基于荧光半导体纳米粒子编码的聚电解质微胶囊的生物成像工具：荧光特性的设计和表征

介绍

在生物成像和治疗诊断试剂设计领域，开发用作靶向递送药物、蛋白质和核酸分子的载体的荧光聚合物微米和纳米粒子是特别重要的 [1,2,3]。量子点 (QD) 是 2 到 10 纳米的半导体胶体晶体，其荧光峰值波长取决于其物理尺寸。宽吸收光谱和窄、对称荧光光谱（其位置取决于纳米颗粒大小）允许使用单个辐射源在一组具有不同荧光带的 QD 中激发荧光，可用于多重检测。因此，量子点是非常有吸引力和有前途的用于诊断和成像的先进荧光团[4]。

使用聚电解质微胶囊作为各种功能成分的载体，可以开发出对各种物理（超声波、磁场、激光或光辐射）或化学（pH、微环境离子强度和溶剂极性）响应的系统刺激 [5, 6]。聚电解质微胶囊是通过将带相反电荷的聚合物聚电解质逐层沉积到球形基质上而获得的。随后基质溶解产生中空结构，其稳定的聚合物膜由聚电解质的互聚物复合物组成 [7,8,9]。聚电解质的逐层吸附技术允许将各种功能成分，包括磁性、金属（金或银）或荧光（例如 QD）纳米粒子结合到聚合物膜中，并控制膜的厚度形成时 [10, 11]。

荧光标记的微胶囊是很有前途的生物成像剂，可用于监测它们的体外和体内转运和递送 [12, 13]。在可用的微胶囊荧光标记（光学编码）方法中，聚合物与荧光标记共轭或物理混合 [14, 15]。决定微胶囊光学性质的荧光成分也可以通过在基质微粒（例如碳酸钙微球粒）制备过程中用荧光染料标记的聚合物的共沉淀结合到它们内部 [16]。它们也可以在去除基质后进行封装；为此，通过增加微环境的离子强度或 pH 值来确保低分子量和高分子量化合物通过聚合物膜的扩散。然而，具有荧光纳米晶体的聚电解质微胶囊的光学编码由于其独特的光学性质和生物成像的有效性而更有前景[17]。

通过将 QD 掺入聚电解质微胶囊的聚合物膜中进行编码的已知方法使用用低分子量配体（例如巯基乙酸或半胱氨酸）水溶性的 QD [18, 19]。本研究的目的是开发高度稳定的荧光聚电解质微胶囊，该微胶囊由水溶性 CdSe/ZnS（核/壳）量子点光学编码，其表面用含有羧基端基的聚乙二醇 (PEG) 的硫醇衍生物进行额外修饰，并估计所得荧光微胶囊的荧光和结构特征。

方法

研究的目的、设计和设置

QD 编码聚电解质微胶囊的制造

由 P. Samokhvalov 博士在 NRNU MEPhI（莫斯科，俄罗斯）纳米生物工程实验室合成的 CdSe/ZnS（核/壳）量子点在 590 nm 处具有最大荧光，并涂有三辛基氧化膦 (TOPO)。如前所述进行 QD 纯化和增溶 [20, 21]。通过将 QD 溶解在氯仿中，然后用甲醇沉淀它们，从 QD 表面去除 TOPO；该程序重复三遍。之后，将量子点再次溶解在氯仿中，并用半胱氨酸的甲醇溶液以量子点与半胱氨酸的质量比为 1:0.13 进行沉淀。 QD沉淀用甲醇洗掉过量的半胱氨酸并在真空浓缩器中干燥。将干燥的 QD 重新悬浮在添加 0.1 M 氢氧化钠的水中。然后，使用超声波浴对分散体进行超声处理并过滤（孔径，0.22 μm）。向所得分散液中以1:4.6的质量比添加含有末端羧基的PEG的硫醇衍生物。将混合物在 4°C 下孵育过夜，并使用凝胶过滤色谱纯化聚乙二醇化 QD。 获得的样品的 QD 含量在第一激子的波长下通过分光光度法测定。使用动态光散射和激光多普勒微电泳通过 Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK) 对溶解的 QD 进行流体动力学直径和 ζ 电位表征。

量子点编码是使用一种改进的技术，即在如前所述获得的碳酸钙微粒表面上逐层沉积带相反电荷的聚阳离子和聚阴离子聚合物，以及用 PEG 的羧化硫醇衍生物功能化的水溶性量子点进行的。 [22]。聚合物聚电解质层由聚阳离子聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH)和聚阴离子聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)或聚丙烯酸(PAA)形成；荧光团是水溶性聚乙二醇化的 CdSe/ZnS QD，在 590 nm 波长处具有荧光峰，ζ 电位为 -26.7 ± 0.8 mV，流体动力学直径为 18.7 至 23.3 nm。在QD编码的微胶囊过程中，每层沉积后的制造过程中使用激光多普勒微电泳控制微粒表面电荷（ζ电位）。

将碳酸钙微粒重新悬浮在超纯水中，并加入 0.5 mL 2 mg/mL PAH 的 0.5 M NaCl 溶液。在超声浴中对悬浮液进行超声处理，并在室温下搅拌的同时孵育 20 分钟。之后，通过离心洗掉多余的聚合物，然后再悬浮在 MilliQ 水中。为了施加由聚合物聚阴离子组成的下一层，将微珠重新悬浮在 0.5 mL 超纯水中，并将悬浮液与 0.5 mL 2 mg/mL PSS 溶液在 0.5 M NaCl 中混合，在超声浴中超声处理60 秒，在室温下搅拌的同时孵育 20 分钟，并如上所述洗掉多余的聚合物。在聚电解质施加的每个阶段之后微粒的洗涤重复3次。在编码之前，将五个聚电解质层施加到碳酸钙微粒上，第五层由聚阳离子组成。之后，加入溶解的量子点，并在永久搅拌的同时孵育混合物 80 分钟。然后，施加六个连续的带相反电荷的聚合物层，第六层由聚阴离子 PSS 或 PAA 组成。通过用 0.2 M 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA) (pH 6.5) 洗涤所得到的带壳微珠的碳酸钙核来溶解它们，从而获得用 QD 编码的中空聚电解质微胶囊。之后，通过将微粒分散在含有 1% BSA 的 50 mM 磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）中，然后在 4°C 下孵育，用牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma-Aldrich，美国）额外修饰微胶囊表面在黑暗中保持 12 小时。在使用前不久，用 50 mM 磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.4) 将中空微胶囊的悬浮液从过量的 BSA 中洗涤五次。所得聚电解质微胶囊4℃避光保存。

QD 编码聚电解质微胶囊的光学和荧光显微镜

使用光学和荧光显微镜分析微粒的形态和尺寸分布。为了估计微粒的尺寸分布，我们将 5 μL 的微粒悬浮液固定在载玻片上的 10 μL 50% 甘油中。在光场中通过具有 LD A-Plan 40x/0.55 M27 透镜的 Axio Observer 3 显微镜（Carl Zeiss，德国）检查样品。使用带有 XF115-2 FITC 长通滤光片组的 HBO 100 汞照明器（Burner Mercury）获得荧光图像，包括 505DRLP 二向色滤光片、475AF40 激发滤光片和 510ALP 发射滤光片（Omega Optical，美国），EC Plan -Neofluar 100x/1.30 Oil Iris M27镜头（WD =0.20 mm），数值孔径可调0.7至1.3，Immersol 518F浸油（德国卡尔蔡司）。

在具有固定在环氧树脂包埋介质中的无 BSA 表面的光学编码聚电解质微胶囊的切片中研究了获得的微胶囊的形态特征。为此，微胶囊悬浮液依次用 30%、50%、70% 和 95% 的乙醇水溶液脱水，然后用无水乙醇（Acros Organics，美国）处理 3 次以确保完全脱水。每个脱水阶段持续 15 分钟。将脱水的微胶囊样品转移到 1:1 环氧-乙醇混合物中 12 小时，然后转移到 3:1 环氧-乙醇混合物中 3 小时。然后，将样品转移到干净的嵌入环氧树脂介质中，环氧树脂块在 45°C 下聚合 12 小时，在 60°C 下聚合 72 小时。然后，通过配备 2.0 毫米宽的 Ultra AFM 35 金刚石刀（Diatome，瑞士）的 Leica EM UC6 超薄切片机（Leica Microsystems，奥地利）从这些含有荧光 QD 编码聚电解质微胶囊的块上切下 150 nm 切片。将切片转移到载玻片上并在 Axio Vert.A1 荧光显微镜（Carl Zeiss，德国）下检查，使用 HBO 100 汞照明器（Burner Mercury）进行激发和 45 HQ TexasRed 荧光滤光片组（d我> =25 自由位移 (E)、560/40 激发 BP、FT 585 分束器和 630/75 发射 BP)（Carl Zeiss，德国），用于记录荧光。使用 Carl Zeiss EC Plan-Neofluar100x/1.30 Oil Ph3 透镜和 Immersol 518F 浸油（Carl Zeiss，德国）获得荧光图像。使用Zen（Carl Zeiss，德国）和Image J 1.48 v（美国）软件对图像进行分析和处理。

QD 编码微胶囊的荧光特性

使用 Infinite 200 PRO 多模式读板器（TECAN，瑞士）分析用于编码的原始 QD 和 QD 编码微胶囊的荧光特性。在测量之前，使用带有 А-2-DWP 转子的 5810 R 离心机（Eppendorf，美国）以 2630×g 离心含有 QD 编码微胶囊和微球悬浮液的孔板。 20 分钟。在 480 nm 的激发波长下测定游离 QD 和嵌入聚电解质微胶囊聚合物壳中的 QD 的荧光最大值；样品分析采用底部扫描模式。

流式细胞术

使用配备蓝色 (488 nm) 氩激光作为激发源的 FACSCanto II 流式细胞仪 (Becton Dickinson, USA) 分析原始碳酸钙微粒、具有含 QD 的聚电解质壳的微粒以及QD 编码的空心微胶囊。我们分析了 0.5 mL 等分的悬浮液，其中含有 10 ⁶ 微珠/微胶囊；收集的事件数为 2500。在标准前向散射光 (FSC)、侧向散射光 (SSC) 和藻红蛋白 (PE, 585/42 nm) 通道中记录荧光强度。数据使用FACSDiva软件（美国Becton Dickinson）进行处理。

材料

我们使用含有 12 单体 PEG 间隔物（Thermo Fisher Scientific，美国）、Mw ≈ 15,000 Da（Sigma-Aldrich，日本）的聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH）、聚（4-苯乙烯磺酸钠）的 PEG 羧化硫醇衍生物(PSS) 具有 Mw ≈ 70,000 Da（Sigma-Aldrich，美国），以及聚丙烯酸 (PAA) 具有 Mw ≈ 15,000 Da（Sigma-Aldrich，美国）。碳酸钠、氯化钙、乙二胺四乙酸二钠脱水物、牛血清白蛋白（BSA）、环氧树脂包埋剂等试剂购自Sigma-Aldrich（美国）。所有工作溶液均使用通过 Direct-Q 水净化系统（Millipore，法国）获得的 MilliQ 水（18.2 mΩ cm）制备，并通过孔径为 0.22 μm 的过滤器过滤。

统计分析

使用MS Office Excel 2007 和Origin Pro 2015 软件包对数据进行统计分析。结果表示为三个独立实验的平均值和标准偏差。

结果与讨论

QD 编码聚电解质微胶囊的开发

我们使用逐层沉积技术获得 QD 编码荧光微粒形式的生物成像剂，因为建议的方法不需要有机溶剂，允许使用生物相容性聚合物 [23, 24]，并确保有效固定聚合物壳内的量子点 [21]。用水溶性、表面修饰的量子点光学编码的荧光聚电解质微胶囊的制备包括在作为基质的碳酸钙微粒表面上应用五个带相反电荷的聚电解质层作为第一步，然后用负电荷对聚电解质壳进行编码。带电的量子点，用带相反电荷的聚电解质保护层涂覆量子点层，溶解微粒的核心基质，最后用 BSA 修饰微胶囊表面（图 1）。由于聚阳离子与微粒表面的静电相互作用，碳酸钙微粒的负表面电荷确保了多环芳烃的吸附。 PAH 吸附到颗粒上产生的表面的正 ζ 电位允许随后应用 PSS 聚阴离子，以及用 HS-PEG12-COOH 修饰的 QD，由于羧基，它们也具有负表面电荷，因此，可以吸附到 PAH 聚阳离子层上。将量子点嵌入聚合物聚电解质膜中是通过应用额外的覆盖聚电解质层（至少 4 到 6 个）来实现的，如图 1a、b 所示。

量子点编码聚电解质微胶囊的设计与结构：a 聚合物微胶囊膜中各层的排列示意图。 b 在聚合物电解质分层和 QD 编码过程中碳酸钙微粒表面 ζ 电位的变化。 c 用 HS-PEG12-COOH 溶解的 CdSe/ZnS QD 编码的聚电解质微胶囊的荧光显微照片。 * 去核后微胶囊表面的 ζ 电位； ** 制备具有 BSA 修饰表面的 QD 编码聚电解质微胶囊的附加阶段

通过用 0.2 M EDTA (pH 6.5) 溶解碳酸钙微粒并形成乙二胺四乙酸钙盐的水溶性复合物，其通过聚合物膜扩散导致形成微胶囊内的空腔。为了获得具有 BSA 改性表面的 QD 编码聚电解质微胶囊，PAA 聚阴离子分层到 PAH 聚阳离子的第 11 层上。使用 PAA 是因为它与微胶囊表面相互作用时的解离常数值。 PAA 的 pKa 值 (pKa ≈ 4.7) 较低，因此与 PSS (pKa ≈ 7.5) 相比，酸性更强 [25, 26]，这导致微胶囊表面的 ζ 电位更高。由于 BSA 和 PAA 之间的静电相互作用，PAA 改性表面的电荷促进了 BSA 被动吸附。然而，PAA 和 BSA 之间的组装导致微胶囊负表面电荷减少（图 1b）。 BSA 沉积到微胶囊表面后，带负电荷的 PAA 层被 BSA 的静电正氨基屏蔽，因此，BSA 涂层 QD 编码微胶囊的 ζ 电位可能主要由 BSA 的静电行为决定外微胶囊包衣[26]。

水溶性聚乙二醇化量子点的特点是粒径分布窄、分散体中不存在聚集、胶体稳定性高。这可能确保量子点在微珠表面上的均匀吸附并促进有效编码，从而获得明亮的荧光微胶囊（图 1c）。

使用蛋白质（如 BSA）进行表面改性使聚合物微胶囊具有更高的生物相容性和更强的抗粘附性。这也确保了微胶囊表面的暂时钝化，这对于后续研究由 PAH-PSS 或 PAH-PAA 互聚物复合物形成的微胶囊在体外与细胞的相互作用和体内行为方面很重要 [27,28,29] .

获得的 QD 编码的微胶囊是球形的（图 1c），其特征是尺寸分布较窄（图 2），平均尺寸为 4.45 ± 0.65 μm。这个大小与红细胞相当，甚至比它还要小[30]。此外，如前所述，微胶囊的聚合物膜是一种易变形的柔性结构。通过静脉注射，这种大小的微胶囊不能穿透血液组织屏障，这使得可以追踪光学编码微胶囊在体内的运输和分布 [31, 32]。然而，在血管壁通透性增强的部位，例如炎症和肿瘤生长区域，微胶囊可以渗透到血管外空间，这有望确保靶向递送的成像和监测 [33,34,35 ,36]。

量子点光学编码聚电解质微胶囊的粒径分布，分析微胶囊数为600个

QD 编码聚电解质微胶囊的荧光和结构特征

制造的微胶囊的特征在于波长为 590 nm 的荧光峰，这对应于用于微胶囊光学编码的原始水溶性 QD 的荧光峰。这表明构成微胶囊膜的聚合物聚电解质不影响微珠和由它们制备的微胶囊中的量子点的荧光特性，特别是荧光最大值（图 3）。

量子点 (QD) 掺入微珠 (MCB) 和微囊 (MCC) 的聚合物膜对其荧光特性的影响：显示了含有 2.241 mg QD 的 QD 溶液的荧光光谱；这对应于用于 MCB 光学编码的 QD 数量

图 4 显示了来自 QD 编码微胶囊以及安慰剂微胶囊群体在 PE（575/25 nm）荧光通道和 FSC-A 和 SSC-A（488/10 nm）中的信号强度分布直方图) 流式细胞仪的通道。数据表明 PE (575/25 nm) 通道中安慰剂和光学编码微胶囊之间的有效区分（图 4a、b）。 PE（575/25 nm）通道中来自微胶囊的荧光信号强度为~ 10 ⁴ ，这证明了 QD 编码的微胶囊的高荧光能力。在 FSC-A 和 SSC-A (488/10 nm) 通道中，两个微胶囊群的分布重叠，这表明安慰剂和编码微胶囊的相对大小和粒度参数相似（图 4c、d），因此, 人口的同质性。显然，这是由于微胶囊膜由相同数量的聚合物层组成，编码微胶囊的膜仅包含一层 QD。因此，获得的微胶囊具有均匀的尺寸分布和最佳的荧光特性，确保它们在流式细胞仪的相应通道中被检测到。

流式细胞术检测 QD 编码的聚电解质微胶囊：a SSC-PE 通道中的微胶囊点图轮廓； b PE通道中的微胶囊分布直方图； c SSC-FSC 通道中的微胶囊点图轮廓； d FSC 通道中的微胶囊分布直方图。使用无 QD 的微胶囊（安慰剂）作为对照并以灰色显示，而用 CdSe/ZnS 量子点（590 nm 处的最大荧光发射）编码的微胶囊以橙色显示。分析的事件数等于2500。点图和直方图轴显示为SSC-A、FSC-A、PE-A，其中A表示数据以信号区域表示

图 5 中显示的 QD 编码聚电解质微胶囊切片的显微照片表明微胶囊是中空的，检测到的明亮荧光信号由含有 QD 的聚合物膜发射。这些数据证实了用于溶解核心的程序的效率，并证明了制造的微胶囊的明亮荧光信号，在荧光显微镜和流式细胞术的情况下，可以使用相应的过滤器、德克萨斯红和 PE 分别检测到。与用常规染料（如异硫氰酸荧光素 (FITC) 或氨基荧光素 [14, 37]）标记的聚电解质微胶囊相比，所制备的聚合物壳中含有 QD 的聚电解质微胶囊具有更高的荧光特性。否则，使用逐层方法用 QD 编码的微胶囊具有与使用溶胀技术用有机染料编码的微珠相当甚至更差的亮度。亮度由消光系数和量子产额的乘积决定。室温下水溶性量子点的量子产率约为 40%，与有机染料相当 [22, 38, 39]，而量子点的消光率比有机染料大近 100 倍。否则，由于量子点的大尺寸，它们在微胶囊壳内的数量可能无法与有机染料分子相比。因此，编码有机染料分子的数量可能比量子点要好得多，从而确保可比的亮度。另一方面，用量子点编码微胶囊提供了重要的比较优势，如完全没有光漂白。此外，不同颜色（大小）的 QD 可以用相同的波长激发。因此，使用不同颜色的量子点进行微胶囊编码可以提供几乎无限数量的光谱解析光代码[21]。

用量子点编码的聚电解质微胶囊切片的显微照片。 (a 中的箭头 ) 表示 (b 中显示的区域 , c ) 放大倍数

结论

用于获得 QD 编码的聚电解质微胶囊的开发技术确保了有效的光学编码。制造的聚合物微胶囊具有最佳尺寸分布和高荧光强度，可用于商业流式细胞仪和共聚焦显微镜的有效检测。因此，设计的微胶囊是用于体外和体内生物成像的潜在荧光剂。进一步开发基于微胶囊的多功能平台将旨在提出基于荧光 QD 编码微粒的新型生物成像和治疗诊断工具，这些微粒可响应不同的外部物理或化学刺激以及光激发。

缩写

BSA：

牛血清白蛋白

EDTA：

乙二胺四乙酸二钠

PAA：

聚丙烯酸

多环芳烃：

聚阳离子聚（烯丙胺盐酸盐）

PEG：

聚乙二醇

PSS：

聚阴离子聚（4-苯乙烯磺酸钠）

QD：

量子点

TOPO：

三辛基氧化膦