their plentiful ZnO particles on the films. Xie [57] and Jones [58] also thought that the antibacterial abilities strengthened with the dosage increasing of ZnO particles. Meanwhile, the adhesive materials and bacteria on the sample (d) are all more than the others, according to the analysis of adhesion of Shewanella putrefaciens biofilm and colony growth curve of the biofilm bacteria (Fig. 7). Feng et al. [59] found that the hypha of Escherichia coli easily reached into the PAA pores with diameters of 50 and 100 nm, and the biofilm accumulated and adhered to the surface of PAA. However, there is no hypha of Shewanella putrefaciens could be observed in our study. It can be inferred that the optimal antibiofilm properties are ascribed to the lower hydrophobicity of ZnO film in the initial stage of the biofilm formation.

The CLSM Characteristics of the ZnO/PAA Composite Biofilms

As shown in CLSM images, the live Shewanella putrefaciens bacteria are green, and the dead ones are red (Fig. 9). The black images indicate that the counts of live bacteria on the surfaces are few after biofilm cultivation for 2 h. Biofilm bacteria multiply rapidly, and the counts of live bacteria are significantly increased with the cultivation time. More dead bacteria are observed in the former two (a, b) at 24 h and in all samples at 36 h. The counts of dead bacteria of the latter two (c, d) are less than that of the former two (a, b). The results indicate that the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to that of the latter two (c, d), which is according to the previous analysis.

CLSM images biofilms formed on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

Conclusions

In this work, the PAA films with different microstructures were prepared by two-step anodic oxidation first, and then the ZnO/PAA composite films are prepared by sol-gel. The ZnO films are hydrophilic due to the surface hydroxyl group on the ZnO particles. After being modified by Si69, the ZnO films translate to hydrophobicity because of its hydrophobic group. The antibiofilm properties of the ZnO films are affected by the hydrophobicity and amount of ZnO particles. The hydrophobicity inhibits the initial adherence of the biofilm and less EPS and the other nutrient against the growth of biofilm bacteria. So, the antibiofilm properties of the ZnO/PAA film are optimal which are prepared on the PAA surface with two-step anodization duration for 40 min because of its super-hydrophobicity and plenty of ZnO particles.

缩写

AO:

Acridine orange

CA:

Water contact angle

EPS:

Exopolysaccharides

FT-IR：

Fourier transform infrared spectrometer

PAA:

Porous anodic alumina

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

PI:

Propidium iodide

SAED：

选区电子衍射

SEM：

扫描电镜

TEM：

透射电子显微镜

TG/DTA:

Thermogravimetric/differential thermal analyze

XRD：

X-ray diffusion