明胶酶响应纳米颗粒增强Omniscan靶向口腔鳞状细胞癌MRI造影

摘要

我们通过双乳液技术构建了负载临床批准MRI造影剂Omniscan（Omn）的明胶酶响应纳米颗粒（NPs）。所得Omn-NPs尺寸均一（~120 nm），封装效率高（~45%），至少稳定六天。体外实验中，IV型胶原酶触发NPs快速解体释放Omn。人口腔鳞状细胞癌（OSCC）异种移植模型中，Omn-NPs在30 min产生肿瘤背景比（TBR）2.23±0.10，超越游离Omn（5 min时1.48±0.01）并将造影持久性延长至180 min。结果表明Omn-NPs提供更优特异性和延长循环，凸显其作为下一代肿瘤靶向MRI造影剂的潜力。

引言

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔颌面区最常见恶性肿瘤。早期准确成像对个性化手术规划和改善预后至关重要。MRI无电离辐射，提供高分辨率软组织对比，是头颈癌首选成像模态。然而当前钆（Gd）螯合物缺乏肿瘤特异性；其小尺寸导致快速肾清除和有限肿瘤滞留。

纳米颗粒（NP）平台——特别是基于FDA批准聚合物如甲氧基聚乙二醇（mPEG）和聚(ε-己内酯)（PCL）——作为成像剂载体崭露头角。亲水外壳通过增强渗透和滞留（EPR）效应延长循环，可降解核心最小化长期毒性。先前工作我们在mPEG和PCL间引入明胶酶可切割肽（PVGLIG），使载荷在基质金属蛋白酶（MMP-2/9）存在下肿瘤特异性释放。此处将该策略扩展至负载Omn，创建肿瘤靶向MRI造影系统，同时利用EPR和酶激活。

材料与方法

材料

mPEG-NHS（Mn 5000）、PVGLIG肽、Omniscan、IV型胶原酶购自商业供应商。所有试剂即用。

Omn负载明胶酶响应NPs合成

mPEG-Pep-PCL共聚物经开环共聚合制备。Omn-NPs采用双乳液（w/o/w）溶剂挥发法制备：10 mg共聚物溶于1 mL二氯甲烷；加入0.1–0.3 mL Omn，超声于3 mL 3% PVA形成初乳液，再于5 mL 0.5% PVA形成二级乳液。溶剂挥发过滤得最终产物。空白NPs和不可切割Con-Omn-NPs（mPEG-PCL）同法制备但无肽或Omn。

表征

动态光散射（DLS）评估6天内尺寸和分散指数（PDI）。透射电镜（TEM）观察形貌。药物负载和封装效率经硝酸消解后ICP-AES定量。室温监测稳定性。

酶响应

Omn-NPs和Con-Omn-NPs在含0.34 mg mL⁻¹ IV型胶原酶的Hank's溶液中37 °C孵育24 h。宏观透明度和TEM成像评估NPs解体。

体外细胞摄取

HSC3 OSCC细胞孵育载香豆素-6的mPEG-Pep-PCL NPs（12.5 µg mL⁻¹）。0.5和1 h后固定、洗涤，共聚焦显微镜成像评估NPs内化。

动物实验

所有程序遵循NIH指南并经南京口腔医院伦理委员会批准。雌性BALB/c裸鼠（5-6周）皮下接种1×10⁶ HSC3细胞。肿瘤长至~0.4-0.5 cm进行成像。

体内MRI

小鼠尾静脉单次注射Omn-NPs或游离Omn（0.025 mmol kg⁻¹ Gd³⁺）。Bruker 7.0 T扫描仪获取注射基线及5-180 min后T1加权图像。从信号强度线扫描量化肿瘤背景比。

MMP-2/9免疫组化

成像后肿瘤和主要器官组织固定、石蜡包埋、切片，MMP-2和MMP-9染色。半定量评分（-、+、++）评估酶表达。

统计分析

数据呈均值±SD。Student's t检验定显著性（p<0.05）。

结果与讨论

NPs表征

DLS显示Omn-NPs平均直径118±8 nm，低PDI（0.12±0.03），指示窄尺寸分布。空白NPs较大（≈145 nm）且PDI较高。TEM图像确认球形形貌和内部暗核对应封装Omn。

药物负载

封装效率在0.1 mL Omn时峰值45%，0.3 mL得更高负载（~60%）但效率较低（~30%）。为平衡负载和效率选0.1 mL配方用于体内研究。

酶解体

胶原酶IV存在下Omn-NPs变浑浊，TEM显示碎片化，确认肽切割和NPs解体。Con-Omn-NPs保持完整，凸显明胶酶响应设计特异性。

细胞摄取

共聚焦图像显示1 h后HSC3细胞质内强绿色荧光，指示NPs经内吞高效内化。

体内MRI表现

Omn-NPs在30 min产生最大TBR 2.23±0.10，游离Omn在5 min峰值1.48±0.01。Omn-NPs造影持续180 min，游离Omn仅30 min，反映肿瘤滞留延长和肾清除减少。统计分析确认显著改善（p<0.05）。

MMP-2/9表达

免疫组化显示肿瘤组织中MMP-2/9强（++）细胞外基质结合染色，正常器官几乎无表达（-）。验证肿瘤特异性酶触发。

结论

我们成功制备明胶酶响应Omniscan负载NPs，在OSCC模型中增强MRI肿瘤对比。系统提供优越肿瘤背景对比、延长滞留和最小脱靶积累。其由生物相容PEG、可降解PCL和临床批准Omn组成，具备快速转化潜力。未来工作将优化负载效率并探索治疗载荷共递送。

数据与材料可用性

支持这些发现的数据可向通讯作者请求获取。

缩略语

NPs

纳米颗粒

Omn

Omniscan

OSCC

口腔鳞状细胞癌

MMP

基质金属蛋白酶

Gd

钆

mPEG

甲氧基聚乙二醇

PCL

聚(ε-己内酯)

Pep

肽

Omn-NPs

Omniscan负载mPEG-Pep-PCL NPs

Con-Omn-NPs

Omniscan负载mPEG-PCL NPs

MRI

磁共振成像

EPR

增强渗透和滞留

DCM

二氯甲烷

PVA

聚乙烯醇

DLS

动态光散射

PDI

分散指数

TEM

透射电镜

ICP-AES

电感耦合等离子体-原子发射光谱

DMEM

Dulbecco改良Eagle培养基

FBS

胎牛血清

IHC

免疫组化

PBS

磷酸缓冲液