绿茶还原金纳米颗粒在癌细胞中的形状依赖性细胞毒性与细胞摄取研究

摘要

本报告合成三种不同形状的壳聚糖包覆金纳米颗粒（纳米球、纳米星、纳米棒），探究形状对癌细胞细胞毒性和细胞摄取的影响。绿茶提取物作为还原剂将金盐还原为金纳米球。纳米星以制备的纳米球溶液为种子溶液制备。纳米棒采用常规法合成。三种金纳米颗粒在UV-Vis分光光度法下均显示特征表面等离子体共振带。高分辨透射电镜（HR-TEM）图像中清晰观察到三种形状的晶格结构，确认纳米颗粒结晶性。三种胶体溶液在各种溶液中均保持胶体稳定性。通过MTT法评估四种癌细胞系细胞毒性，结果纳米棒毒性最高，其次纳米星，最后纳米球。在人肝癌细胞（HepG2）中量测金纳米颗粒细胞摄取，顺序为纳米球>纳米棒>纳米星。研究结果可助于纳米医学领域药物递送载体金纳米颗粒的形状设计。

引言

植物含天然初级和次级代谢产物，包括黄酮、皂苷、生物碱、类固醇、香豆素、单宁、酚、萜类、碳水化合物、蛋白质、氨基酸。近年植物提取物用于纳米材料合成，特别是金、银、二氧化钛、铜、钯、氧化锌、铂等金属纳米颗粒。多样植物化学物质作为还原剂参与金属盐向金属纳米颗粒转化，同时植物提取物作为稳定剂维持胶体稳定性。化学还原剂通常有毒，而植物提取物合成金属纳米颗粒绿色、环保、可持续。植物各部位（茎、果、种、叶、花）均可用于合成。大量综述调查植物提取物绿色合成金纳米颗粒（AuNPs）。该绿色策略一步一锅完成，过程简单、易行、成本低、环保。AuNPs尺寸、形状、形貌取决于金盐和提取物浓度、反应时间、温度、溶液pH。光谱和显微技术表征AuNPs，包括UV-Vis分光光度法、XRD、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、TEM、原子力显微镜（AFM）、扫描电镜（SEM）、动态光散射（DLS）测流体动力学尺寸和Zeta电位。这些绿色AuNPs用作催化剂、抗氧化剂、抗菌和抗癌剂。

作者实验室曾用蒿、益母草、远志、苏木、柴胡、山竹等植物提取物绿色合成AuNPs和银纳米颗粒（AgNPs）。蒿地上部分提取物合成AgNPs和AuNPs。制备AgNPs对大肠杆菌、克雷伯菌等革兰阴性菌抗菌活性优于提取物单独作用，提示协同增强。有趣的是，十六烷基三甲基溴化铵存在下蒿合成AgNPs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有活性。此外，蒿合成AuNPs对4-硝基酚还原有催化活性。益母草提取物合成AgNPs显著增强抗菌活性，观察到对革兰阴性菌活性大于革兰阳性菌。远志根提取物合成AuNPs和AgNPs，分别观察到增强抗凝和抗菌活性。最有趣的是苏木提取物合成AgNPs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有效。山竹提取物产生不对称哑铃形AgNPs并具凋亡效应。

既往报道多用茶叶提取物绿色合成AuNPs和AgNPs。Kamal等合成25 nm AgNPs。另报道茶叶提取物合成20–90 nm球形AgNPs，对大肠杆菌略有抗菌活性。Loo等用茶叶提取物制备3.42–4.06 nm球形AgNPs。Vaseeharan等合成抗菌AgNPs对弧菌感染有效。Begum等用红茶提取物合成AuNPs和AgNPs。迄今多用茶叶提取物合成球形AgNPs。

本报告用壳聚糖包覆AuNPs。壳聚糖因高生物相容性、低致敏性、可生物降解、低毒性被探索为药物/基因递送载体。壳聚糖源自甲壳素，广泛存在于昆虫和甲壳类（蟹、龙虾、虾）外骨骼。甲壳素为β(1-4)糖苷键连接的N-乙酰-D-葡萄糖胺多糖。壳聚糖经甲壳素非均相N-脱乙酰基获得。壳聚糖本身具抗菌、抗真菌、抗肿瘤、抗氧化活性。作为包覆剂，壳聚糖通过电立体机制直接接触AuNPs。壳聚糖纳米颗粒影响A549细胞摄取机制但不改变细胞毒性。此外，壳聚糖脱乙酰基度对细胞摄取和细胞毒性影响大于分子量。

多数研究集中于茶叶提取物合成球形AgNPs。本文利用绿茶提取物合成金纳米球和纳米星。纳米球作为种子介导合成纳米星。为比较，纳米棒采用常规法合成。三种形状AuNPs（纳米球、纳米星、纳米棒）包覆壳聚糖提高生物相容性和胶体稳定性。用UV-Vis分光光度法、HR-TEM、FT-IR表征。DLS测流体动力学尺寸和Zeta电位在包覆前后测定。在盐溶液、缓冲液、细胞培养基中评估胶体稳定性。MTT法测四种癌细胞细胞毒性：AGS（人胃腺癌）、HeLa（人宫颈上皮腺癌）、HepG2（人肝癌）、HT29（人结直肠腺癌）。HepG2细胞中用电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）和激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）定量测定AuNPs细胞摄取。

材料与方法

材料与仪器

四氯金酸三水合物（HAuCl₄·3H₂O）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、壳聚糖（虾壳来源，≥75%脱乙酰）、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。其他试剂均为分析纯。Shimadzu UV-1800或UV-2600分光光度计用石英比色皿获取UV-Vis谱。DLS测流体动力学尺寸和Zeta电位用NanoBrook 90Plus Zeta（Brookhaven Instruments，美国纽约）。Varian 640 IR获取FT-IR谱（Agilent Technologies，美国圣克拉拉），样品用KBr压片法制备。HR-TEM图像用JEM-3010（JEOL，日本东京）300 kV拍摄，样品负载碳膜铜网（碳型B，300目，Ted Pella，美国雷丁），37°C烘箱干燥24 h。超声用WUC-A22H（Daihan Scientific，韩国首尔）。Centrifuge 5424R（Eppendorf，德国汉堡）和FD8518（IlshinBioBase，韩国京畿）用于离心和冻干。细胞摄取用Optima 8300 ICP-OES（PerkinElmer，美国沃尔瑟姆）和J200 Tandem LA-ICP-MS（Applied Spectra，美国弗里蒙特）分析。

绿茶提取物制备

韩国河东绿茶研究所（河东、庆南）赠送干绿茶叶。搅拌机制粉。2 L去离子水混合200 g叶粉，室温超声1 h，重复3次。定性滤纸过滤除不溶物。滤液离心（3000g，18°C，25 min），收集上清。注射器过滤，冻干。冻干物溶解去离子水制备储备液，最终浓度2%（w/v）用于后续绿色合成。

提取物合成金纳米球

纳米球合成流程见图1a。玻璃瓶中混合提取物（终浓度0.03%）和四氯金酸三水合物（终浓度0.5 mM），加入氢氧化钠（终浓度1 mM），加水定容2 mL。80°C干燥烘箱孵育2 h。300–800 nm监测纳米球表面等离子体共振（SPR）。纳米球亦用作下文纳米星合成种子。

金纳米星合成

纳米星合成流程见图2a。上述合成纳米球（50 µL）磁力搅拌（750 rpm）于室温热板上。加入四氯金酸三水合物（0.25 mM，5 mL）。15 s后同时加入两溶液：硝酸银（1 mM，50 µL）和抗坏血酸（新配，100 mM，25 µL）。继续750 rpm搅拌5 min。300–1100 nm采集UV-Vis谱。

金纳米棒合成

纳米棒合成流程见图3a。按文献[27]种子介导法微调合成。生长液制备：20 mL玻璃瓶中混合四氯金酸三水合物（10 mM，500 µL）和CTAB（100 mM，9.5 mL），溶液呈黄褐色。加入抗坏血酸（新配，100 mM，55 µL），搅拌至由黄褐变无色。加入硝酸银（10 mM，100 µL）振荡10 s，标记为生长液。种子液制备：20 mL玻璃瓶混合四氯金酸三水合物（10 mM，250 µL）和CTAB（100 mM，9.75 mL）。加入冰冷新配硼氢化钠（10 mM，600 µL）涡旋2 min，标记为种子液。混合种子液（12 µL）与前制生长液。400–900 nm采集UV-Vis谱。

纳米球、纳米星、纳米棒壳聚糖包覆

壳聚糖包覆提高AuNPs胶体稳定性和生物相容性。壳聚糖溶于1%乙酸，终浓度调0.01%。超声完全溶解，作包覆储备液。先前合成纳米球和纳米星用壳聚糖储备液（0.01%）包覆。壳聚糖储备液（30% v/v）混合AuNP溶液（70% v/v），900 rpm搅拌2 h完成包覆。纳米棒因过量CTAB，先离心（14000 rpm，15 min，25°C）除CTAB，从沉淀回收纳米棒，再按上述包覆。随后采集UV-Vis谱。

胶体稳定性评估

纳米颗粒胶体稳定性对体外/体内应用重要。测试六种溶液：(i) 去离子水，(ii) 5% NaCl，(iii) PBS（pH 7.4），(iv) 5% BSA，(v) DMEM，(vi) 完全培养基（DMEM+10% FBS）。各AuNPs混合测试液（0.5 mL），25°C孵育30 min，采集UV-Vis谱。结果见表2和图8。三种AuNPs在UV-Vis谱均观测到伴随轻微红/蓝移的次色移。谱形保持，胶体溶液无聚集（图8b、d、f），证明胶体稳定性在上述测试液中良好保持。

表2以原液吸光度100%计保留吸光度百分比表达次色移。三种AuNPs在完全培养基（后续细胞毒性实验用）中胶体稳定性最佳：纳米球65.3%，纳米星93.4%，纳米棒80.2%。蛋白溶液BSA（5%）亦提供合理稳定性：纳米球61.8%，纳米星70.2%，纳米棒72.0%。结果指示覆盖纳米颗粒的蛋白与壳聚糖包覆协同进一步有益胶体稳定性。未包覆壳聚糖纳米球胶体稳定性亦评估（图8g、h）。所有溶液致次色移。仅5% NaCl溶液显示大红移伴随次色移。

细胞毒性

MTT法测四种癌细胞细胞毒性（图9）：AGS、HeLa、HepG2、HT29。三种AuNPs细胞毒性随Au浓度依赖。四细胞系中HepG2细胞毒性最高。纳米棒对四细胞系毒性最高，其次纳米星，最后纳米球。具体纳米棒毒性极高，故亦评估低Au浓度范围纳米棒细胞毒性（图9e）。低至8 µM Au纳米棒显示浓度依赖性细胞毒性。针对HepG2细胞，IC₅₀值：纳米球127.1 µM Au，纳米星81.8 µM Au，纳米棒22.7 µM Au。故纳米棒细胞毒性最强，纳米星次之，纳米球最弱。

报道AuNPs细胞毒性受尺寸、形状、表面电荷影响。Favi等研究Au纳米球（61 nm）和纳米星（34 nm）对人皮成纤维细胞和大鼠脂肪垫内皮细胞细胞毒性，两细胞型均纳米球致死浓度40 µg/mL，纳米星400 µg/mL，提示纳米球毒性大于纳米星，尺寸、形状、表面化学最可能影响AuNPs细胞毒性。Woźniak等报道多形状AuNPs对HeLa和HEK293T细胞毒性：纳米球（~10 nm）、纳米花（~370 nm）、纳米棒（~41 nm）、纳米棱柱（~160 nm）、纳米星（~240 nm）。有趣的是纳米球和纳米棒毒性大于纳米花、纳米棱柱、纳米星。作者解释纳米颗粒小尺寸和聚集过程是纳米球和纳米棒细胞毒性主要驱动力。许多研究探讨AuNPs尺寸效应对细胞毒性影响。AuNPs尺寸减小，细胞摄取增加，导致细胞内AuNPs浓度升高，细胞毒性增强。但细胞内低浓度AuNPs也显高毒性。细胞内AuNPs浓度影响细胞毒性，但理解AuNPs特性至关重要。Tarantola等评估两种形状AuNPs（纳米球43 nm，纳米棒38×17 nm）在上皮细胞毒性，纳米球毒性大于纳米棒，且纳米球诱导上皮细胞膜功能障碍（电细胞底物阻抗感测测定）。如前所述，许多研究正探究不同形状AuNPs在各种细胞中细胞毒性。虽然AuNPs形状相同，许多因素仍影响细胞毒性。评估细胞毒性时，尺寸、形状、理化表面性质、浓度、暴露时间、细胞类型均应考虑。除AuNPs特性外，细胞毒机制包括细胞膜破坏、氧化应激、细胞骨架破坏、线粒体功能丧失也重要。目前自噬和溶酶体功能障碍成为纳米材料细胞毒性新解释。溶酶体中纳米材料诱导溶酶体铁介导氧化应激和组织蛋白酶等溶酶体水解酶释放，导致线粒体功能障碍和细胞死亡。本报告纳米棒对四癌细胞毒性最强，未来工作将详细考察细胞毒性机制。

HepG2细胞摄取

HepG2细胞在四癌细胞中细胞毒性最高，故选此细胞评估细胞摄取。ICP-OES和LA-ICP-MS两仪器定量分析细胞内Au浓度，结果见图10。用5 µM Au浓度评估摄取（因四癌细胞此浓度无毒性）。摄取率：纳米球最高（58.0%），其次纳米棒（52.7%），纳米星最低（41.5%）。前文细胞毒性依赖形状（纳米棒>纳米星>纳米球），但细胞摄取顺序（纳米球>纳米棒>纳米星）与细胞毒性顺序不符。纳米球摄取最高但细胞毒性最低。结果提示高细胞摄取不必然导致高细胞毒性。如前所述，尺寸、形状、理化表面性质、浓度、暴露时间、细胞类型等多因素影响细胞毒性。

三种AuNPs不同摄取程度（41.5–58.0%）可能取决于热力学驱动力下包裹（膜如何包裹纳米颗粒）与受体扩散动力学竞争。Chithrani和Chan比较转铁蛋白包被Au纳米球和纳米棒HeLa细胞摄取。相同尺寸（即纳米球直径等于纳米棒宽度）下，纳米球摄取高于纳米棒，与本报告纳米球摄取高于纳米棒一致。纳米棒摄取宽度比长度更重要，长宽比增加降低摄取率。纳米星尺寸99.0±47.0 nm，为三种AuNPs中最大。大纳米颗粒（>50 nm）受体扩散动力学慢导致包裹时间短，故大纳米颗粒摄取低，即本报告纳米星。壳聚糖包覆提高胶体稳定性和生物相容性，也可能通过与细胞表面受体相互作用影响AuNPs细胞摄取。需详细机制研究阐明此问题。

结论

纳米技术持续发展要求精细形状和尺寸设计纳米颗粒，以成功应用于药物递送载体或抗癌药物等生物活性化合物载体。绿茶提取物作为绿色还原剂合成Au纳米球和纳米星。有趣的是纳米棒细胞毒性高于纳米球和纳米星，而纳米球对四癌细胞细胞毒性最低。HepG2细胞摄取极可能依赖形状和尺寸；纳米球细胞摄取最高，纳米星最低。优化尺寸、形状、表面修饰和功能化将推动纳米颗粒未来在纳米医学中的应用。

缩略语

AFM

原子力显微镜

AgNPs

银纳米颗粒

AGS

人胃腺癌细胞

AuNPs

金纳米颗粒

CTAB

十六烷基三甲基溴化铵

DLS

动态光散射

DMEM

Dulbecco改良鹰培养基

FBS

胎牛血清

FT-IR

傅里叶变换红外光谱

HeLa

人宫颈上皮腺癌细胞

HepG2

人肝癌细胞

HR-TEM

高分辨透射电镜

HT29

人结直肠腺癌细胞

ICP-OES

电感耦合等离子体发射光谱

LA-ICP-MS

激光烧蚀电感耦合等离子体质谱

SEM

扫描电镜

SPR

表面等离子体共振