石榴皮绿色合成银纳米颗粒：高效抗菌与结肠癌细胞毒性

摘要

耐药微生物与肿瘤发病率上升亟需创新方案。本研究利用水溶性石榴皮提取物——一种常见农业废弃物，实现了银纳米颗粒的环境友好型合成。溶液由无色转为深褐色，经紫外-可见光谱（等离子体峰 378 nm）和 X 射线衍射（立方结构）确认，获得球形 AgNPs，直径 20–40 nm（平均 26.95 nm）。颗粒对革兰氏阴性和阳性病原菌均表现出强抗菌活性，包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。RKO 结肠癌细胞系细胞毒性测试显示，12.5 µg mL⁻¹ AgNPs 处理第 3 天细胞存活率 56%，第 5 天 61%。结果凸显石榴源 AgNPs 作为双重抗菌和抗癌药物的潜力。

研究背景

纳米技术的快速发展聚焦绿色合成——利用植物提取物制备 100 nm 以下纳米颗粒，适合药物递送和生物医学应用。与昂贵的化学或物理路线不同，绿色法成本低、无毒，利用蛋白质、酶、碳水化合物等天然还原剂。此法制得的银纳米颗粒（AgNPs）因高比表面积和比银离子更高效穿透细菌细胞，显示出优异抗菌效力。

医院获得性感染常由革兰氏阴性和阳性菌引起，急需新抗菌策略。近期研究表明 AgNPs 可与传统抗生素协同增效。此外，AgNPs 对多种癌细胞系表现出细胞毒性，成为抗癌治疗的候选者。

本研究聚焦于利用石榴皮提取物合成 AgNPs，评估其对临床相关病原菌的抗菌效力，并考察对结肠癌细胞系的细胞毒性。

实验方法

石榴皮提取液制备

1 kg 沙特塔伊夫产石榴清洗、去皮、干燥、研磨成粉。10 g 粉末浸泡于 100 mL 双蒸水中，室温 24 h，Whatman No.1 滤纸过滤得水提液，全程无菌操作。

AgNPs 合成

0.1 mM 硝酸银溶于 250 mL 双蒸水，加入 10 mL 皮提取液，振荡 5 min。24 h 后观察到无色至深褐色变化，标志 Ag⁰ 形成。15,000 rpm 离心 15 min，重复 4 次，得纯化 AgNPs 供后续分析。

表征

Perkin Elmer Lambda 950 记录 200–800 nm UV-Vis 谱（24、48、72 h）。XRD（PANalytical）测定晶体结构。TEM（JEOL JEM-1230）和 SEM（JSM 6380 LA）观察形貌尺寸；EDX（JED 2200）定量元素组成。

抗菌实验

菌悬液制备

临床分离株（大肠杆菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌 ATCC 27584、普通变形杆菌 ATCC 8427、伤寒沙门氏菌 ATCC 14028、金黄色葡萄球菌 ATCC 29213、表皮葡萄球菌 MTCC 3615、肺炎克雷伯菌）复苏、营养琼脂培养，调制至 10⁶ CFU mL⁻¹。

琼脂孔扩散法

孔内加入 25、50、75、100 µL AgNPs 悬液。37 °C 培养 24 h，测量抑菌圈直径。每实验重复 3 次。

细胞毒性实验

细胞增殖

RKO 结肠癌细胞（ATCC CRL-2577）以 5×10³ cells mL⁻¹ 接种 96 孔板，处理 0.3–100 µg mL⁻¹ AgNPs。第 3、5 天进行 Alamar Blue 测定，读取相对荧光单位。

凋亡/坏死分析

经 1.5–25 µg mL⁻¹ AgNPs 处理 5 天后，荧光素/溴化乙锭（AO/EtBr）染色，荧光显微镜下鉴别活、凋亡、坏死细胞。

统计分析

GraphPad Prism 6.0 单因素方差分析，p < 0.05 为显著差异。

结果与讨论

绿色合成顺利进行，颜色变化确认 AgNPs 形成。UV-Vis 谱显示特征等离子体峰 378 nm，强度随时间增加，反映纳米颗粒浓度升高。

XRD 图谱与面心立方银结构匹配（JCPDS No. 04-0783）。TEM 显示均匀分布的球形颗粒，20–40 nm，平均 26.95 nm。SEM 确认相似形貌，EDX 显示 70% 银含量（重量），证实合成成功。

抗菌测试显示剂量依赖性抑菌圈。革兰氏阴性菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌）和阳性菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌）均被抑制，100 µL 浓度效果最显著。值得注意的是伤寒沙门氏菌敏感性较低，与前人报道一致。

细胞毒性实验显示，12.5 µg mL⁻¹ AgNPs 处理第 3 天 RKO 细胞存活率降至 56%，第 5 天 61%。AO/EtBr 染色确认凋亡和自噬相关改变，表明这些纳米颗粒可触发结肠癌细胞程序性死亡通路。

结论

石榴皮提取物作为有效、可持续的还原剂，制得适合药物递送的最佳尺寸（20–40 nm）AgNPs。合成颗粒在低浓度下对临床相关病原菌谱展现强抗菌活性，并对结肠癌细胞显示显著细胞毒性。这些发现将绿色合成 AgNPs 定位为双重抗菌和抗癌治疗开发的有前景候选者。

缩略语

EDX

能量色散 X 射线能谱

SEM

扫描电子显微镜

TEM

透射电子显微镜

XRD

X 射线衍射