使用绿茶提取物合成的金纳米粒子的形状依赖性细胞毒性和细胞摄取

介绍

植物含有天然的初级和次级代谢产物，包括黄酮类、皂苷、生物碱、类固醇、香豆素、单宁、酚类、萜类、碳水化合物、蛋白质和氨基酸。最近，植物提取物已被用于合成纳米材料，特别是金属纳米颗粒，如金、银、氧化钛、铜、钯、氧化锌和铂纳米颗粒 [1]。多种植物化学物质积极参与将金属盐转化为金属纳米颗粒作为还原剂。此外，植物提取物起到稳定剂的作用，以保持溶液中金属纳米颗粒的胶体稳定性。化学还原剂通常对生物体是有害的和有毒的。相比之下，在金属纳米粒子的合成中使用植物提取物是绿色、环保和可持续的。植物的各种部分，如茎、果实、种子、叶和花，被用来合成金属纳米粒子 [1, 2]。广泛的评论调查了使用植物提取物作为还原剂的金纳米粒子 (AuNPs) 的绿色合成 [2,3,4]。使用这种绿色策略，合成步骤是一步一锅完成的。此外，该过程简单、容易、成本有效且环保。 AuNPs 的大小、形状和形貌取决于金盐和提取物的浓度、反应时间、反应温度和溶液 pH 值。使用光谱和显微技术来表征 AuNP，包括紫外-可见分光光度法、X 射线衍射、傅里叶变换红外光谱 (FT-IR)、透射电子显微镜 (TEM)、原子力显微镜 (AFM)、扫描电子显微镜 ( SEM)，以及流体动力学尺寸和 zeta 电位测量。这些绿色AuNPs被用作催化剂、抗氧化剂、抗菌剂和抗癌剂[5,6,7,8]。

在作者的实验室中，植物提取物（蒿属 , 益母草 , 远志 , 黄柏 , 柴胡 , 和 Garcinia mangostana ) 已被用作还原剂以绿色合成 AuNPs 和银纳米粒子 (AgNPs) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。 A 的空中部分。毛细血管 被提取并用于合成 AgNPs 和 AuNPs [9, 15, 16]。制备的AgNPs对大肠杆菌具有优异的抗菌活性 , 阴沟肠杆菌 , 铜绿假单胞菌 , 产气克雷伯菌 , 和催产克雷伯菌 与单独的提取物相比[15]。该结果表明，AgNPs 与提取物相结合的协同作用有助于增强抗菌活性。有趣的是，AgNPs 是使用 A 合成的。毛细血管 在十六烷基三甲基溴化铵存在下对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现出抗菌活性 [16]。此外，AuNPs 使用 A 合成。毛细血管 对 4-硝基苯酚还原反应显示出催化活性 [9]。 L。粳稻 提取物用于合成 AgNPs，显示出显着增强的抗菌活性 [10]。我们观察到对革兰氏阴性菌的抗菌活性大于对革兰氏阳性菌的抗菌活性。 P 的根提取物。细叶 也用于合成 AuNPs 和 AgNPs [11, 17]。在使用 P 合成的 AuNPs 和 AgNPs 中分别观察到增强的抗凝活性和抗菌活性。细叶 提炼。最有趣的是，AgNPs 使用 C 合成。萨潘 提取物对耐甲氧西林的 S. 显示出有效的抗菌活性。金黄色葡萄球菌 [18]。 G 的摘录。芒果 产生了具有凋亡作用的不对称哑铃形AgNPs[14]。

之前的报告已经研究了使用茶叶提取物对 AuNPs 和 AgNPs 的绿色合成 [19,20,21,22,23]。 Kamal 及其同事报道了 25 nm-AgNPs 的成功合成 [19]。在另一份报告中，使用茶叶提取物合成了尺寸为 20 到 90 纳米的球形 AgNPs [20]。合成的 AgNPs 对大肠杆菌表现出轻微的抗菌活性。大肠杆菌 . Loo 及其同事还使用茶叶提取物制备了尺寸为 3.42~4.06 nm 的球形 AgNPs [21]。 Vaseeharan 及其同事使用茶叶提取物合成了抗菌 AgNPs [22]。合成的AgNPs对致病性哈氏弧菌有效 感染。 Begum 及其同事使用红茶叶提取物合成 AuNPs 和 AgNPs [23]。迄今为止，大部分采用茶叶提取物合成的球形AgNPs。

在本报告中，壳聚糖被用作 AuNPs 的封端剂。壳聚糖因其高生物相容性、低致敏性、生物降解性和低毒性而被探索作为药物/基因传递载体 [24,25,26]。壳聚糖来源于甲壳素，甲壳素在昆虫和甲壳类动物如螃蟹、龙虾和虾的外骨骼中含量丰富。几丁质是由N组成的多糖 -乙酰-D-葡糖胺由β(1-4)糖苷键连接。异质N可从几丁质中提取壳聚糖 - 脱乙酰过程。壳聚糖本身具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤和抗氧化活性[25]。作为封端剂，壳聚糖通过电空间机制直接接触 AuNPs [26]。壳聚糖纳米颗粒会影响 A549 细胞的细胞摄取机制，但不会改变细胞毒性 [24]。此外，壳聚糖的脱乙酰度对细胞摄取和细胞毒性的影响比分子量更大[24]。

大多数研究都集中在使用茶叶提取物合成球形 AgNPs。在这里，绿茶叶提取物被用来合成金纳米球和纳米星。纳米球被用作种子介导的纳米星合成的种子。为了比较，纳米棒是通过常见的常规方法合成的 [27]。三种不同形状的 AuNP（纳米球、纳米星和纳米棒）用壳聚糖覆盖以增加它们的生物相容性和胶体稳定性。这些 AuNPs 通过紫外可见分光光度法、高分辨率透射电子显微镜 (HR-TEM) 和 FT-IR 进行表征。通过动态光散射 (DLS) 进行的流体动力学尺寸测量和 zeta 电位测量在用壳聚糖加盖之前和之后进行。在盐溶液、缓冲液和细胞培养基中评估胶体稳定性。为了测量细胞毒性，将 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 测定应用于四种癌细胞：AGS（人胃腺癌细胞）、HeLa（人上皮子宫颈腺癌）细胞）、HepG2（人肝细胞癌细胞）和 HT29（人结肠直肠腺癌细胞）。采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）和激光烧蚀电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）定量测量HepG2细胞中AuNPs的细胞摄取。

材料和方法

材料和仪器

三水氯金酸 (HAuCl4·3H2O)、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、壳聚糖（来自虾壳，脱乙酰度≥ 75%）和 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑来自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。所有其他试剂均为分析纯。使用 Shimadzu UV-1800 或 UV-2600 分光光度计在石英比色皿（Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan）中获取紫外-可见光谱。通过 DLS 进行的流体动力学尺寸测量和 zeta 电位测量使用 NanoBrook 90Plus Zeta（Brookhaven Instruments Corporation，New York，USA）进行。使用 Varian 640 IR 获取 FT-IR 光谱（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）；所测样品采用KBr圆盘法制备。 HR-TEM 图像使用 JEM-3010 在 300 kV 下运行（JEOL，东京，日本）捕获；将样品加载到碳涂层铜网格（碳类型-B，300 目，Ted Pella，Redding，CA，USA）上，并在 37 °C 下烘干 24 小时。对于超声处理，使用 WUC-A22H 型（大韩科学有限公司，首尔，韩国）。 Centrifuge 5424R (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) 和 FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, Republic of Korea) 分别用于离心和冷冻干燥。对于 AuNP 的细胞摄取，使用了 Optima 8300 ICP-OES（PerkinElmer，W​​altham，MA，USA）和 J200 Tandem LA-ICP-MS（Applied Spectra，Fremont，CA，USA）。

绿茶提取物的制备

河东绿茶研究所（大韩民国庆南河东）赠送了干绿茶。使用搅拌机制备干叶的粉末。通过混合去离子水 (2 L) 和粉状叶子 (200 g) 进行提取。在环境温度下通过超声处理进行 1 小时的提取，重复 3 次。 Whatman 滤纸用于过滤水部分以去除不溶性物质。然后，将滤液离心（3,000g 力，18 °C，25 分钟），并收集上清液。收集的上清液用注射器过滤，滤液冷冻干燥。将冷冻干燥的材料溶解在去离子水中，制成终浓度为 2% (w/v ) 用于下节所述的绿色合成。

使用提取物合成金纳米球

纳米球合成过程如图 1a 所示。上一节中描述的储备溶液用于合成。在玻璃小瓶中，将提取物（终浓度为 0.03%）和氯金酸三水合物（终浓度为 0.5 mM）混合，并加入氢氧化钠（终浓度为 1 mM）。加入去离子水使最终体积为 2 mL。烘箱孵育在干燥烘箱中在 80 °C 下进行 2 小时。通过获取 300~800 nm 范围内的紫外-可见光谱监测纳米球的表面等离子体共振 (SPR)。纳米球也被用作合成以下部分描述的纳米星的种子。

金纳米球的合成。 一 合成过程示意图及b 壳聚糖封端前后纳米球的紫外-可见光谱。合成后立即显示纳米球的数码照片

金纳米星的合成

Nanostar 合成过程如图 2a 所示。在环境温度下，在加热板上用磁棒搅拌 (750 rpm) 如上一节所述合成的纳米球 (50 μL)。将氯金酸三水合物（0.25 mM，5 mL）加入该溶液中。 15 s后，同时加入两种溶液：硝酸银（1 mM，50 μL）和抗坏血酸（新鲜制备，100 mM，25 μL）。然后，将混合物以750 rpm搅拌5 分钟。在300~1100 nm范围内获得了紫外-可见光谱。

金纳米星的合成。 一 合成过程示意图及b 壳聚糖加帽前后纳米星的紫外可见光谱。合成后立即显示纳米星的数码照片

金纳米棒的合成

纳米棒合成过程如图 3a 所示。对于金纳米棒的合成，根据先前的报告进行了种子介导的合成，并稍作修改 [27]。如下制备生长溶液。在 20 mL 玻璃小瓶中，将三水合氯金酸（10 mM，500 μL）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，100 mM，9.5 mL）混合。溶液呈黄褐色。接着，加入抗坏血酸（新鲜制备，100 mM，55 μL），搅拌该溶液直至由黄棕色变为无色。加入硝酸银（10 mM，100 μL）并摇动10 s。该最终溶液被标记为生长溶液。种子溶液合成如下。在 20 mL 玻璃小瓶中，混合氯金酸三水合物（10 mM，250 μL）和 CTAB（100 mM，9.75 mL）。然后，加入冰冷的新鲜制备的硼氢化钠（10 mM，600 μL）并涡旋 2 分钟。该溶液被标记为种子溶液。将种子溶液 (12 μL) 与先前合成的生长溶液混合。在400~900 nm范围内获得了紫外-可见光谱。

金纳米棒的合成。 一 合成过程示意图及b 壳聚糖封端前后纳米棒的紫外可见光谱。合成后立即显示纳米棒的数码照片

纳米球、纳米星和纳米棒的壳聚糖封端

壳聚糖封端用于增加 AuNPs 的胶体稳定性和生物相容性。壳聚糖溶于1%醋酸，终浓度调至0.01%。然后进行超声处理，使壳聚糖完全溶解；该溶液在以下程序中用作壳聚糖封盖的储备溶液。先前合成的纳米球和纳米星都用壳聚糖原液 (0.01%) 封盖。壳聚糖原液（30%，v/v ) 与 AuNP 溶液 (70 %, v/v ）。将混合物以900 rpm搅拌2 小时以完成壳聚糖封端。对于纳米棒，使用过量的 CTAB，因此，进行离心（14,000 rpm，15 分钟，25 °C）以去除 CTAB。从丸粒中回收纳米棒，并如上所述进行壳聚糖封端。然后获得了紫外-可见光谱。

胶体稳定性评估

AuNPs 的胶体稳定性对于体外和体内应用很重要。三种类型的具有壳聚糖封端的 AuNP 和没有壳聚糖封端的纳米球在以下溶液中的胶体稳定性进行了评估：去离子水、5% 牛血清白蛋白 (BSA)、5% NaCl、PBS (pH 7.4)、Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 ( DMEM）和全培养基。全培养基是含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM。将 1 毫升每种类型的 AuNP 溶液与上述测试溶液 (0.5 mL) 混合。将混合物在25 ℃温育30 min，获得紫外-可见光谱。

细胞培养和细胞毒性

以下癌细胞系购自韩国细胞系库（韩国首尔）：AGS、HeLa、HepG2 和 HT29。进行 MTT 测定以评估 AuNPs 的体外细胞毒性。使用含有丙酮酸钠的 DMEM。细胞培养基含有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素（100 单位/mL）和链霉素（100 单位/mL）。细胞在 100 mm 培养皿中培养并保持在大约 70% 的汇合度。在细胞培养之前，将三种不同形状的 AuNPs 进行真空蒸发，以获得 5 mM 的最终 Au 浓度。在96孔板上，细胞以5.0 × 10 ³ 的密度接种 细胞/孔，并在 CO2 (5%) 气氛下，在 37 °C 的烘箱中孵育 24 小时。接下来，对五种不同浓度的 AuNP（500 μM、250 μM、125 μM、62.5 μM 和 31.25 μM）进行处理，并在 CO2 (5%) 气氛下，在 37 °C 的烘箱中再孵育 24 小时。接下来，加入 MTT 试剂（5 μL，去离子水中 5%）并在 37 °C 的烘箱中在 CO2（5%）气氛下再孵育 3 小时。使用荧光多检测读数器（Synergy HT，Bio Tek Instruments，Winooski，VT，USA）在 570 纳米处测量吸光度。未处理的细胞用作对照。

细胞摄取

使用 HepG2 细胞定量测量每种类型的 AuNP 的细胞摄取。在24孔板上，细胞以5.0 × 10 ⁴ 的密度接种 细胞/孔，并在 CO2 (5%) 气氛下，在 37 °C 的烘箱中孵育 24 小时。接下来，处理 5 μM（最终浓度）的每种类型的 AuNP 溶液，并在 CO2 (5%) 气氛下，在 37 °C 的烘箱中再孵育 24 小时。孵育后，去除含有过量 AuNPs 的溶液，并用胰蛋白酶处理细胞。通过 ICP-OES 和 LA-ICP-MS 定量测量胰蛋白酶化细胞中的 Au 浓度，这提供了细胞中 Au 摄取的浓度。对照为5 μM各类型AuNP的原始胶体溶液，同时用ICP-OES和LA-ICP-MS分析得到Au浓度。

结果与讨论

紫外可见光谱

紫外-可见光谱通常用于确认 AuNPs 的合成。 AuNPs 的特征 SPR 可以在可见光-近红外波长范围内观察到。此外，AuNPs 的封端通常会引起红移（或红色）或深移（或蓝移）。此外，通常与红移和蓝移一起引起低色移。如图 1b 所示，在 300~800 nm 的范围内监测了紫外-可见光谱。纳米球的特征 SPR 为 532 nm，呈深酒红色。在纳米球覆盖壳聚糖后，最大 SPR 红移至 537 nm，同时发生低色移（图 1b）。观察到纳米星具有深蓝色溶液的宽范围 SPR 波长（600~800 nm）（图 2b）。纳米星的壳聚糖封端显示出低色移，吸光度低于没有壳聚糖封端的 AuNPs（图 2b）。纳米棒显示出两种不同的 SPR 波长，分别为 514 nm 和 815 nm，并形成浅粉色溶液（图 3b）。纳米棒的壳聚糖封端导致蓝移至 797 nm，同时发生低色移（图 3b）。考虑到所有这些结果，用壳聚糖覆盖 AuNP 会改变 SPR 波长并引起位移。仔细观察紫外-可见光谱表明三种类型的AuNPs都被壳聚糖成功封端。

流体动力学尺寸和 zeta 电位

接下来，测量流体动力学大小和 zeta 电位；结果如表1所示。没有壳聚糖封端，纳米球和纳米星的流体动力学尺寸分别为28.4和97.8 nm。没有测量纳米棒的流体力学尺寸，因为流体力学尺寸很好地适应了纳米颗粒的球形形状。通过壳聚糖封端，纳米球的流体动力学尺寸增加到 190.7 nm，纳米星的流体动力学尺寸增加到 123.9 nm。通过流体动力学尺寸的增加证实了壳聚糖封端。 Zeta 电位的变化也反映了 AuNPs 表面的壳聚糖封端。壳聚糖是一种带正电荷的多糖；因此，壳聚糖封端导致所有三种类型的 AuNP 均具有正 zeta 电位。对于纳米球，zeta 电位从 - 12.73 变为 42.28 mV。纳米星的 zeta 电位从 - 42.46 变为 47.44 nm。在纳米棒的情况下，CTAB（阳离子表面活性剂）用于合成。因此，原始 zeta 电位为 27.96 mV，没有封顶。纳米棒的壳聚糖封端将 zeta 电位增加到 33.23 nm。因此，纳米球和纳米星的 zeta 电位从负值到正值的变化清楚地表明壳聚糖成功封顶。此外，纳米棒的zeta电位增加，表明表面被壳聚糖覆盖。

HR-TEM 图像

显微镜对于纳米粒子研究至关重要，可提供有关纳米粒子大小和形状的基本信息。显微镜工具可提供一系列详细信息，例如分散状态、二维和三维形态和形貌，以及材料的相对软度/硬度。基于 HR-TEM 图像中随机选择的 75 个离散纳米粒子的平均值，纳米球测量为 8.7 ± 1.7 nm（图 4）。最丰富的尺寸是 8~9 nm (29.3%)，其次是 9~10 nm (12.0%)。在壳聚糖加帽的情况下，纳米球的形状保持不变，形状没有任何变化（图 4c、d）。颗粒的结晶性质由图 4d 中所示的晶格结构清楚地表明。相邻晶格之间的距离测量为 0.24 nm（图 4d）。此外，壳聚糖层也可视化，如图 4d 中的红色箭头所示。纳米星通过 HR-TEM 可视化，如图 5 所示。纳米星测量为 99.0 ± 47.0 nm，代表 19 个离散纳米粒子的平均值。晶格结构显示在放大图像中（图 5c）。如图所示，相邻晶格之间的距离测量为 0.24 nm（图 5c）。图 5c 中的红色箭头表示壳聚糖层。纳米棒如图 6 所示。根据对 28 个颗粒的测量，平均颗粒长度和宽度分别为 60.4 nm 和 16.4 nm。长宽比定义为颗粒长度除以颗粒宽度，为 3.7。晶格结构如图 6c 所示，证实了纳米棒的晶体结构。相邻晶格之间的距离测量为 0.23 nm（图 6c）。红色箭头表示壳聚糖层（图 6c）。

金纳米球的 HR-TEM 图像。比例尺代表 a 5 纳米，b 20 纳米，c 20 纳米和 d 5 纳米。图片a 和 b 在没有壳聚糖加帽的情况下获得，并且c 和 d 用壳聚糖加盖获得。相邻晶格之间的距离测量为 0.24 nm。红色箭头表示加盖后的壳聚糖层

金纳米星的 HR-TEM 图像。比例尺代表 a 200 纳米，b 50 纳米和 c 5 纳米。 d 平均尺寸为 99.0 ± 47.0 nm 的纳米星的示意图。图片a 在没有壳聚糖加帽的情况下获得，并且b 和 c 用壳聚糖加盖获得。相邻晶格之间的距离测量为 0.24 nm。红色箭头表示加盖后的壳聚糖层

金纳米棒的 HR-TEM 图像。比例尺代表 a 100 纳米，b 200 纳米和 c 5 纳米。 d 平均长度和宽度分别为 60.4 nm 和 16.4 nm 的纳米棒的示意图。图片a 在没有壳聚糖加帽的情况下获得，并且b 和 c 用壳聚糖加盖获得。相邻晶格之间的距离测量为 0.23 nm。红色箭头表示加盖后的壳聚糖层

FT-IR 光谱

绿茶含有多种初级和次级代谢物。具体而言，绿茶的主要成分是多酚，包括表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表没食子儿茶素和 (-)-表儿茶素 [28]。获得 FT-IR 光谱以获得有关有助于合成 AuNP 的官能团的信息。我们将纳米球的 FT-IR 光谱与提取物的光谱进行了比较（图 7）。最有可能参与金盐还原反应的主要官能团是-OH。在提取物中，-OH官能团出现在3255 cm ^-1 （图 7a）。合成后，该峰在 3300~3341 cm ^-1 处移动到更高的波数 .该结果表明，-OH 官能团源自多酚，氧化为 C=O，同时将 Au 盐还原为 AuNP。值得注意的是，在 1716 cm ⁻¹ 处出现了 C=O 官能团 在纳米球中明显支持-OH 官能团在合成过程中的氧化（图 7b）。

a的红外光谱 绿茶提取物用于合成和b 金纳米球

各种溶液下胶体稳定性的评估

纳米颗粒的胶体稳定性是诊断和治疗应用的一个重要问题。测试了六种不同溶液的胶体稳定性：（i）去离子水，（ii）NaCl（5%），（iii）PBS（pH 7.4），（iv）BSA（5%），（v）DMEM，和（vi ) 全培养基（含 10% FBS 的 DMEM）。将每种类型的AuNPs与测试溶液混合后，获得紫外-可见光谱；结果如表 2 和图 8 所示。所有三种类型的 AuNP 在紫外-可见光谱（图 8a、c 和 e）中都观察到了低色移以及轻微的红移或蓝移。保留了光谱的形状，并且没有观察到胶体溶液的聚集（图 8b、d 和 f）。该结果表明上述测试溶液的胶体稳定性得到了很好的保留。

胶体稳定性的评估。 一 和 b 带有壳聚糖封端的纳米球，c 和 d 带有壳聚糖封端的纳米星，e 和 f 带有壳聚糖封端的纳米棒，g 和 h 没有壳聚糖封端的纳米球。 DW代表去离子水

在表 2 中，低色移表示为保留吸光度的百分比，原始溶液的吸光度设置为 100%。在所有三种 AuNP 中，胶体稳定性最好保留在全培养基中，用于随后的细胞毒性实验：纳米球 (65.3%)、纳米星 (93.4%) 和纳米棒 (80.2%)。蛋白质溶液 BSA (5%) 也提供了合理的胶体稳定性：纳米球 (61.8%)、纳米星 (70.2%) 和纳米棒 (72.0%)。这些结果表明，覆盖纳米粒子的蛋白质与壳聚糖封端一起对金纳米粒子的胶体稳定性有进一步的有益影响。还评估了没有壳聚糖封端的纳米球的胶体稳定性（图 8g，h）。所有溶液都引起了减色偏移。在测试的溶液中，只有NaCl（5%）溶液表现出较大的红移和低色移。

细胞毒性

进行 MTT 测定以测量对四种癌细胞类型的细胞毒性（图 9）：AGS、HeLa、HepG2 和 HT29。 The cytotoxicity of all three types of AuNPs was dependent on the Au concentration. Among the four cell types, the highest cytotoxicity was observed for HepG2 cells. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC50 value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). 一 AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. e Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.

结论

The continued development of nanotechnology requires elaborate shape and size designs of nanoparticles for successful applications, including as drug delivery carriers or vehicles for biologically active compounds such as anticancer agents. Green tea extract was used as a green reducing agent for the synthesis of Au nanospheres and nanostars. Interestingly, the cytotoxicity of nanorods was higher than that of nanospheres and nanostars, while nanospheres showed the lowest cytotoxicity against four types of cancer cells. Cellular uptake by HepG2 cells was most likely dependent on shape and size; nanospheres showed the highest uptake by the cells, whereas nanostars showed the lowest uptake. The optimization of size and shape together with surface modification and functionalization will lead to the development of nanoparticles for future use in nanomedicine.

缩写

原子力显微镜：

原子力显微镜

AgNPs:

Silver nanoparticles

AGS:

Human gastric adenocarcinoma cells

AuNPs：

金纳米粒子

CTAB：

十六烷基三甲基溴化铵

DLS：

动态光散射

DMEM：

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

FBS：

胎牛血清

FT-IR：

傅里叶变换红外光谱

HeLa:

Human epithelial cervix adenocarcinoma cells

HepG2:

Human hepatocyte carcinoma cells

HR-TEM：

高分辨透射电子显微镜

HT29:

Human colorectal adenocarcinoma cells

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

LA-ICP-MS:

Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry

SEM：

扫描电镜

SPR:

Surface plasmon resonance