从石榴皮提取物中合成的银纳米粒子的抗菌和细胞毒性作用

背景

在过去的几十年里，纳米技术的研究越来越多，特别是涉及纳米颗粒的绿色合成和表征，因为尺寸小于 100 纳米的纳米颗粒是药物输送和生物医学应用的理想药物 [1]。纳米粒子的合成在多个领域发挥着重要作用，包括纳米技术、生物技术、化学加工、物理方法、系统工程、分子马达、纳米晶体和纳米生物材料 [2]。目前存在三种纳米颗粒生产方法——化学、物理和“绿色”路线，其中绿色路线涉及使用生物还原剂，包括植物提取物和微生物滤液。前两种方法通常成本高昂且会产生有毒副产物，但绿色纳米合成方法已被公认为廉价且环保的工艺[3,4,5]。

在 NPs 的绿色合成中，植物成分，包括蛋白质、酶和碳水化合物，用于配制可以轻松与目标生物分子相互作用的纳米颗粒 [6]。这种合成银纳米粒子的方法可能在未来治疗各种形式的癌症或其他可由植物纳米技术控制的疾病中发挥重要作用 [7, 8]。革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌 , 铜绿假单胞菌 , 和普通变形杆菌 和革兰氏阳性病原体，例如金黄色葡萄球菌 和S。表皮 , 是造成大多数医院获得性感染的原因 [9]。事实上，手术感染，包括肺炎和血流感染，也是由于存在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌[10]。植物介导的 AgNPs 合成有助于开发针对公共卫生相关微生物病原体的有效抗菌剂。最近，已经注意到合成的 AgNPs 可以与抗生素左氧氟沙星产生协同关系，增加总抗菌活性 [11]。许多研究人员报告说，合成的 AgNPs 含有众所周知的抗革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体的抗菌特性，以及对不同癌细胞和正常细胞系的细胞毒性作用 [12,13,14]。此外，与单独的银离子相比，AgNPs 具有高表面积与体积比的高效性，易于破坏，并具有穿透细菌细胞的能力[13]。

目前的研究重点是利用石榴的水提取物绿色合成AgNPs 在 37°C 下孵育 24 小时后，通过使用条纹板和最小抑制浓度 (MIC) 测量来研究它们的抗菌性能。革兰氏阴性菌E。大肠杆菌 (ATCC 25922)，P。绿脓 (ATCC 27584)，P。普通话 (ATCC 8427) 和伤寒沙门氏菌 (ATCC 14028) 以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 (ATCC 29213)，S。表皮 (MTCC 3615) 和 K。肺炎 进行了研究以测试合成的 AgNPs 的潜在生长抑制作用。此外，测试了对结肠癌细胞系（RKO：ATCC® CRL-2577™）的细胞毒性作用，并显示出在第 3 天的细胞存活率为 56%，在第 5 天的细胞存活率为 61%，使用 12.5 μg 的 AgNPs。

方法

果皮提取物的制备

一公斤沙特石榴果实（Punica granatum ——沙特阿拉伯王国塔伊夫地区栽培）购自沙特阿拉伯利雅得超市。水果先用自来水冲洗几次，然后用双蒸水 (DDH2O) 冲洗。洗涤后，小心地去除果皮。石榴皮用 DDH2O 彻底冲洗以避免任何表面污染，并在室温下完全干燥。最后，将果皮研磨成细粉。在室温下将 10 克细粉浸泡在 100 毫升 DDH 2 O 中 24 小时。使用Whatman No.1滤纸过滤所得混合物以获得水提取物。整个过程在无菌条件下进行。

AgNPs的合成过程

硝酸银（AgNO3；0.1 mM）与 250 mL DDH2O 混合。然后，加入 10 毫升石榴皮提取物水溶液，并使用振荡培养箱充分混合溶液 5 分钟。发现反应混合物的颜色在 24 小时后从无色溶液变为棕色溶液，表明银离子还原为银纳米颗粒。然后将纳米颗粒溶液以 15,000 RPM 离心 15 分钟，并将该过程重复四次。最后，收集纯化的 AgNPs，并进行进一步的分析以分析合成的 NPs 的特性和生物活性。将多余的果皮提取物储存在 4°C 以供进一步分析。

AgNPs 的特征

使用 Perkin Elmer Lambda 950 UV/Vis/NIR 分光光度计在 200 至 800 nm 反应开始后 24、48 和 72 小时以 1 nm 的分辨率监测石榴皮水提取物对银离子的还原.通过 PANalytical X 射线衍射仪获得 XRD 图案，扫描速度范围为 20 至 50，2θ 并用于确定银纳米颗粒的晶体结构。

使用在 JEOL JEM-1230（JEOL，Tokyo，Japan）和 JSM 6380 LA SEM 上进行的 TEM 分析完成 AgNP 的表面形貌和成分分析，分辨率为 3.0 nm。使用JED 2200系列（Jeol）通过能量色散X射线光谱（EDX）对AgNPs进行元素分析。

抗菌研究

菌悬液制备

细菌菌株E。大肠杆菌 (ATCC 25922)，P。绿脓 (ATCC 27584)，P。普通话 (ATCC 8427)，S。伤寒 (ATCC 14028)，S。金黄色葡萄球菌 (ATCC 29213)，S。表皮 (MTCC 3615) 和 K。肺炎 来自沙特阿拉伯王国利雅得的哈立德国王医院。细菌细胞的快速鉴定是根据先前发表的方法进行的 [15]。将所有鉴定的培养物转移到琼脂培养基上并储存在 - 20°C 直至研究需要。此时，将每个细菌菌株接种到无菌营养琼脂中，并在 37°C 下培养 24 小时。暂停（10 ⁶ CFU/mL) 是通过将一圈接种物从 24 小时培养的培养物中转移到 5 毫升营养肉汤中并在 37°C 下培养 2 小时来制备的。

抗菌检测

使用琼脂孔扩散法进行抗菌活性测定 [16]。用新鲜细菌悬浮液润湿无菌拭子并铺展在固体无菌穆勒-欣顿琼脂平板上。使用软木钻孔器在琼脂板上打孔。将不同浓度（25、50、75 和 100 μL）的合成纳米颗粒悬浮液倒入每个连续孔中。所有板在 37°C 下孵育 24 小时。在每个孵育板中的每个孔周围测量抑制区 (mm)。每个实验进行3次重复[17]。

细胞增殖分析

如前所述[12]，使用Alamar Blue测定法评估AgNPs对细胞增殖的影响。

简而言之，0.005 × 10 ⁶ 将细胞/孔接种在具有不同浓度 (100–0.3 μg/mL) 的 AgNP 的 96 孔板中，并在 37°C 下孵育 2 至 5 天。培养基 DMEM 添加了 4500 毫克/升 d-葡萄糖、4 mM l-谷氨酰胺、110 毫克/升丙酮酸钠、10% 胎牛血清 (FBS)、1x 青霉素-链霉素和非必需氨基酸（均购自美国 Gibco-Invitrogen）。对照孔仅用培养基处理，并在第 3 天和第 5 天测量细胞增殖。在这些时间点，将 Alamar Blue (1:10) 添加到每个孔中，并将板在 37°C 下孵育 4 小时;然后，使用分光光度计酶标仪（Biotek Synergy 2；Biotek Instruments，USA）读取平板，记录相对荧光单位（RFU）。

细胞凋亡/坏死分析

为了确定细胞凋亡/坏死，用不同浓度 (25–1.5 μg/mL) 的 AgNPs 处理细胞。在第 5 天，用含有 100 μg/mL AO（吖啶橙）和 100 μg/mL EtBr（溴化乙锭）（AO/EtBr，Sigma，St. Louis，MO）的双荧光染色溶液（1 μL）对细胞进行染色）。染色的细胞暴露于 AO/EtBr (1:100) 染料溶液 1 分钟，并使用 Nikon Eclipse Ti 荧光显微镜观察。将结果与实验对照进行比较。 AO/EtBr 是两种染料的组合，有助于观察染色质组织异常的细胞。 AO/EtBr 的差异吸收允许识别活细胞和非活细胞。尤其是AO用于显示发生凋亡的细胞数量。

统计分析

使用 Microsoft Excel 2010 和 GraphPad Prism 6.0 软件（GraphPad，San Diego，CA，USA）进行统计分析和绘图。 P 使用单向方差分析多重比较计算值。以P显着性水平检验不同浓度的抗菌数据分析 <0.05.

结果与讨论

使用石榴皮的水提取物作为还原剂来源成功合成了 AgNPs。图 1a 显示了将 0.1 mM 硝酸银溶解在 250 mL DDH2O 中以制成无色溶液。然后，加入 10 mL 水性果皮提取物并充分混合，反应混合物在 24 小时内缓慢变为深棕色，如图 1b 所示。据报道，当使用几种类型的植物部分提取物（如叶、花、果皮、种子和果实）时，在 AgNPs 合成过程中观察到的颜色变化与类似反应有关。颜色变化是由于 AgNO3 与植物源相互作用并从硝酸银还原为元素银 [18,19,20,21,22]。

一 0.1 mM 硝酸银。 b P 后颜色变化。石榴 添加果皮提取物

图 2 显示了使用石榴皮水提取物合成的 AgNP 的 UV-Vis 光谱。如图 2 所示，吸收带在 24、48 和 72 小时的反应时间在 378 nm 处具有峰值，强度分别为 0.96、1.08 和 1.16。强度随着时间的推移而增加，因为反应有更多的时间发生，导致 AgNPs 的浓度更高。表面等离子共振数据表明，随着时间的推移，AgNPs 浓度的增加导致 AgNP 峰的增加，同时与还原银量的增加相吻合。由于石榴提取物中的电子释放，AgNO3 反应形成 AgNPs，同时反应开始氧化抗坏血酸自由基。在从石榴皮提取物中制备 AgNPs 的另一项研究中观察到类似的 UV-Vis 吸收光谱，吸收峰位于 371 nm [23]。

合成的 AgNPs 在 48 至 72 小时的时间间隔内的紫外-可见吸收光谱

绿色合成的 AgNPs 的 XRD 图如图 3 所示。在 2θ 处观察到六个强烈的衍射峰 范围从 0 到 90 的值，表明我们可以分配具有中心 Ag 离子的面立方体的 111、200、220 和 311 平面。 XRD 谱表明合成的 AgNPs 形成了晶体结构。该结果与先前在 JCPDS 数据库 (No. 04-0783) 中公布的 XRD 模式一致。观察到的不明结晶峰 (*) 对应于氧化银 [24]。 0.1-mM 石榴皮 NPs 的 TEM 图像如图 4 所示。该图像显示颗粒呈球形，直径范围为 20 至 40 纳米，平均粒径为 26.95 纳米。使用美味猕猴桃纳米合成纳米颗粒也有类似报道 水果提取物[25]。合成的 AgNPs 的 SEM 观察（图 5）显示银纳米颗粒在石榴皮细胞表面上的分布相等。从该图像中，确定纳米颗粒是球形的，直径范围为 20 到 40 纳米，这类似于之前使用Raphanus sativus 生产的直径范围为 34 到 50 纳米的球形 AgNP 的报告 L.果皮提取物[26].

来自 P 的合成 AgNPs 的 XRD 图。石榴 果皮提取物

来自 P 的合成 AgNP 的 TEM 图像。石榴 果皮提取物

来自 P 的合成 AgNPs 的 SEM 图像。石榴 果皮提取物

在使用此处介绍的石榴皮提取物合成银纳米颗粒时，所获得的纳米颗粒的尺寸非常适合用于药物递送。据报道，小于 100 nm 的纳米颗粒的尺寸在智能系统的开发中发挥作用，增强了治疗和成像价值，以及将药物输送到特定组织以提供控释治疗 [27]。纳米颗粒的大小和形状影响药物在靶组织中的生物利用度。据报道，与直径为 1 微米的颗粒相比，100 纳米的纳米颗粒的吸收率高 2.5 倍 [28、29]。纳米颗粒的大小在颗粒功能中起着关键作用，例如降解、血管动力学、靶向、清除和摄取机制 [30]。此外，据报道，合成的 AgNPs 的纳米晶体性质改善了生物分布和药代动力学 [31, 32]。如前所述[33]，石榴生物质废物的利用将成为废物利用的一种新途径。

EDX 研究的数据提供了合成纳米颗粒中元素的定性和定量分析，如图 6 所示。EDX 研究提供了合成 NPs 含量的元素分解，并估计 NPs 由 70% 组成按重量计 Ag。结果中确定的其他元素和键包括 C-K、O、C-U、Cu 和 K，每种元素都对应于总质量的一小部分。 EDX 报告提供的证据表明，0.1 mM AgNO3 的低浓度导致大量合成的 AgNP。将 0.3 mM AgNO3 倒入蒸馏水中 3 小时并加热至 300°C，以及将 1、2 和 3 克石榴皮提取物与 30 毫升蒸馏水混合并加热至 80°C，也报告了类似的结果[34].

来自 P 的合成 AgNPs 的 EDX 图像。石榴 果皮提取物定量分析

通过琼脂孔扩散测试，使用 25、50、75 和 100 μg/mL 样品研究了石榴合成的 AgNPs 对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗菌特性。带有革兰氏阴性菌 E 的琼脂平板。大肠杆菌 ，S。伤寒 , 和铜绿假单胞菌 抑制区如图 7a-c 所示。低浓度的石榴合成 AgNP（25 和 50 μL）显示出对 P 的抑制活性。绿脓 和E。大肠杆菌 但不反对S。伤寒。 先前已经报道了石榴产品的类似抗微生物作用，其中观察到对E的最强抑制作用。大肠杆菌 ，S。金黄色葡萄球菌 , 和 P。绿脓 [35,36,37]。

革兰氏阴性病原体 (a) 的 AgNPs 的抗菌作用和抑菌圈 –c )

革兰氏阳性病原体 (d) 的 AgNPs 的抗菌作用和抑菌圈 –f )

图 8a-c 显示了合成的 AgNPs 对革兰氏阳性病原体 K 的抗菌活性。肺炎 ，S。金黄色葡萄球菌 , 和 S。表皮 .即使在低 AgNP 浓度（25 和 50 μL）下，K 也能观察到抗菌活性。肺炎， 抑制区分别为 9 和 14 nm，并且针对 S。金黄色葡萄球菌 ，抑制区分别为 6 和 14 nm。早期的研究也证实了用合成的 NPs 处理的革兰氏阳性菌的生长抑制 [35,36,37,38]。暴露于合成的 AgNPs 后评估的抗菌活性显示出 7 至 21 毫米范围内的抑菌圈。图 9 显示了不同浓度（25 至 100 μL）的 P 的抑制作用。石榴 在 E 上剥离 AgNPs。大肠杆菌 ，P。绿脓 ，S。伤寒 ，K。肺炎 ，S。金黄色葡萄球菌 , 和 S。表皮 .即使在低浓度的 AgNPs 下，除S 外，所有微生物都具有良好的抗菌活性。伤寒 ，如前所述 [38]。

为了分析 AgNPs 的细胞毒性作用，使用了结肠癌细胞系（RKO：ATCC® CRL-2577™）。在第 3 天，我们发现 12.5-μg 处理的存活率为 56%，第 5 天的存活率为 61%。在> 12.5μg 处观察到增殖的总体显着降低（图 10a），并且在第 5 天。此外，AO/EtBr 染色图像通过显示菌落和细胞数量证实了增殖减少（图 10b）。有趣的是，我们可以观察到具有 12.5 μg 核周细胞质液泡的细胞（图 10b、c）；这个过程可能是溶酶体在自噬过程中降解以促进程序性细胞死亡的途径。然而，需要进一步的研究来证实 AgNP 对自噬功能的影响。在我们之前对使用茴芹合成的AgNPs的研究中 种子，我们还发现 12 μg AgNPs 通过增强细胞凋亡或坏死对 HCT116 细胞具有毒性 [12]。据报道，低浓度的 AgNPs 也能够诱导细胞凋亡 [39]。当前使用石榴石合成的AgNPs的实验 12.5 μg 的果皮提取物也显示出 55-62% 的毒性。此外，AO/EtBr染色揭示了通过自噬作用的程序性细胞死亡的清晰画面。

AgNPs对革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体的抗菌活性

AgNPs 的细胞毒性。 一 RKO 细胞的细胞增殖和活力分析。单向方差分析多重比较，***P <0.0005。 b RKO 细胞的凋亡/坏死分析。 c RKO细胞暴露于不同剂量的AgNPs

结论

本研究的结果表明，石榴皮提取物是合成尺寸范围为 20-40 nm（平均尺寸，26.95 nm）的银纳米颗粒的良好还原剂，这是有效药物递送和提高生物利用度的理想先决条件目标站点。合成的 AgNPs 对测试生物的抗菌活性，即使在低浓度的 AgNPs（25-100 μL）下，进一步证实了绿色合成的 AgNPs 的抗生素效率，用于开发治疗革兰氏阴性和革兰氏阴性菌的新型抗菌剂。 -阳性病原体。此外，观察到的 AgNPs 对结肠癌细胞系的细胞毒性作用以及在> 12.5 μg 的剂量水平下细胞增殖的减少进一步促进了 AgNPs 作为肿瘤的一线治疗。

缩写

EDX：

能量色散X射线光谱

SEM：

扫描电子显微镜

TEM：

透射电子显微镜

XRD：

X射线衍射