利用AFM纳米力学映射揭示大肠杆菌基因型特异性大分子

摘要

微生物菌株分类传统上基于分子方法，很少研究细菌菌株的形态学特征。本研究通过AFM力学映射揭示了细菌表面的大分子结构，其分辨率不仅取决于纳米级探针尺寸，还取决于样品的力学性质。该技术以简单的样品制备和灵活的工作环境，实现了对微生物菌株膜结构的纳米级研究，克服了电子显微镜和标记依赖的生化分析方法的诸多限制。细胞表面特征性大分子被认为是表层蛋白（S-layer蛋白），且具有大肠杆菌基因型特异性，其平均分子尺寸直径在38-66 nm之间，形状为肾形或圆形。结论：细胞表面大分子结构具有与大肠杆菌基因型相关的独特特征，提示可利用AFM力学映射快速识别基因组对细胞形态的影响。

背景

受限于光学显微镜分辨率不足和电子显微镜工作环境受限，微生物领域研究者很少利用细菌细胞外观，而是采用分子或化学分析方法鉴定基因组片段、蛋白表达等。这些方法缺点显著，包括劳动密集、耗时长，因此需要更直接、高效、灵活的方法。1982年Binnig等人发明的原子力显微镜（AFM）利用激光监测的纳米级探针观测样品表面，可达纳米甚至原子分辨率。通过物理探针成像形貌，该技术克服了光学和电子显微镜的分辨率限制和环境限制，具有样品制备简单、环境灵活（常温常压或液体）等优势。但在微生物研究中，AFM目前主要用于定性成像细菌细胞的静态或动态形貌、鞭毛和菌毛表达，鲜有研究聚焦微生物细胞表面超微结构和细胞性质的定量分析。

本研究选择AFM进行大肠杆菌细胞表面研究，通过AFM地形和相位图像观察单个细菌的形状和尺寸。进一步发现，同步力学映射可揭示表面成分的额外生物力学信息，在探针与样品每次物理接触中，可检测到大分子与周围基质间微小的粘附特性差异。将此先进技术应用于微生物领域，我们检测了包含一个实验室菌株和两个人致病菌株的三种大肠杆菌基因型，以识别表面大分子。结果表明，该技术通过感知样品的力学分布，提供了超越AFM探针尺度的图像分辨率。总之，我们认为表面科学的这一发展不仅为微生物领域研究者提供细胞外观细节，也有助于认识其他生物或纳米材料系统的表面特性。

方法

微生物样品

本研究测试的三种大肠杆菌菌株为临床分离株，由国立成功大学分子医学研究所邓庆豪教授实验室提供。MG1655为大肠杆菌K-12的肠道野生型实验室菌株；CFT073为尿路感染主要致病菌；RS218与婴儿新生儿脑膜炎相关。

功能化基底

采用两步表面修饰实现固体表面与微生物细胞的共价结合。先用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，Sigma-Aldrich）溶液在表面形成初始NH₂功能化层，APTES提供的Si与氧化表面的O形成稳定Si-O键。具有两个COOH基团的戊二醛，一端与APTES的NH₂结合，另一端与细菌表面NH₂结合。

洁净基底浸入APTES溶液（5% APTES乙醇溶液）1小时，乙醇和去离子水冲洗。氮气吹干后置于戊二醛溶液（2% PBS）中过夜，PBS洗涤。

样品制备

从LB琼脂平板挑取单菌落接种LB液体培养基培养12小时，稀释1:100至新鲜预平衡LB液体培养基，再培养12小时。菌液以1500×g（4000 rpm）离心3分钟，重悬于LB液体培养基，重复两次。取200 μL菌液滴加于功能化基底上静置30分钟。标本浸入蒸馏水两次去除未附着细胞，随即在常温空气中AFM成像。

AFM表征

使用Bruker Nano AFM仪器和弹簧常数0.7 N/m、尖端半径10 nm的氮化硅探针。扫描速率0.5 Hz、256线（扫描尺寸10 μm）进行初步地形检测；随后设为0.3 Hz、512线（扫描尺寸2 μm）进行详细观察。采用PeakForce定量纳米力学（QNM）模式进行纳米力学映射，从撤退力-距离曲线的最大吸引力计算表面粘附性能。

我们先前对变形链球菌的研究显示，连续AFM力学映射监测2小时内细菌表面力学演变，样品在该时长内保持存活。为确保本实验大肠杆菌样品活性，进行了预实验，连续4小时监测表面粘附变化暗示细胞制备后至少存活4小时（见附件1）。因此本实验测试的微生物样品在制备后2小时内完成AFM测量。所有大肠杆菌基因型单独培养且不同时间测量，AFM测量紧随制备后立即进行，即细菌样品未排队等待检查，从而最小化了保存时间对菌株差异的影响。本研究各菌株定量数据均来自制备后2小时内的测量。

统计分析

使用Prism（GraphPad Software）进行统计分析。细胞长度和大分子尺寸以均值±标准误（SEM）呈显。大肠杆菌基因型间多重比较采用单因素方差分析（ANOVA）。置信度95%（p<0.05），星号表示显著差异程度。每菌株样本数n>40。

结果与讨论

多重映射下的表面超微结构

以10 μm观察尺度扫描细菌样品，可看到数个单独大肠杆菌MG1655细胞，地形图可观察三维细胞形状（图1a）；偏转误差图获得清晰二维细胞轮廓（图1b），细菌旁可见数个管状物。波浪状丝状物（图1c）与文献报告的微生物鞭毛外观一致，确认为鞭毛，较短毛发状菌毛也可见。缩小探针观察区域至单个微生物细胞，地形图显示细胞表面垂直方向有轻微差异（图1d），偏转误差图虽提供更多形态信息但环境噪声过大难以研究细胞表面超微结构（图1e）。当测量探针与样品接触时的同步生物力学性质，发现细菌表面实由大量具有特定形状和尺寸的大分子组成，这通过粘附力映射揭示（图1f）；因此地形和偏转误差图的形态分辨率借助生物力学信息得到进一步提升。

图2a清晰显示大肠杆菌MG1655表达鞭毛，丝状物尺寸与图1b相似，粘附性能相对低于基底。此外，细菌表面由圆形成分组成，其粘附性比周围基质低。此观察类似我们先前在小鼠皮肤组织层的发现，那些反复出现的可比较颗粒被认为是大分子，其结构比分子间区域更致密一致，故粘附性能差异易被感知。革兰氏阴性菌细胞包膜最外层是自组装蛋白层，如图2b所示，称为表层（S-layer）蛋白。S-layer结构传统上用电镜测量，但真空环境和导电涂层要求丢失了蛋白的原位和实时信息。虽有研究提取S-layer蛋白重组到云母基底上AFM扫描，但结果缺乏S-layer结构的原位实时表现。基于细胞架构和电镜微生物表面图像，我们将观察到的大分子视为S-layer蛋白。

比较AFM和透射电镜（TEM）测量，前者具有样品制备更简单、实验要求限制少、成像更生物友好等优势。TEM在生物领域的选择通常因其能观察细胞内细胞器和获得超高分辨率（通常纳米或亚纳米）成像。本工作的AFM粘附映射提高了特征分辨率，以不依赖探针尺寸、而依赖样品内在结构的方式呈现表面大分子排列。此外，该方法可在数十微米平方面积范围内实现微生物表面的纳米级分辨率。

基因组操控的形态学特征差异

观察大肠杆菌MG1655表面超微结构后，关注其他菌株大分子排列情况。人致病菌大肠杆菌CFT073和RS218在相同实验参数下经AFM检测，三种基因型在10 μm特征尺度下细胞形状和尺寸无显著差异（图3a-c）。利用粘附力映射识别S-layer蛋白，在不同大肠杆菌菌株中检测到形状和尺寸各异的结构（图3d-f）。为便于比较，三菌株详细粘附映射图见图3g-i。表面大分子在MG1655和RS218呈圆形，但分子直径不同：MG1655为38±1.1 nm（n=80），RS218为58±2.7 nm（n=46）。CFT073细胞的S-layer蛋白形状独特呈肾形，两端点长度差为66±3.2 nm（n=44）。对三基因型S-layer蛋白尺寸进行多重比较分析，结果显示菌株间存在显著差异（图4）。

微生物S-layer据报在多种功能中发挥重要作用，包括保护细胞免受恶劣环境、吞噬作用攻击和掠食性细菌侵害；也作为粘附素促进有效定植。S-layer结构已被TEM深入研究，分类为多种晶格类型，中心间距4-35 nm。我们AFM结果与文献TEM报告的差异被认为源于不同成像方法：TEM给出S-layer二维形态，而AFM捕获包含细胞弧度、粗糙度和AFM探针几何多重影响的三维地形。

不同类型S-layer结构原本被认为可利用其分类学特征区分细菌物种，但后来发现即使单一物种，不同菌株也可能具有不同蛋白晶格。虽然一些研究探讨S-layer在菌毛形成中的作用、细胞膜蛋白类型及大肠杆菌基因型间基因组尺寸多样性，但S-layer蛋白差异鲜少被注意。本研究揭示了大肠杆菌MG1655、CFT073和RS218间形态学特征差异，提示表面大分子外观可能特异于个别大肠杆菌基因型。

结论

本工作通过AFM力学映射检测到细菌表面的基因组特异性纳米结构信息，区分了大分子与周围基质的粘附差异。微生物细胞表面大分子依据革兰氏阴性菌分子架构被认为是表层蛋白。这些大分子的排列和尺寸具有特异性，经统计分析差异显著。结论：细菌S-layer结构依赖基因组，可作为微生物相关疾病或菌株快速诊断的潜在方法。为实现S-layer特征的实际应用，需检测更多细菌基因型以完善目录。我们正在建立连接细菌形态学特征与生理/病理表现的数据库，相信这将是AFM检测实际应用的有希望进展。

缩写

AFM:

原子力显微镜

ANOVA:

单因素方差分析

APTES:

3-氨基丙基三乙氧基硅烷

LB:

溶菌肉汤

QNM:

定量纳米力学

S-layer:

表层

TEM:

透射电镜