通过明胶酶刺激策略使用加载 Omniscan 的纳米颗粒作为口腔鳞状细胞癌的肿瘤靶向 MRI 造影剂

介绍

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤；由于OSCC的特殊位置，手术治疗不可避免地会影响口面部的功能和美观。 OSCC 的早期和准确诊断允许更多个体和适当的手术治疗，因此导致治疗后发病率降低以及患者预后更好。影响疾病治疗计划的正确诊断和分期需要使用影像学技术[1]。

MRI 是一种无电离辐射的非侵入性成像方式。它可用于提供软组织的高分辨率和三维图像。多参数 MRI 已在临床试验中进行测试，并被证明可用于肿瘤定位 [2]。虽然各种化合物已被评估为 MRI 造影剂，但钆 (Gd) 复合物仍然是最广泛使用的，并且几乎占目前临床应用的所有药剂 [3]。然而，现有的基于 Gd 的 MRI 造影剂不是肿瘤特异性的，无法提供对肿瘤的精确检测和表征。由于体积小，这些药物中的大多数能够分布在血管内和间质空间中，并通过肾脏滤过迅速排出[3]。为提高MRI造影剂在肿瘤组织中的特异性，延长其在血流中的循环时间，研究人员尝试设计合成多种新型MRI造影剂[4,5,6,7,8]。

最近，设计和研究了许多甲氧基-聚（乙二醇）（mPEG）和/或聚己内酯（PCL）相关的纳米颗粒（NP）[9,10,11]。这些纳米颗粒用于递送药物，它们通过增强的渗透性和保留作用，通过延长循环时间和增强肿瘤吸收来帮助药物溶解，改善治疗过程。 mPEG 和 PCL 是美国食品和药物管理局批准的共聚物，它们表现出非常低的免疫原性、抗原性和毒性，并被广泛研究用于医学应用 [12]。众所周知，当 NPs 用于医学、环境和化学工程领域时，生物相容性和生物降解性是重要的特性 [13, 14]。在我们之前的工作中，我们开发了一种基于 mPEG 和 PCL 的明胶酶刺激药物递送系统，在 mPEG 和 PCL 之间插入了肿瘤特异性明胶酶可裂解肽 [12]。治疗药物如多西紫杉醇、miR-200c 装载在该纳米颗粒上。体外和体内研究表明，药物可以特异性地递送到肿瘤组织中[15]。我们的 NPs 基于相对简单的肿瘤靶向策略。增强的渗透性和保留（EPR）效应可以将纳米颗粒积聚到肿瘤组织中。在肿瘤中广泛表达的明胶酶（基质金属蛋白酶-2/9 MMP2/9，胶原酶 IV）将分离纳米颗粒并释放负载的药物。与主动靶向策略不同，我们的 NPs 具有装载可变治疗和诊断药物的潜力，这将更加简单和通用。

在本研究中，我们在相同类型的 NPs 中加载了广泛使用的 MRI 造影剂 Omn [16]，以实现建立肿瘤靶向、生物相容性和可生物降解的 MRI 造影剂的目标。以Omn单独作为对照，在人口腔鳞状细胞癌异种移植模型中评价Omn-NPs作为MRI造影剂的有效性。

材料和方法

材料

甲氧基-聚乙二醇-NHS（mPEG-NHS，Mn 5000）购自北京建凯科技有限公司（中国北京）。明胶酶可裂解肽（序列：H2N-PVGLIG-COOH）由 Shanghai HD Biosciences Co（中国上海）合成。 Omniscan (Gadodiamide Injection) 购自 GE Healthcare (Ireland)。胶原酶IV购自Sigma（美国）。

Omn-Loaded Gelatinases-Stimuli NPs 的合成

明胶酶可裂解的共聚物 mPEG-Pep-PCL 和不含肽的 mPEG-PCL 是通过开环共聚反应合成的，与我们之前的工作 [17] 相同。 Omn-NPs 是通过双乳液溶剂蒸发技术配制的。简而言之，将 10 mg mPEG-Pep-PCL 共聚物溶解在 1 mL 二氯甲烷 (DCM) 中。然后分别加入0.1 mL、0.2 mL和0.3 mL Omn。将该混合物在 3 mL 3% (w/v) 聚乙烯醇 (PVA) 水溶液中通过超声处理 (XL2000, Misonix, Farmingdale, NY, USA) 乳化 60 s 以获得油/水 (o/w) 乳液.然后将该乳液在含有 0.5% (w/v) 的 5 mL 水溶液中通过 PVA 超声处理 60 s 进行乳化。形成的w/o/w乳液在室温下在通风橱中轻轻搅拌直至有机溶剂蒸发。过滤所得溶液以除去未掺入的药物。空白 NP 的制备方法与上述相同，但不添加 Omn。用10 mg的mPEG-PCL共聚物和0.2 mL的Omn按照相同的步骤合成了负载Omn的mPEG-PCL NPs（Con-Omn-NPs）。

纳米颗粒的粒径测量和形态学检查

Omn-NPs 和空白 NPs 的粒径和稳定性通过动态光散射 (DLS) (Brookhaven Instruments Corporation, USA) 测量。 Omn-NPs 和空白-NPs 保存在室温下。每 2 天通过 DLS 确定粒径以评估 Omn-NPs 的稳定性（总共 6 天）。这些值是单个样品三次重复测量的平均值。使用透射电子显微镜 (TEM) (JEM-100S, JEOL, Japan) 对 Omn-NPs 和空白-NPs 进行形态学检查。将一滴适当稀释的 NPs 悬浮液放在覆盖有硝酸纤维素膜的铜网上，并在室温下风干。标本观察前用1%（w/v）磷钨钠溶液负染。

载药量和封装效率

通过计算钆离子浓度分析Omn-NPs的载药量和包封率。一毫升 Omn-NPs 用浓硝酸分解，然后用稀硝酸稀释混合物。样品采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES，Optima 5300DV，PerkinElmer，USA）进行测试。

纳米粒对胶原酶反应的宏观变化和微观形态变化

将负载有 Omn 的 mPEG-PCL NPs (Con-Omn-NPs) 和 mPEG-Pep-PCL NPs (Omn-NPs) 与含有胶原酶 IV (0.34 mg/mL) 的 Hank 溶液在 37 °C 下孵育 24 小时。肉眼观察溶液透明度的变化。

Con-Omn-NPs 和 Omn-NPs（在有或没有胶原酶的情况下孵育）的微观形态评估是使用 TEM 进行的。对于透射电镜，将一滴纳米颗粒悬浮液置于覆盖有硝化纤维膜的铜网上，并在观察前风干。

在V itro C 细胞U 拍摄

人口腔鳞状细胞癌株（HSC3）由上海市第九医院友情提供。将肿瘤细胞以5×10 ⁵ 的密度接种于24孔板中 每孔细胞培养 24 h。然后将负载 Coumarin-6 的 mPEG-Pep-PCL NPs（12.5 μg/mL 由香豆素-6 计算）添加到培养基中，并在 37 °C 下孵育 0.5 和 1 小时。吸出培养液，用PBS洗涤3次。细胞用无水乙醇（每孔1 mL）固定20 分钟，然后用PBS洗涤3次。通过免疫荧光细胞化学和共聚焦激光扫描显微镜（LSM710，Carl Zeiss MicroImaging GmbH，Berlin，Germany）观察细胞。香豆素6的激发和发射波长为460 nm。

动物

所有动物实验均完全按照美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No.85-23，1985 年修订）中的指南进行，并获得伦理审查委员会的批准。南京大学医学院附属南京口腔医院动物研究所。 BALB/c小鼠（5-6 周，18-22 g）购自南京大学模型动物研究中心。每周两次监测动物健康，包括体重和皮肤状况。实验过程中未观察到溃疡、动物活动能力下降和体重减轻。

OSCC模型建立

肿瘤细胞在含有 10% 胎牛血清 (FBS)、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 Dulbecco's 改良 Eagle's 培养基 (DMEM) 中于 37 °C 和 5% CO2 和 95% 的湿润气氛中培养。空气。为了建立人 OSCC 异种移植模型，将人 OSCC 细胞 HSC3 (1 × 10 ⁶ 50 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的细胞被皮下接种到裸鼠（每组3只小鼠）的右腋下。我们每隔一天用卡尺测量肿瘤尺寸。当肿瘤直径约为0.4-0.5 cm时，小鼠即可进行体内MR成像实验。

使用 Omn-NPs 和 Omn 作为对比剂的体内 MRI 研究

对于体内研究，我们将小鼠分为两组（A 和 B）。 A 组小鼠通过尾静脉注射 Omn-NPs，而 B 组小鼠注射与加载的 NPs 浓度相同的 Omn。两组均使用 Bruker Biospin 7.0 T MRI 扫描仪（Bruker BioSpin，Ettlingen，Germany）进行扫描。参数设置如下：视场（FOV），3.5×2.5 cm；切片厚度，0.8 mm； TR，745.2 ms； TE，7.5 ms。使用 T1 加权自旋回波序列获取小鼠的轴向切片。两种造影剂静脉注射前后不同时间点的图像。

MMP2/9 在肿瘤和正常组织中的表达

在体内MRI检查后，选择OSCC小鼠模型的肿瘤组织、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肌肉组织进行MMP2和MMP9的免疫组织化学（IHC）染色。将所有组织解剖并固定在10%中性缓冲福尔马林中，常规加工成石蜡，并以5 μm的厚度切片。使用光学显微镜对MMP2/9的半定量表达（-、+和++）进行IHC检查。

统计分析

使用Student's t进行统计分析 测试。数据以平均值±标准差列出，p <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

mPEG-Pep-PCL 纳米颗粒的表征

¹ mPEG-Pep-PCL 共聚物的 H NMR(CDCl3) 光谱证实该肽与 mPEG 成功偶联，并且 mPEG-Pep 偶联物成功与 PCL 偶联（图 1a）。基于PCL链段中-CH2-O-(4.04 ppm)与-CH2-CH2-O的积分比，mPEG-Pep-PCL共聚物中亲水嵌段与疏水嵌段的摩尔比(mPEG/PCL)约为0.95( 3.65 ppm) 在来自 ¹ 的 mPEG 片段中 核磁共振氢谱测量。

一 ¹ PEG-Pep-PCL 在 CDCl3 中的 H 核磁共振谱（300 MHz，25 μC）。 b 空白 NPs 和负载 Omn 的 NPs（0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL）的直径和多分散指数。 c 负载 Omn 的 NPs 的稳定性（0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL）。 d 空白 NPs 和负载 Omn 的 NPs 的 TEM 显微照片。误差棒代表三个单独测量的标准偏差

纳米颗粒的粒径和稳定性

粒度和多分散指数（PDI）由 DLS 确定（图 1b）。未发现三种 Omn-NP 的粒径存在显着差异 (p> 0.05)，而在 Omn-NPs 和空白-NPs 之间发现显着差异 (p <0.05)。对于 PDI，这些 Omn-NPs 之间没有发现显着差异 (p> 0.05)，但 Omn-NPs 和空白-NPs 之间存在显着差异 (p <0.05).

对于Omn-NPs的稳定性，3种Omn-NPs均未观察到沉淀和明显的粒径变化（图1c），表明Omn-NPs是稳定的。

NP 的形态学研究

空白 NP 和 Omn-NP 的 TEM 显微照片如图 1d 所示。在空白 NPs 和 Omn-NPs 中也可以观察到扁圆形，并且 Omn-NPs 由于它们的大小不同而比空白 NPs 小得多。此外，可以清楚地区分 NPs 中的 Omn，在 NPs 中表现为黑色颗粒。可以在纳米颗粒内观察到这种 Omn 颗粒。

载药内容和封装效率

三种Omn-NPs的载药量和包封率如表1所示。 结果表明0.3 mL Omn载药量最高但包封率很低，0.1 mL Omn包封率最高且相对接近载药量为 0.2 mL 和 0.3 mL Omn。考虑到载药量和包封效率，在最终的体内 MRI 研究中使用了 0.1 mL Omn-NPs。低包封率也表明在反应体系中，我们添加的Omn对于NPs来说是足够的。

<图>

Omn-NPs 和 Con-Omn-NPs 响应胶原酶 IV 的宏观和微观形态学变化

为了验证 NPs 响应明胶酶（胶原酶 IV）的裂解，评估了 Omn-NPs 和 Con-Omn-NPs 在与含有 2 mg/mL 胶原酶 IV 的 Hank 溶液孵育后的宏观和微观形态变化。 A1和B1显示Con-Omn-NPs在与胶原酶IV孵育前后的透明溶液，A2和B2显示在孵育前后使用TEM观察Con-Omn-NPs的微观形态没有变化。 C1 和 D1 显示了在与胶原酶 IV 孵育之前和之后的 Omn-NPs 溶液。 D1 表明，随着 24 h 后 Omn-NP 溶液中发生沉淀，液体变得混浊。 D2 显示 Omn-NPs 响应胶原酶 IV 的 TEM 图像，NPs 的结构被分解（图 2）。这个结果表明我们的 NPs 是明胶酶刺激物：肽的裂解会破坏 NPs，并释放负载的药物。并且通过药物释放和我们之前的研究[12, 18]也证明了切割肽释放负载药物的特征。

a1 , a2 , b1 , b2 , c1 , c2 , d1 , d2 胶原酶IV孵育后Omn负载mPEG-PCL NPs(Con-Omn-NPs)和Omn负载mPEG-Pep-PCL NPs(Omn-NPs)的宏观和微观形态变化

体外细胞摄取研究

载有香豆素 6 的 NPs 的细胞摄取如图 3 所示。来自香豆素 6 的绿色荧光显示在 HSC3 细胞的细胞质中，表明香豆素 6 与 NP 一起进入细胞质。由于香豆素6最初被包裹在纳米颗粒中，这表明我们的纳米颗粒可以有效地穿透细胞膜屏障并通过内吞作用分布在细胞质中。

a, b 纳米粒子的体外 HSC3 细胞摄取研究。 HSC3细胞与负载香豆素6的纳米颗粒共聚焦显微镜图像

使用 Omn-NPs 和 Omn 作为对比剂的体内 MR 成像

在 Omn-NPs 和 Omn 以 0.025 mmol/kg (Gd ³⁺ ) 2 组。然后在注射后 5 分钟、15 分钟、30 分钟、60 分钟、90 分钟、120 分钟、150 分钟和180 分钟后获得对比后图像（图4a）。肿瘤到背景的信号（TBR） ) 比率被计算并用作使用 Omn-Nps 与 Omn 进行评估的可量化指标。结果表明，Omn-NPs的最大TBR为2.23±0.10，Omn为1.48±0.01，Omn-NPs达峰时间为30 min，Omn为5 min，信号增强持续时间为180 min。 NPs 和 Omn 的 30 分钟（图 4b）。两组之间的最大 TBR 和保留时间存在显着差异 (p <0.05)。尽管我们的 Omn-NPs 的载药量相对较低，但与单独的 Omn 相比，证明了更好的增强体内 MR 成像。这也证明我们的Omn-NPs是明胶酶刺激物和肿瘤特异性的。

一 , b 人 OSCC 异种移植模型在指定肿瘤位置的轴向 MRI 图像和肿瘤与背景比的折线图，通过 T1 加权序列获得。误差棒代表三个单独测量的标准偏差

尽管最近先进的成像技术如单光子发射计算机断层扫描 [19]、正电子发射断层扫描 (PET) [20] 和光学图像 [21] 被用于 OSCC 的诊断，但 MRI 仍然是最广泛使用和最可靠的根据TNM癌症分期系统[1]和钆螯合物进行头颈部肿瘤分期的工具仍然是最广泛使用的MRI造影剂[22]。

为了实现专门针对 MRI 造影剂靶向肿瘤的目标，已使用主动和被动靶向策略 [2, 23, 24]。主动靶向 [12] 已成为癌症诊断的一大重点领域。靶向配体，如适体 [25]、肽 [8]、抗体 [6] 和叶酸 [26]，与大分子和超分子多聚 Gd 复合物结合，以结合肿瘤细胞或脉管系统过度表达的特定受体。然而，这些大分子和超分子的生物相容性和生物降解特性尚不清楚，它们的不可生物降解性阻碍了临床应用。然而，我们的 Omn-NPs 由 PEG、PCL、明胶酶裂解肽和 Omn 组成。 PEG和PCL具有优异的生物相容性和生物降解性，Omn是临床上广泛使用的MRI造影剂；因此，我们的Omn-NPs有望具有良好的生物安全性。

用亲水性 mPEG 修饰聚合物可以延长血液循环并增加 NPs 在肿瘤中的积累。聚乙二醇化可以减少血清蛋白的粘附，并通过避免网状内皮系统的摄取来创造隐形表面以延长循环时间 [12, 17]。在该研究中观察到包封药物的浓度在肿瘤部位特别增加并且显着延长的增强持续时间。因此，Omn-NPs组TBR峰点时间较Omn组较晚，成像潜伏期明显较长。

此外，提高特异性和延长增强持续时间将最大限度地减少钆离子的注射剂量，从而降低肾源性系统性纤维化的风险，这是钆造影剂设计中的一个问题[27, 28]。

MMP2 和 MMP9 的 IHC 染色

来自器官和肿瘤组织的正常组织MMP2和MMP9的IHC染色结果见图5。结果显示MMP2和MMP9在肿瘤组织中的表达水平为（++），而在大多数正常组织中是 (− ）。在肿瘤组织中，细胞浆和细胞外基质呈明显的褐色，表明MMP2/9表达水平较高。

一 , b 人口腔鳞状细胞癌细胞系异种移植小鼠模型正常和肿瘤组织中MMP2和MMP9的IHC染色

基质金属蛋白酶 (MMP) 家族在癌症侵袭和转移中起关键作用，MMP2/9，也称为胶原酶 IV 和明胶酶 A/B，据报道是最重要的癌症相关 MMP。研究表明，明胶酶表达与包括 OSCC 在内的许多肿瘤的不良结果之间存在相关性 [29, 30]。在我们的研究中也观察到 MMP2/9 的高表达。由于 MMPs 的广泛表达和与癌症的密切关系，无疑是重要的抗癌靶点。因此，我们的 Omn-NPs 几乎可用于所有肿瘤。其简单性和通用性具有很好的临床应用潜力。

结论

在这项研究中，我们设计并合成了一种新型的肿瘤靶向 MRI 造影剂输送系统，以弥补目前临床使用的造影剂的缺陷。在 OSCC 小鼠模型中，发现 Omn-NPs 比 Omn 更高的 MRI T1 肿瘤与背景比和延长的血液循环时间。该研究表明，Omn-NPs 有望作为肿瘤特异性 MRI 造影剂，以提高肿瘤组织的特异性并延长其循环时间。考虑到 PEG 和 PCL 优异的生物相容性和生物降解性，以及 Omn 是临床广泛使用的 MRI 造影剂，这种靶向肿瘤的 MRI 造影剂递送系统具有良好的临床应用潜力。此外，我们将进一步努力提高 Omn 在我们的 NPs 中的载药量和包封率，以获得更好的灵敏度。

数据和材料的可用性

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。

缩写

NP：

纳米粒子

欧姆：

全方位扫描

OSCC：

口腔鳞状细胞癌

MMP：

基质金属蛋白酶

Gd：

钆

mPEG：

甲氧基聚乙二醇

PCL：

聚（ε-己内酯）

Pep：

肽

Omn-NPs：

Omniscan 加载的 mPEG-Pep-PCL NPs

Con-Omn-NPs：

Omniscan 加载的 mPEG-PCL NPs

MRI：

磁共振成像

EPR：

增强渗透性和滞留性

DCM：

二氯甲烷

PVA：

聚乙烯醇

DLS：

动态光散射

PDI：

多分散指数

TEM：

透射电子显微镜

ICP-AES：

电感耦合等离子体原子发射光谱法

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

FBS：

胎牛血清

IHC：

免疫组化

PBS：

磷酸盐缓冲盐水