通过原子力显微镜纳米级机械映射鉴定大肠杆菌基因型的特征大分子

背景

由于光学显微镜分辨率较低，电子显微镜工作环境受限，微生物领域的研究人员很少考虑利用细菌细胞的外观，而是采用分子或化学分析方法进行基因组片段的鉴定、蛋白质的表达等。 . 毫不奇怪，这些方法有许多缺点，包括劳动密集型和耗时，因此需要更直接、有效和灵活的方法。由 Binnig 等人于 1982 年发明的原子力显微镜 (AFM) 旨在使用由激光束监测的纳米级探针，以纳米级甚至原子级分辨率观察样品表面 [1]。通过物理探针尖端对形态进行成像，该技术克服了光学和电子显微镜的分辨率限制和环境限制，并具有许多优点，例如简单的样品制备和在环境空气或流体条件下的灵活工作环境 [2， 3]。尽管如此，在微生物研究方面，AFM 目前的应用主要涉及对细菌细胞的静态或动态形态或鞭毛和菌毛的表达进行定性成像 [4,5,6]，而很少有研究关注细菌细胞的表面超微结构。微生物细胞及其细胞特性的定量分析。

本研究选用原子力显微镜对大肠杆菌进行表面研究 (大肠杆菌 ) 细胞，通过 AFM 形貌和相位图像观察到单个细菌的形状和尺寸。此外，同时机械映射被发现揭示了关于表面组件的额外生物力学信息，在尖端和样品之间的每次物理接触期间，可以检测到大分子和周围基质之间粘附特性的微小差异。将这种先进技术应用于微生物领域，我们检查了三种 E.大肠杆菌 包含一种实验室菌株和两种人类致病菌株的基因型，用于鉴定表面大分子。结果表明，该技术可以通过感测样品的机械分布提供超过 AFM 尖端尺度的图像分辨率。总之，我们认为表面科学的这种发展不仅可以为微生物领域的研究人员提供细胞外观的细节，而且有助于我们了解另一种生物或纳米材料系统的表面特征。

方法

微生物样本

三个E。大肠杆菌 本研究中测试的菌株由国立成功大学分子医学研究所滕清浩教授的实验室临床分离并提供。 MG1655 是大肠杆菌的肠道和野生型实验室菌株。大肠杆菌 K-12 和另外两种菌株是人类病原体——CFT073，尿路感染的主要原因，以及 RS218，与婴儿的新生儿脑膜炎有关 [7]。

功能化基材

对固体表面和微生物细胞之间的共价结合应用了两步表面修饰。首先，使用 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，Sigma-Aldrich Co. LLC，USA）溶液在表面形成初始 NH2 功能化层，其中稳定的 APTES 涂层有助于稳定的 Si-O 键——Si 提供的来自氧化表面的 APTES 和 O。戊二醛具有两个COOH功能，一个COOH与APTES的NH2功能结合，另一个COOH与细菌表面的NH2作用。

将干净的基板浸入 APTES 溶液中，其中含有 5% APTES 的乙醇混合物，一小时，然后用乙醇和 ddH2O 冲洗。载玻片用氮气流干燥后置于2% PBS 戊二醛溶液中过夜，PBS 洗涤。

样品准备

E 的单菌落。大肠杆菌 菌株选自溶原性肉汤 (LB) 琼脂平板并在 LB 肉汤中培养。在 12 小时的培养时间后，将细菌溶液在新鲜的预平衡 LB 肉汤中按 1:100 稀释。再培养 12 h 后，将菌液以 1500×g 离心 (4000 rpm) 3 分钟并重悬在 LB 肉汤中，此过程重复两次。将 200 微升细菌溶液滴在功能化基材上并静置 30 分钟。然后将样品浸入蒸馏水中两次以去除未附着的细胞，并立即在环境空气中的 AFM 下成像。

AFM 表征

选择 AFM 仪器（Bruker Nano，Santa Barbara，CA，USA）和校准弹簧常数为 0.7 N/m 和尖端半径为 10 nm 的氮化硅探针用于微生物标本的表面检查。 AFM 扫描速率和线像素分别为 0.5 Hz 和 256 线，第一次检测地形的扫描尺寸为 10 μm，然后将参数设置为 0.3 Hz，扫描尺寸为 2 μm 的参数设置为 512 线。详细的观察。 PeakForce定量纳米力学（QNM）模式用于纳米力学映射，其中表面的粘附性能由拉拔力-距离曲线中的最大吸引力计算。

我们之前对变形链球菌的研究 显示细菌表面的机械演化持续 2 小时，通过连续 AFM 机械测绘监测，并证实微生物样品在此持续时间内保持活力 [8,9,10]。为了确保E的生存能力。大肠杆菌 在这项工作中使用的样品，对细菌样品进行了预研究，4 小时的表面粘附持续变化意味着细胞在样品制备后至少可以存活 4 小时（如附加文件 1 所示）。因此，这项工作中测试的微生物样品在样品制备后 2 小时内通过 AFM 进行了测量。所有的E。大肠杆菌 基因型在不同时间单独培养，样品制备后立即进行 AFM 测量。换句话说，细菌样本没有排队等待检查，因此保持时间对E.大肠杆菌 应变被最小化。每个E的定量数据。大肠杆菌 从本研究中 2 小时内进行的测量中收集应变。

统计分析

Prism（GraphPad Software，USA）用于这项工作的统计分析。细胞长度和大分子大小以平均值以及平均值的标准误差 (SEM) 表示。 E 之间的多重比较。大肠杆菌 使用普通的单向方差分析（ANOVA）处理基因型。 95% 的置信水平 (p <0.05) 被选中，星号表示发现的显着差异程度。每个菌株的样本数n> 40。

结果与讨论

多重映射的表面超微结构

当使用 AFM 以 10 μm 的观察尺度对细菌样本进行扫描时，几个单一的 E.大肠杆菌 可以看到MG1655细胞，从地形图上可以观察到三个维度的细胞形状（图1a）；通过偏转误差图像（图1b）获得二维显示的细胞的清晰轮廓，并且可以找到除细菌细胞外的几个小管。波浪状细丝（图1c）与另一项工作中报道的微生物鞭毛的外观一致，证实了这种发现为鞭毛，并且还可以看到较短的毛状菌毛[11]。当减小探针的观察面积以对单个微生物细胞进行详细研究时，细胞表面的垂直方向形貌略有差异，如图 1d 所示，偏转误差图像似乎提供了更多的形态信息，而收集到的环境噪声过多，无法研究细胞表面的超微结构（图 1e）。当在尖端与测试对象接触期间同时测量标本的生物力学特性时，发现细菌表面实际上由大量具有特定形状和大小的大分子组成，正如粘附力图所揭示的那样。图 1f);因此，利用生物力学信息进一步提高了地形和偏转误差图像的形态分辨率。

E的表面超微结构。大肠杆菌 MG1655 使用 AFM 多重映射。 一 和 b 是地形和偏转误差图像，以及c 是带有鞭毛和菌毛表达的细菌细胞的详细偏转误差图像。然后聚焦单个单元格，其中 d 和 e 是地形和偏转误差图像，以及f 是相应的粘附映射。 a 中的比例尺 =1 μm 和 b , c 中的 500 纳米 ，以及 d 中的 200 纳米 –f

在图 2a 中，E 表达的鞭毛。大肠杆菌 可以明显看到 MG1655，其中细丝的尺寸与图 1b 中的相似，粘附性能相对低于基材。此外，发现细菌表面由圆形成分组成，与周围基质相比，这些成分的粘性较低。这一观察结果与我们之前在小鼠皮肤组织层上的发现相似，重复出现的和可比较的颗粒被认为是大分子，其结构比分子间区域中看到的更致密和一致，因此粘附性能的差异可以容易被感知[12]。革兰氏阴性菌细胞包膜的最外层是一层自组装蛋白，如图 2b 所示，称为表面层（S 层）蛋白 [13]。 S 层结构传统上通过电子显微镜测量，而真空环境和导电涂层的要求丢失了有关蛋白质的天然和实时信息。虽然一些研究提取了 S 层蛋白质并将它们重新组装到云母基板上进行 AFM 扫描，但结果缺乏 S 层结构的原位和实时性能 [14, 15]。基于细胞结构和电子显微镜下微生物表面的一些先前图像，我们将观察到的大分子视为S层蛋白[16]。

E. 的垂直和表面结构图解。大肠杆菌 细胞。 一 E 上的表面大分子。大肠杆菌 通过 AFM 粘附映射成像的 MG1655 细胞。 b 革兰氏阴性微生物细胞包膜的分子结构，由细胞质膜、肽聚糖、外膜和 S 层组成。比例尺 =200 nm

比较 AFM 和透射电子显微镜 (TEM) 测量，前者比后者具有几个优点，例如更简单的样品制备、更少​​的实验要求和更生物友好的成像应用。选择生物领域的TEM，一般是因为它能够看到细胞间的细胞器和可以获得的超分辨率（通常是纳米或亚纳米）成像。当前工作中的 AFM 粘附映射提高了特征分辨率，并以不依赖于尖端尺寸的方式呈现了表面大分子的排列，而是依赖于样品本身的内在结构。此外，该方法能够在数十平方微米的范围内实现微生物表面的纳米级分辨率。

基因组操纵的形态特征差异

观察E的表面超微结构后。大肠杆菌 MG1655 细胞，感兴趣的一个问题是大分子如何在其他菌株中排列。人类病原体E.大肠杆菌 因此，CFT073 和 RS218 用相同的实验参数通过 AFM 进行了检查，并且这三种基因型在 10 μm 特征尺寸的细胞形状和尺寸上没有显着差异，如图 3a-c 所示。粘附力映射用于识别 S 层蛋白，并在不同的 E 中检测到具有各种形状和大小的不同结构。大肠杆菌 菌株，如图 3d-f 所示。为了便于比较，E 的详细粘附映射图像。大肠杆菌 菌株显示在图 3g-i 中。 MG1655和RS218细胞的表面大分子特征为圆形，尽管分子直径不同，分别为38 ± 1.1 nm（n =80) 对于 MG1655 和 58 ± 2.7 nm (n =46) 对于 RS218。另一方面，CFT073细胞具有独特的S层蛋白形状，呈肾状，两个端点之间的长度差为66 ± 3.2 nm（n =44)。对这三种基因型的S层蛋白大小进行多重比较分析，结果表明这些菌株之间存在显着差异（图4）。

E 的形态特征。大肠杆菌 基因型。上排显示了a的偏转误差图像 MG1655，b CFT073 和 c RS218。中间一行显示了在 d 上用粘附映射着色的 3D 地形图 MG1655，e CFT073 和 f RS218 电池。下一行是 g 上的详细粘附映射 MG1655，h CFT073 和 i RS218。在粘附映射中，颜色越深表示粘附性能越差，反之亦然。 a 的比例尺为 2 μm –c , d 为 200 纳米 –f ，对于 g 为 100 纳米 –我

E的分子大小。大肠杆菌 基因型。表面蛋白的直径通过 AFM 检测并通过单向方差分析处理以进行多重比较。 ****p <0.001 和 *p <0.05

据报道，微生物 S 层在许多功能中发挥着重要作用，其中包括保护细胞免受恶劣环境、吞噬作用和捕食性细菌的攻击。此外，S 层还可以作为粘附素，实现有效的定植 [17]。 S 层结构已通过 TEM 进行了很好的研究，并被归类为各种晶格类型，中心到中心之间的空间在 4-35 nm 的范围内 [16]。我们的 AFM 结果与文献中的 TEM 报告之间的差异被认为是不同的成像方法，其中 TEM 给出了 S 层结构的 2D 形态，而 AFM 捕获了 3D 地形，其中包括由细胞弧度和粗糙度贡献的多重影响以及AFM探针的几何形状。

最初认为不同类型的 S 层结构可以利用其不同的分类学特征来区分细菌物种，尽管后来发现即使对于单一物种，微生物污渍也可能具有不同的蛋白质格子 [13, 16, 18, 19]。虽然一些研究调查了 S 层在细丝形成中的作用、细胞膜上蛋白质的类型以及 E.大肠杆菌 基因型中，很少注意到 S 层蛋白的差异 [20,21,22]。目前的研究结果揭示了E.之间形态特征的差异。大肠杆菌 MG1655、CFT073 和 RS218 并表明表面大分子的外观可能特定于个体E。大肠杆菌 基因型。

结论

在这项工作中，通过 AFM 机械测绘检测了有关细菌表面的基因组特异性纳米结构信息，从而区分了大分子与周围基质之间的粘附差异。根据革兰氏阴性微生物的分子结构，微生物细胞的表面大分子被认为是表层蛋白质。发现这些大分子的排列和大小对测试的大肠杆菌具有特异性。大肠杆菌 具有不同形状和大小的基因型，统计分析表明这些差异是显着的。总之，我们认为细菌 S 层结构是基因组依赖性的，可以成为快速诊断微生物相关疾病或微生物菌株的潜在方法。为了实现S层特征的实际应用，补充目录需要对更多的细菌基因型进行检查。我们目前正在建立连接细菌形态特征和生理/病理表现的数据库，相信这将是AFM检测实际应用的一个有希望的进展。

缩写

原子力显微镜：

原子力显微镜

方差分析：

单因素方差分析

APTES：

3-氨基丙基三乙氧基硅烷

LB：

溶源肉汤

QNM：

定量纳米力学

S 层：

表层

TEM：

透射电子显微镜