氧化石墨烯与银纳米颗粒的复合材料可降低抗菌纳米平台的成纤维细胞和内皮细胞的细胞毒性

介绍

具有抗菌表面的材料已被广泛用于医学和生物医学行业 [1]。纳米材料被认为是有效的替代抗菌剂，可用于代替抗生素和化学制剂 [2]。银纳米粒子 (AgNPs) 最常用于其抗菌性能 [3]。然而，显示抗菌活性的纳米颗粒，包括 AgNPs，尤其是在较高浓度下，可能对人体细胞有毒，并可能影响人类健康 [4, 5]。因此，在生物医药行业，表面包覆纳米材料的材料的应用引发了对其安全性和毒性的质疑。

将纳米材料的潜在毒性降至最低的可能方法之一是在不改变其抗菌性能的情况下限制其流动性。用于抗菌表面的牢固附着的纳米材料不会与材料分离，从而降低了它们对人体细胞的毒性 [6]。用纳米粒子涂覆表面的有效方法之一是超声波技术[7]。超声波导致纳米材料的结构变化，导致解聚或团聚，具体取决于纳米材料[8]。超声波技术还可用于从不同材料合成纳米复合材料，包括金属离子和纳米颗粒 [9,10,11]。超声处理已被用于组装不同的纳米材料，包括用 AgNPs 和其他纳米粒子装饰氧化石墨烯 (GO) 薄片 [12]。

纳米粒子的抗菌活性机制因纳米粒子的种类不同而不同；然而，负责纳米粒子抗菌性能的主要过程如下：与细胞成分的直接相互作用和间接过程，包括细胞成分的氧化和氧化还原过程的破坏 [3]。 AgNP 的抗菌活性源于 AgNPs 和释放的 Ag+ 离子直接破坏细菌细胞膜，诱导活性氧 (ROS) 的合成，以及质膜电位的崩溃，从而导致细胞内 ATP 的消耗 [13] ,14,15]。由于 GO 和 GO 纳米复合材料的高吸附能力 [18, 19]，由于 ROS 合成和细胞直接固定在 GO 表面 [16, 17]，GO 对细菌细胞具有细胞毒性。

然而，纳米颗粒的毒性不仅仅在细菌细胞中观察到。一般来说，人类细胞比细菌更不易受到纳米粒子的影响，因为它们的规模更大，而且具有有效的修复和防御机制，但已经观察到细胞毒性，尤其是在高浓度下。体外研究中的 AgNP 毒性以类似数量级的浓度出现，尽管对于更复杂的不同生物系统或生物体，它们可能会有很大差异 [20]。由于结构和生理差异，AgNPs 对多细胞生物的毒性通常较低，例如特殊的细胞组织，包括上皮细胞 [21]。 GO 对人体细胞的生物相容性取决于浓度和片状形态。在较高浓度下，GO 可导致质膜渗透和 ROS 合成增加 [22,23,24]。

在我们之前的研究中，我们发现由 AgNP 和 GO (Ag-GO) 纳米复合材料组成的纳米平台对细菌（大肠杆菌 , 金黄色葡萄球菌 和表皮葡萄球菌 ) 和致病性酵母菌 (白色念珠菌 )，这与 ROS 合成增加和质膜穿孔有关 [25]。由于两种纳米材料的综合活性，Ag-GO 显示出比 AgNP 或 GO 纳米平台更高的抗菌活性。在这里，我们假设涂有 Ag-GO 纳米复合材料的聚氨酯箔对成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和替代体内模型——鸡胚胎绒毛膜尿囊膜——的毒性低于仅涂有 AgNPs 的箔。

结果

AgNPs 和 GO 在水胶体中形成纳米复合材料

透射电子显微镜 (TEM) 分析用于评估纳米材料的形态及其在 Ag-GO 复合材料中的相互作用（图 1）。 AgNPs 是球形纳米粒子，平均尺寸约为 55 nm。此外，TEM 图像显示银纳米颗粒对 GO 的粘附（图 1e）。这些观察结果在 zeta 电位分析中得到进一步证实。 Ag-GO 的 zeta 电位表明水胶体在超声处理后立即不稳定，但在 24 h 后稳定（zeta 电位：分别为 - 15.68 和 - 27.7 mV；表 1）。相比之下，AgNP 水胶体在超声处理后立即和 24 h 后都不稳定，而 GO 水胶体非常稳定，在 24 h 后没有显着变化（zeta 电位：分别为 - 31.11 mV 和 - 28.42 mV）。此外，动态光散射 (DLS) 分析表明 Z -AgNPs 的平均尺寸为 93.1 nm，GO 为 1485.0 nm，Ag-GO 为 1157.0 nm。 AgNP 粒径分布表明与团聚体形成相关的三个峰，而 GO 和 Ag-GO 粒径分布表明一个峰（图 1b、d、f）。

纳米颗粒形态和尺寸分布。 a 的透射电子显微镜图像 银纳米粒子，c 氧化石墨烯和e 银纳米颗粒和氧化石墨烯复合材料。 b 的大小分布 银纳米粒子，d 氧化石墨烯和f 银纳米粒子与氧化石墨烯复合物

拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 用于表征 GO 的结构特征（图 2）。图 2a 显示了 GO 的 D、G 和 D' 的反卷积。 D带的位置是1347 cm ^{− 1} 和 G 波段 1578 cm ^{− 1} ; ID/IG 比率为 1.34。 FT-IR分析显示在~ 3500 cm ^{− 1} 处观察到一个宽峰 ，主要分配给水和羟基。 1600 cm ^{− 1} 附近的峰值 分配给石墨碳中存在的 C=C 键。在 FT-IR 光谱上观察到的其他峰表明 GO 富含含有 C=O 键的基团（主要是羧基），峰在 1720 cm ^{− 1} 和 915 cm ^{− 1} , 环氧树脂 (C–O–C) 可见峰在 1200 cm ^{− 1} , 和 C–H 键（峰值在 2800 cm ^{− 1} ).

氧化石墨烯的结构特征分析。 一 氧化石墨烯的拉曼光谱，建议对 D、G 和 D' 进行解卷积。 b 指定官能团的氧化石墨烯的傅里叶变换红外光谱（ATR，衰减全反射）光谱

AgNP-、GO- 和 Ag-GO-涂层箔减少了肠炎沙门氏菌 成长

GO、AgNP和Ag-GO纳米平台的抗菌活性用S测试。肠炎 .细菌在涂有纳米材料的箔上在 37 °C 下孵育 24 小时导致生长减少（图 3）。最强S。肠炎 在 Ag-GO 纳米平台上观察到生长抑制。然而，AgNP 和 GO 纳米平台也导致 S 减少。肠炎 生长。将在 Ag-GO 纳米平台上培养的细菌的扫描电子显微镜 (SEM) 图像与对照组进行比较，显示出数量减少的 S。肠炎 细胞。此外，细菌粘附在纳米平台上并表现出形态变化，表明其细胞膜被破坏。

涂有银纳米颗粒和氧化石墨烯的纳米平台降低了S 的活力。肠炎。 a 的扫描电子显微镜图像 控制S。肠炎 细菌和b S。肠炎 在 37 °C 下孵育 24 小时后，在银纳米颗粒和氧化石墨烯涂覆的纳米平台上孵育。 c S 的生存能力。肠炎 在纳米平台上孵育 24 小时后，使用 PrestoBlue 测定进行评估。数值表示为平均值 ± 标准偏差 (n =3，每个实验一式三份）。统计显着性由不同的上标表示（单向方差分析；P <0.05)。缩写：C，对照组（不含纳米颗粒的箔）； AgNPs，涂有银纳米颗粒的纳米平台； GO，涂有氧化石墨烯的纳米平台； Ag-GO，涂有氧化石墨烯和银纳米颗粒的复合材料的纳米平台； RU，相对单位

Ag-GO 复合涂层纳米平台中的 GO 抑制 AgNP 毒性

通过将成纤维细胞和 HUVEC 在纳米平台和未涂层箔上直接孵育 24 小时来研究纳米平台的毒性（图 4）。成纤维细胞和HUVECs在不同纳米平台上的生存能力存在显着差异（P =0.0003 和 P =0.0156，因此）。与在未涂层箔上孵育的细胞的活力相比，GO 纳米平台没有改变成纤维细胞的活力。同样，GO 对 HUVEC 的活力没有显着影响。然而，用 AgNPs 涂层导致成纤维细胞和 HUVEC 的活力降低 40-50%。当成纤维细胞和 HUVEC 在涂有 Ag-GO 纳米复合材料的纳米平台上孵育时，它们的细胞活力没有改变，显示出对 AgNP 毒性的抑制。未涂覆箔上的细胞形态显示出在 2D 培养条件下生长的成纤维细胞的典型形态（图 4a）。在 AgNP 涂层箔上孵育的细胞显示出细胞的密集聚集。 GO-和Ag-GO-涂层纳米平台上的细胞形态表现出团聚趋势和细胞扩散的减少。

氧化石墨烯包覆的纳米平台降低了银纳米颗粒的细胞毒性。 在a上培养的成纤维细胞的形态学 非涂层纳米平台，b 银纳米粒子包覆的纳米平台，c 氧化石墨烯涂层纳米平台，d 银纳米粒子和氧化石墨烯复合涂层的纳米平台。形态学通过光学显微镜评估，使用相差× 200 放大倍数。成纤维细胞 (e ) 和 HUVEC (f ) 在纳米平台上孵育 24 小时后的生存力使用 PrestoBlue 测定确定。数值表示为平均值 ± 标准偏差 (n =3，每个实验一式三份）。统计显着性由不同的上标表示（单向方差分析；P <0.05)。缩写：HUVECs，人脐静脉内皮细胞； C，对照组（没有纳米颗粒的箔）； AgNPs，涂有银纳米颗粒的纳米平台； GO，涂有氧化石墨烯的纳米平台； Ag-GO，涂有氧化石墨烯和银纳米颗粒的复合材料的纳米平台； RU，相对单位

还使用鸡胚绒毛膜尿囊膜评估了纳米平台的毒性（图 5）。纳米平台直接在绒毛膜尿囊膜上孵育，48 小时后检查其接触处的形态。 AgNPs 引起绒毛膜尿囊膜的形态变化，而在 GO 和 Ag-GO 纳米平台的情况下，形态与对照组相当（图 5b）。绒毛膜尿囊膜在AgNP纳米平台上孵育后，毛细血管数量减少，表明对内皮细胞和间充质细胞具有直接毒性。

氧化石墨烯减少了银纳米粒子引起的绒毛膜尿囊膜的形态变化。与纳米平台孵育48 小时后鸡胚绒毛膜尿囊膜的形态。 一 对照组（没有纳米颗粒的箔），b 涂有银纳米粒子的纳米平台，c 涂有氧化石墨烯的纳米平台，d 氧化石墨烯和银纳米粒子复合包覆的纳米平台

AgNPs 减少了白介素 6 和 8 的释放

抗体阵列用于分析由成纤维细胞合成的 40 种炎症蛋白的细胞培养基含量（图 6）。成纤维细胞释放的主要炎症蛋白是白介素 8（IL-8；图 6，点：E5、F5）和白介素 6（IL-6；图 6，点：E8、F8）。 AgNP 和 Ag-GO 纳米平台显着降低了 IL-8 的释放水平，而 GO 纳米平台没有这种效果。此外，GO 和 Ag-GO 纳米平台都降低了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF；图 6，点：G5、H5）的释放水平。 GO 和 Ag-GO 纳米平台还导致肿瘤坏死因子 β（TNF-β；图 6，点：A9、B9）的释放水平增加。有趣的是，AgNP、GO 和 Ag-GO 纳米平台显着降低了 IL-6 的释放水平。其他分析的蛋白质的释放水平没有改变。包含所有分析细胞因子列表的阵列图包含在附加文件 1：图 S1 中。

孵育24 h后成纤维细胞炎性细胞因子释放的抗体阵列分析。 一 对照组（没有纳米颗粒的箔），b 涂有银纳米粒子的纳米平台，c 涂有氧化石墨烯的纳米平台，d 涂有氧化石墨烯和银纳米颗粒的复合材料的 Ag-GO 纳米平台。 AgNP 和 Ag-GO 纳米平台降低了 IL-8 的释放水平（点：E5、F5）。 GO 和 Ag-GO 纳米平台都减少了 GM-CSF 的合成（点：G5、H5）。此外，GO 和 Ag-GO 纳米平台导致 TNF-β 合成增加（点：A9、B9）。 AgNP、GO 和 Ag-GO 纳米平台降低了 IL-6 的释放水平（点：E8、F8）。附加文件 1

讨论

在生物医学应用中，用于抗菌材料的纳米材料的安全性与其杀灭细菌的效率一样重要。在这项研究中，我们表明含有 GO 的涂层材料可以有效降低纳米材料的毒性。涂有AgNPs和GO（Ag-GO）的聚氨酯箔不仅提高了其抗菌性能，而且降低了它们在人体细胞中的毒性。

拉曼光谱用于分析氧化石墨烯的结构特征。拉曼光谱中的 G 波段对应于 sp ² 杂化碳基材料[26]。由于氧官能团的结合，D 峰与缺陷或晶格紊乱有关 [27]。 D 波段的强度与 sp ² 的大小有关 面内域 [26]。附加带 D' 源于碳材料石墨结构中存在的缺陷。 ID/IG 比值（根据 D 和 G 带的强度计算）可用于表征碳材料中石墨结构的无序。正如所证明的，由于石墨粉氧化过程中形成的结构中有许多官能团，GO具有高度无序的结构[28]。

在ATR模式下收集的氧化石墨烯的FT-IR光谱显示GO结构中存在很多官能团，包括羧基和环氧基，峰值在1720 cm ^{− 1} 和 915 cm ^{− 1} , 环氧树脂 (C–O–C) 可见峰在 1200 cm ^{− 1} , 和 C–H 键（峰值在 2800 cm ^{− 1} ）。 FT-IR 分析与对 GO 进行的 XPS 测量非常一致，其中还鉴定了羟基、羧基、环氧基和羰基 [29]。

纳米材料的涂层是通过超声波技术进行的，这已被证实是一种有效的方法，可以用包括 AgNPs 在内的抗菌和杀菌物质对各种材料进行涂层 [30, 31]。超声波通过产生和破坏空化气泡来利用空化现象，产生高能量和压力 [​​32]。加速到高速的纳米材料与涂层材料碰撞并沉积在表面 [33]。然而，纳米材料沉积的效率不仅可以通过使用适当的涂层方法来提高，还可以通过使用更容易附着在表面上的纳米材料制成复合材料来提高。 GO 是一种有利的纳米材料，可用于创建具有不同纳米材料和表面的稳定复合材料。由于其独特的结构，碳原子呈六边形图案，附近有许多含氧官能团，包括羧基和羟基，GO 容易形成共价键或静电相互作用 [34]。通常，GO-纳米颗粒复合材料是通过金属离子或金属纳米颗粒通过静电或共价相互作用连接到 GO 表面来合成的。此外，进行金属离子和/或 GO 的还原以形成共价键 [35]。通过原位还原 Ag ⁺ 使用超声波处理制备了 Ag-GO 复合材料 [36, 37]，以及通过沉积 AgNPs [12]。在我们之前的报告中，我们表明超声波方法可用于在聚氨酯箔上合成 Ag-GO 涂层纳米平台 [25]。然而，超声处理不仅导致用纳米材料涂覆聚氨酯箔，而且导致形成 Ag-GO 复合材料。 Ag-GO复合物的形成，甚至在涂覆箔之前，都可能导致涂覆后AgNPs的稳定性更高。

在我们的研究中，成纤维细胞和 HUVEC 用于细胞毒性研究，然后分析鸡胚胎绒毛膜尿囊膜。与体内分析相比，皮肤成纤维细胞被认为是皮肤刺激研究的良好模型 [38]，而内皮细胞，包括 HUVEC 细胞毒性，由于纳米颗粒在生物医学应用中可能直接接触以及这些细胞对纳米颗粒的敏感性，经常被研究[38]。 39, 40]。鸡胚绒毛膜尿囊膜是啮齿动物模型的替代体内模型，可用于各种毒理学研究，包括材料毒理学和急性毒理学研究 [41, 42]。

成纤维细胞和 HUVEC 在 Ag-GO 上生长时比在 AgNP 涂层的纳米平台上具有更高的活力。此外，AgNP 纳米平台导致绒毛膜尿囊膜的形态变化，而在 GO 和 Ag-GO 纳米平台的情况下，细胞形态与对照组相当。 Ag-GO 纳米平台上毒性的降低可能是由于 AgNPs 在与 GO 的复合物中具有更高的稳定性和 AgNPs 在纳米平台中更好的沉积的综合作用。在纳米粒子通过直接穿透或内吞作用进入细胞后，动物细胞的毒性通常更加严重[43]。纳米颗粒内吞作用取决于大小和形状。与尺寸约为 45 nm 的颗粒相比，较大的颗粒和复合材料被吸收的程度更小 [44]。内吞作用与纳米材料的形状或尺寸之间最显着的关系是碳壁纳米管的特征。长度小于 1 μm 的纳米管通过直接扩散有效地穿透质膜，而吞噬作用或内吞作用途径内化较长的纳米管和团聚体 [45]。最近，Ag-GO 纳米复合材料被 J774 巨噬细胞内化，比 AgNPs 少约 60%。然而，由于 Ag-GO 诱导了更多的 ROS，因此细胞的整体毒性更高 [46]。此外，纳米粒子形状相关内化的动力学分析表明，球形纳米粒子的内化速​​度通常比扁平粒子快得多 [47]。此外，纳米粒子对人体细胞的毒性通常取决于大小，其中较小的粒子显示出更强的细胞毒性。在关于 AgNPs 对 RAW 的尺寸依赖性细胞毒性的研究中，264.7 巨噬细胞和 L929 成纤维细胞纳米颗粒在用 20-nm AgNPs 处理后的活力低于用更大的纳米颗粒 (80, 113 nm) 处理后的活力 [13]。因此，Ag-GO 复合材料的尺寸增加和细胞吸收纳米颗粒的能力降低，这可能是在 Ag-GO 纳米平台上培养的 HUVEC 和成纤维细胞的存活率更高的原因。

AgNP 和 Ag-GO 纳米平台显着降低了成纤维细胞对 IL-8 的释放水平。 GO 和 Ag-GO 纳米平台导致 TNF-β 的释放增加。此外，AgNP、GO 和 Ag-GO 纳米平台减少了 IL-6 的释放。有趣的是，成纤维细胞合成促炎蛋白的变化与细胞在涂有 AgNPs 或 GO 的纳米平台上的孵育有关。在 Ag-GO 上培养的细胞的合成水平与在仅涂有这些纳米材料之一的纳米平台上培养的细胞的合成水平没有区别，表明复合材料合成后生物活性没有改变。成纤维细胞通过启动炎症反应并促进从急性炎症到组织修复的转变，在炎症和重塑过程中很重要 [48, 49]。因此，分析成纤维细胞分泌的炎性细胞因子对于预测对纳米平台的免疫反应很重要。 IL-6 和 IL-8 都是关键的炎性细胞因子之一，在被成纤维细胞合成后，会导致免疫反应的激活 [50, 51]。用 AgNPs 处理后，人表皮角质形成细胞的 IL-6 合成水平降低 [52]。类似地，在 Jurcat 细胞中证明了 AgNPs 对 IL-6 释放的抑制，并涉及 MAPK 途径。 AgNPs 还降低肿瘤坏死因子 α (TNF-α) 的合成水平 [53]。 TNF-α 和结构和功能非常相似的 TNF-β 是炎症细胞因子，在急性炎症阶段很重要。虽然免疫细胞主要负责在炎症的急性期释放这些蛋白质，但在伤口愈合的早期过程中，成纤维细胞和不同的细胞参与炎症细胞因子的合成 [54]。使用 RAW264.7 巨噬细胞证明了用 GO 处理后诱导 TNF-α 的活性 [55]，这表明免疫刺激。然而，在我们的研究中，在 GO 和 Ag-GO 纳米平台上培养细胞后，大多数分析的促炎蛋白的释放水平没有改变。因此，这些分析表明GO和Ag-GO纳米平台都具有良好的生物相容性，不会导致强烈的免疫反应。

结论

总之，所呈现的结果表明涂有Ag-GO复合材料的纳米平台显示出更强的S生长抑制。肠炎 比 AgNP 和 GO 涂层的纳米平台。此外，与涂有 AgNPs 的纳米平台相比，Ag-GO 复合材料显着降低了对成纤维细胞、HUVEC 和鸡胚绒毛膜尿囊膜的细胞毒性。当成纤维细胞和 HUVEC 在涂有 Ag-GO 纳米复合材料的纳米平台上孵育时，它们的细胞活力没有改变，显示出对 AgNP 毒性的抑制。这些结果与低免疫刺激一起表明 GO 可用于降低纳米复合材料中不同纳米材料的细胞毒性。此外，结果表明可以考虑将 Ag-GO 纳米平台用于生物医学应用。然而，还需要进一步的研究来评估 Ag-GO 纳米平台在特定应用中的应用，包括伤口敷料。

材料和方法

纳米材料涂层纳米平台的制备和表征

由纳米颗粒涂覆的聚氨酯箔制成的纳米平台的制备如前所述 [25]。方形聚氨酯箔（15 × 15 mm，0.05 mm厚）覆盖有AgNPs（HydroSilver1000，Amepox，Łódź，Poland）悬浮液，这些悬浮液是在Amepox开发的和/或GO合成的聚乙烯醇存在下通过化学还原反应合成的改良悍马的方法。在低于 10 °C 的温度下，将 10 克石墨粉与 230 ml 的浓硫酸（98%）（Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA）混合。随后，将 4.7 g 硝酸钠 (Sigma-Aldrich) 和 30 g 高锰酸钾 (Sigma-Aldrich) 添加到石墨混合物中，同时保持温度低于 10 °C。然后，将混合物加热至30 °C并搅拌2 小时。随后，加入100 ml水并用10 ml过氧化氢处理该混合物。通过过滤纯化GO并用去离子水洗涤直至滤液的pH值达到6.5。在去离子水中制备 GO、AgNPs 和 AgNPs 与 GO 的复合物 (Ag-GO) 的悬浮液。在包覆过程中，纳米材料的浓度如下：GO，200 mg/l； AgNPs，100 mg/l； Ag-GO，200 mg/l；和 AgNPs，100 mg/l。使用超声波喇叭（钛喇叭，Ø13 毫米，60% 效率，20 kHz；Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA）在 30 ± 1 °C 的温度下进行纳米粒子涂层。覆盖的样品在去离子水中冲洗并在无菌条件下干燥。之前已经报道了使用扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）和侧向力显微镜（LFM）对纳米平台进行表征，显示纳米平台几乎完全被纳米材料覆盖[25]。

用于获得纳米平台的纳米材料使用透射电子显微镜 (TEM) 成像。 TEM 图像是使用 JEM-1220 显微镜（JEOL，东京，日本）在 80 kV 和 Morada 11 兆像素相机（Olympus Corporation，东京，日本）下获得的。通过将水胶体液滴置于涂有formvar的铜网上（Agar Scientific，Stansted，UK）上制备样品，在观察前让其风干。

使用具有 532 nm 激光源（Wotton-under-Edge，UK）的 Renishaw inVia 光谱仪收集拉曼光谱。为避免加热样品，激光功率保持较低（0.3 mW，在样品上校准）。使用拉曼映射模式，扫描面积约为 10 × 10 μm，包含 25 个光谱）。每个光谱由两个主要波段组成，一个 G 波段 (~ 1578 cm ^{− 1} ) 和 D 波段 (~ 1347 cm ^{− 1} )，使用洛伦兹线形拟合。 FT-IR 测量使用 Nicolet iS10 光谱仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）以衰减全反射模式在金刚石晶体上进行。氧化石墨烯悬浮液在室温下在聚乙烯表面干燥以产生 GO 薄箔。光谱采集范围为 400–4000 cm ^{− 1} .

Zeta potential measurements of GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were carried out with a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, UK) at 25 °C, using the Smoluchowski approximation. Nanomaterials were sonicated for 30 min and zeta potential was immediately measured. Subsequently, nanomaterials were left for 24 h at room temperature and the zeta potential was measured again. Each measurement was repeated at least seven times after 60 s of stabilisation at 25 °C.

The hydrodynamic diameter of nanoparticles in water and their size distribution were measured with dynamic light scattering (DLS) using a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern). Similar to for the zeta potential analysis, GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were sonicated for 30 min and left for 24 h at room temperature. Each sample was measured at least seven times at 25 °C.

Bacterial Cultivation

Salmonella enteritidis subspecies enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076) was obtained from LGC Standards (Łomianki, Poland). The bacteria were grown on tryptic soy agar (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). The bacteria, grown on agar plates, were harvested by gently washing the plates with sterile distilled saline solution. To calculate the number of bacteria in the cell suspension, the optical density of the suspensions at 600 nm (OD600) was measured using a spectrophotometer (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA). A calibration curve was prepared by performing serial tenfold dilutions of bacterial suspensions of a known optical density, up to 10 ^− 5 . After 24 h of incubation at 37 °C, the number of formed colonies was enumerated and the number of colony-forming units (CFU) of the original bacterial suspension was calculated.

Bacteria Viability Assay

Viability was evaluated using a PrestoBlue Cell Viability Assay (Thermo Fisher Scientific). Bacteria were cultured onto foils coated with GO, AgNPs and Ag-GO, located on inserts inserted into six-well plates (200 μl MH broth with 5 × 10 ³  CFU per foil) and incubated for 24 h. Subsequently, 90 μl of each sample was transferred to 96-well plates and 10 μl of PrestoBlue reagent was added to each well and incubated for an additional 2 h at 37 °C. The optical density of each well was recorded at 570 nm using a microplate reader (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA). Bacteria viability was expressed as the relative value after substitution of the absorbance from the blank samples. Experiments were repeated three times.

Scanning Electron Microscopy Analysis

Bacteria were incubated on foils with Ag-GO and a sterile cover glass. Bacteria cultures (100 μl, 10 ⁶  CFU/ml) were incubated on foils and a cover glass for 24 h at 37 °C. All samples were dried and covered with gold. Cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) and contrasted with 1% osmium tetroxide (Sigma-Aldrich) and 1% carbohydrazide (Sigma-Aldrich). Subsequently, cells were dehydrated in increasing concentrations of hexylene glycol (Sigma-Aldrich). Drying was performed using a Polaron CPD 7501 critical point dryer (Quorum Technologies, Laughton, UK). Finally, the samples were imaged with a SEM (FEI Quanta 200, Tokyo, Japan) at an acceleration voltage of 15 kV.

Human Cell Lines

Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs; catalogue number:C0035C) and human fibroblasts (catalogue number:C0135C) were obtained from Thermo Fisher Scientific. HUVECs were maintained on low-serum Medium 200 basal media supplemented with Large Vessel Endothelial Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific), whereas fibroblasts were cultured in low-serum Medium 106 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with Low Serum Growth Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1× penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific). Cells were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO2/95% air.

To analyse biological interactions, the nanoplatforms were put into six-well plates. After detachment from the cell culture flask, HUVECs or fibroblasts were placed directly on the nanoplatform with 100 μl of growth media. To avoid the media drying during incubations, plates were kept in humidity chambers.

Analysis of Nanoplatform Toxicity to HUVECs and Fibroblasts

To analyse HUVEC and fibroblast viability on the nanoplatforms, cells were cultured in the droplet directly on the nanoplatforms or uncoated foil (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). After 24 h of incubation, cell viability was analysed using a PrestoBlue assay (Thermo Fisher Scientific). PrestoBlue reagent was incubated with assessed cells for 2 h in a cell culture incubator. Subsequently, 50 μl of growth media with PrestoBlue reagent was transferred to a 96-well plate where fluorescence (excitation λ  = 560 nm, emission λ  = 590 nm) was analysed using a Tecan Infinite 200 microplate reader (Tecan, Durham, USA). Cell viability was expressed as the relative value after substitution of the fluorescence from blank samples. Experiments were repeated three times.

Fibroblast morphology was observed using an inverted optical microscope (Olympus Corporation) using phase contrast. Fibroblasts were seeded in 35-mm diameter Petri dishes directly on the nanoplatforms (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). Images were taken after 24 h of incubation.

Chorioallantoic Membrane Assay

Fertilised eggs from Ross 308 hens were obtained from a certified hatchery and kept for 4 days at 12 °C. The eggs were cleaned, sterilised with UVC light and divided into four groups (4 × 20 eggs). Embryos were incubated at standard conditions (temperature 37 °C, humidity 60% and turned once per hour). At 8 days of embryonic development, small holes (1 cm ² ) were made in the shell above the air space, the inner membrane was gently striped off and the nanoplatforms were placed on the chicken embryo chorioallantoic membrane. Subsequently, chicken embryos were incubated for the next 48 h, when nanoplatforms were cut out with the chorioallantoic membrane that was directly below the nanoplatform. The chorioallantoic membrane on the nanoplatforms was imaged using a stereoscopic microscope (SZX10, Olympus Corporation).

Antibody Array Analysis

An analysis of inflammation cytokines in fibroblast growth medium was performed using an antibody array (Abcam, Cambridge, UK; catalogue number ab134003). Fibroblast cells (1 × 10 ⁴ ) were incubated on nanoplatforms coated with AgNPs, GO, Ag-GO and uncoated foil with 100 μl of media. After 24 h, 80 μl of growth medium was collected. For each experimental group, the growth medium from six foils was used for analysis. Pooled growth medium from the six experiments was centrifuged (1600 rpm for 5 min), and 500 μl of growth media was diluted in 500 μl of PBS. Therefore, 1 ml of diluted growth media was used per each analysed membrane. The assay was performed in accordance with the manufacturer’s instructions. Diluted growth media was incubated with the membranes for 24 h at 4 °C. Subsequently, antibodies conjugated with biotins were added and incubated for the next 24 h at 4 °C. In the next step, the membranes were incubated with streptavidin conjugated with horseradish peroxidase for 2 h at room temperature. Membranes were visualised after the addition of the provided horseradish peroxidase substrate using a ChemiDoc imaging system (Bio-Rad, Hercules, USA).

Statistical Analysis

Data were analysed using one-way analysis of variance with GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Differences between groups were tested with Tukey’s HSD post hoc tests. Results are shown as means with standard deviations. Differences at P  < 0.05 were considered significant.

数据和材料的可用性

The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

缩写

Ag-GO:

Composite of silver nanoparticles and graphene oxide

AgNPs:

Silver nanoparticles

CFU:

Colony-forming units

DLS：

动态光散射

FT-IR：

傅里叶变换红外光谱

GM-CSF:

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

开始：

氧化石墨烯

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cells

IL-6:

Interleukin 6

IL-8:

Interleukin 8

SEM：

扫描电子显微镜

TEM：

透射电子显微镜

TNF-α：

Tumour necrosis factor alpha

TNF-β:

Tumour necrosis factor beta