纳米二氧化硅对肺和睾丸中印记基因表达和异常甲基化的影响

背景

二氧化硅是硅的氧化物，化学式为 SiO2，最常见于自然界中的石英和各种有机环境中 [1]。工程纳米粒子在纳米技术在高科技行业的快速增长和应用中得到了广泛应用。这种特殊的纳米粒子由于其物理科学特性，如大比表面积、丰富的反应位点、高表面能、不饱和化学键、强大的吸附能力，以及与金属和有机物相互作用的强烈趋势，从而改变污染物及其在环境中的传输[2]。大量消耗品中 SiO2 纳米粒子 (NPs) 的存在增加了它们在环境中释放并与人类接触的可能性。

先前的实验研究表明，单剂量气管内滴注或多次腹膜内注射金属和金属氧化物纳米颗粒会导致从细胞到全身和生物体水平的毒性作用 [3]。 SiO2 NPs 的处理通过增加细胞凋亡和减少细胞运动来抑制乳腺癌细胞系的生长。此外，暴露于 SiO2 NPs 会显着干扰表皮生长因子受体 (EGFR) [4]。当大鼠模型用三种不同尺寸的 TiO2 NPs 处理并与对照相比时，支气管肺泡灌洗液 (BALF) 用大团块 (> 100 纳米) 气溶胶诱导急性炎症反应，而小团块 (<100 纳米) 气溶胶产生显着氧化应激损伤和细胞毒性[5].

纳米粒子对生殖毒性的研究是一个不断发展的领域。一项研究表明，在相同的治疗剂量下，Ni NPs 在C 中诱导了更高的生殖毒性。线虫 比 Ni MPs（微粒）。在C中观察到的这些生殖毒性。线虫 包括减少育雏大小、受精卵和精子激活 [6]。越来越多的证据表明，某些环境影响可以通过父系途径传递给后代，而不会改变精子基因组 [7, 8]。父本信息不仅存在于基因组中，还存在于相关的特定表观遗传标记、mRNA含量和非编码RNA中。

氧化应激是纳米颗粒毒性的重要机制，可引发 DNA 损伤、炎症、蛋白质变性和脂质过氧化 [9]。这些生物效应受纳米粒子的理化性质影响，包括它们的大小、表面积、形状、表面化学、功能化和溶解性 [10, 11]。越来越多的证据表明，即使在低、非细胞毒性剂量下，暴露于纳米颗粒也可能引发组织和细胞的表观遗传改变 [12, 13]。表观遗传学是对基因功能的可遗传变化的研究，这些变化不涉及 DNA 序列的变化，包括 DNA 的甲基化、基因印记、组蛋白修饰和非编码 RNA 的调控 [14]。这种表观遗传改变与许多病理状态和疾病的发展和进展有关 [15]。因此，表观遗传效应是细胞水平患者风险评估筛查的重要组成部分。

Dlk1/Dio3 印记域包含三个已知的差异甲基化区域 (DMR)，它们是父本甲基化的：基因间 DMR (IG-DMR)、母本表达的 3-DMR (Gtl2-DMR) 和 Dlk1-DMR [16]。先前的研究表明 IG-DMR 决定了 Gtl2 的等位基因甲基化状态 启动子 DMR，然后控制整个集群的基因表达 [17]。小鼠基因组在12号染色体远端区域的Dlk1/Dio3结构域有大量印迹基因。IG-DMR位于印迹基因Dlk1之间 和 Gtl2 在雄性生殖系中被特异性甲基化并调节印迹基因区域的亲本等位基因特异性表达 [18]。 IG-DMR甲基化状态在出生前就已建立，因此在男性生殖细胞分化过程中，在男性生殖系中贯穿整个男性的一生，这意味着IG-DMR甲基化在成熟睾丸的精原细胞和精母细胞中得以维持。

我们的目的是在转录和翻译沉默之前发现精子发生过程中雄性生殖系基因表达的变化，以解释父亲通过环境变化对后代的影响。环境因素可以改变精子的转录修饰，从而导致后代发育的改变。为了在我们的工作中进行这项调查，我们使用细胞系和小鼠作为筛选 SiO2 NPs 毒性作用的模型。据我们所知，这是第一项证明纳米颗粒对肺和睾丸组织造成损伤的 Dlk1/Dio3 印迹区域的表观遗传机制的研究。

方法

实验动物

动物处理按照南京医科大学相应的动物使用协议下的实验动物护理和使用指南进行。小鼠获自北京维塔尔河实验动物技术有限公司。所有动物均在 23°C 下饲养，光照周期为 12 小时。小鼠随意饮用消毒水和啮齿动物饲料。每天监测小鼠的活动和行为。 2 周后，小鼠注射纳米二氧化硅 12.5 mg/kg。

化学品

纳米级 SiO2（99.5% 微量金属基础，粒径 10-20 nm）购自 Sigma-Aldrich Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。将纳米颗粒悬浮于 RPMI 1640 培养基中制成原液，超声振动分散 20 分钟，稀释至适当浓度，再分散 20 分钟。

SiO2 NPs 的特性

使用Malvern Zetasizer Nano ZSP记录尺寸和zeta电位。

RNA 提取和 qRT-PCR

肺和睾丸样本在液氮中快速冷冻，然后在大约 4 小时后储存在 80°C。我们在提取样品前对样品进行解冻。

使用 1 mL TRIzol 试剂（Invitrogen Life Technologies Co, USA）从样品中分离总 RNA。将混合物以 80% 的功率超声处理 5 分钟，加入 0.2 mL 氯仿，然后以 12,000g 离心 /min 在 4°C 下持续 15 分钟。然后，添加三步苯酚/氯仿纯化以去除蛋白质。然后，我们使用紫外线吸光度来测量每个样品在 260 和 280 nm 处的 RNA 含量和质量。 mRNA 的引物序列显示在附加文件 1：表 S1 和 S2 中。 qRT-PCR 使用制造商的说明进行，如前所述 [19]。使用 SYBR Green (Vazyme) 进行实时 PCR。 PCR 循环如下：95°C 初始变性 30 秒，然后是 40 个循环，95°C 变性 15 秒，60°C 退火 15 秒，72°C 延伸 30 秒。用β-actin归一化后，用2^-ΔCt法分析靶基因的量。

DNA 提取、亚硫酸氢盐处理和亚硫酸氢盐测序 PCR

按照制造商的建议，使用 DNA 试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit；Qiagen. No.51304；USA）从睾丸和肺组织中分离 DNA。使用试剂盒（EpiTect® 亚硫酸氢盐试剂盒；Qiagen 编号 59104；美国）按照制造商的建议实现了 500 ng 所有基因组 DNA 的亚硫酸氢盐转化。使用Methyl Primer Express v1.0软件设计不同的CpG甲基化寡核苷酸，序列为P1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3'、P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'； P2-F 5'-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3'，P2-R 5'-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3'； P3-F 5'-TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATT-3'，P3-R 5'-ACCCATAACAAACCACAACA-3'； P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3′，P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3′。

如下通过 PCR 扩增每个 DNA 样品：2.5 μl 10 × PCR 缓冲液 PCR 反应混合物与 500 ng 亚硫酸氢盐处理的 DNA、0.5 μl 正向和反向引物、0.5 μl dNTP Mix、0.5 μl rTaq（500 U，dNTP , Mg ²⁺ )（Takara Bio，东京，日本），添加 ddH2O 至 25 μl。在 94°C 下激活聚合酶 10 分钟后，接着是以下顺序的 40 个循环：94°C 下 30 秒，58°C 下 30 秒，72°C 下 1 分钟，最后在 72°C 下延伸C 10 分钟。

细胞培养和处理

A549 细胞购自 ATCC (Manassas, VA, USA)，并在 37°C 和 5% CO 2 的加湿培养箱中在补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 1640 中培养。将细胞接种在 96 孔板上，与不同浓度的 SiO2 NPs：62.5、125、250、500、1000 和 2000 μg/ml 孵育 24 小时。

细胞活力测定

通过 CCK8 增殖试验评估细胞活力。细胞以1.5 × 10 ⁴ 的密度铺板 每孔置于 96 孔板中并孵育过夜。暴露于不同浓度的 SiO2 NPs 后，将 100 μl CCK8 添加到每个孔中，并将细胞在 37°C 下孵育 30 分钟以允许 CCK8 代谢。最后，在 450 nm 处测定吸光度。用SPSS 15.0计算细胞抑制率并转化为IC50。

统计分析

所有计算均使用 SPSS 15.0 软件进行。使用不相关的 t 进行组间比较 检验和 BSP 的 Pearson 卡方检验。数据表示为平均值 ± SD。在所有情况下，p 的值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

SiO2 NPs 的表征

我们在实验条件下表征了 SiO2 NP。 SiO2 NPs在培养基中的平均流体力学半径和zeta电位分别为371.77 ± 18.46 nm和18.83 ± 2.12 mV（图1）。

悬浮液中 SiO2 NPs 的表征。将颗粒悬浮在含有 10% FBS 的细胞培养基中。 a, b SiO2 NPs 的尺寸和 zeta 电位由 Zetasizer Nano ZSP 评估。 c 在暴露于不同浓度的 SiO2 NPs 24 小时后，通过 CCK8 测定确定细胞活力。重复实验的平均值 ± SD，每个实验包含三个技术重复。 *** p <0.001

SiO2 NPs 对 A549 细胞系的影响

为了确定 SiO2 NPs 的毒性，我们对 A549 细胞进行了增殖测试，以确定 SiO2 NPs 对 A549 细胞的 IC50。如图 1c 所示，SiO2 NPs 以浓度依赖性方式降低 A549 细胞活力。 SiO2 NP 浓度高于 62.5 μg/ml (p <0.001)。化学品 24 小时的 IC50 定义为暴露 24 小时后影响 50% 细胞的浓度。 SiO2 NPs 24 h 的 IC50 为 4942 μg/ml。

SiO2 NPs 对鼠肺和睾丸的影响

我们确定了在我们的小鼠模型中以 12.5 毫克/千克体重的剂量暴露于 SiO2 NPs 是否会导致肺膜损伤甚至睾丸损伤。如图所示，与睾丸中的对照组相比，SiO2 NP 暴露导致肺组织切片中的层状体破坏（图 2a、b）和线粒体嵴损伤（图 2c、d）。然后我们研究了SiO2 NPs对Dlk1/Dio3印迹区域印迹激活的肺和睾丸影响。

暴露于 SiO2 NPs 的大鼠肺和睾丸组织的 TEM 图像。 一 在对照中通过扫描电镜评估肺组织的形态学。 b 在治疗组中通过扫描电镜评估肺组织的形态学。 c 通过SEM在对照中评估睾丸组织的形态学。 d 通过扫描电镜对治疗组的睾丸组织进行形态学评估。比例尺代表 2.0 μm

印记基因在鼠肺和睾丸上的表达

为了说明肺和睾丸的变化，我们检测了这些组织中的印迹基因。我们选择了 24 个印记基因；他们是Dio3 , Ddc , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , H19 , Igf2, Igf2as , Igf2r , Inpp5f , Magel2 , Magi2 , 梅斯特 , Mir296 , Mir298 , Ndn , Nnat , Peg10 , Plagl1 , Pwcr1 , Rasgrf1 , Rtl1 , Snrpn , 和 Snurf。 其中 13 个基因在肺和睾丸中均有表达：Dio3 , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , Igf2r , IGF2 , Inpp5f , Peg10, Ndn , Nnat , Rasgrf1 , Rtl1 , 和 Snrpn （图 3a、b）。差异表达基因主要集中在Dlk1/Dio3印记区域，其中含有Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 , 和 Dio3 .

印记基因在肺和睾丸中的表达。 一 印迹基因在肺中的表达。 b 印记基因在睾丸中的表达。 *P <0.05。 **P <0.01。学生的t 测试

Dlk1/Dio3 印记区域的表达

印记的 Dlk1/Dio3 区域包含三个蛋白质编码基因 (Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 , 和 Dio3 ) 上遗传的等位基因 [20]（图 4c）。为了阐明 Dlk1/Dio3 区域在肺和睾丸组织对 SiO2 NP 治疗的反应中的作用，我们分析了与对照相比 DMR 的甲基化模式。肺和睾丸中的甲基化靶向不同的基因。 Dlk1的表达 和 Dio3 在肺和睾丸中均上调，而 Rtl1 仅在睾丸中上调（图 4a、b）。

Dlk1/Dio3 印记区域的表达。 一 Dlk1/Dio3 区域基因在肺中表达。 b Dlk1/Dio3 区基因在睾丸中表达。 c Dlk1/Dio3 区域的架构。 *P <0.05。 **P <0.01。学生的t 测试

Dlk1/Dio3 DMR 区域的甲基化

为了进一步研究基因表达是否因 DNA 甲基化而发生变化，我们研究了该区域在小鼠肺和睾丸中的甲基化状态。在DNA甲基化分析中，我们确定了CpG岛三个部分的序列。在睾丸中，它们是低甲基化的；然而，在 CpG 岛 1 中，它们显着高甲基化（图 5）。在肺中，整个甲基化与睾丸相同，而 CpG 岛 2 显示高甲基化（图 6）。

睾丸中 Dlk1/Dio3 DMR 区域的甲基化。 一 对照和处理组织中 CpG 岛 1 的甲基化。 b 对照和处理组织中 CpG 岛 2 的甲基化。 c 对照组和处理组中CpG岛3的甲基化

肺中 Dlk1/Dio3 DMR 区域的甲基化。 一 对照和处理组织中 CpG 岛 1 的甲基化。 b 对照和处理组织中 CpG 岛 2 的甲基化。 c 对照组和处理组中CpG岛3的甲基化

讨论

越来越多地使用纳米材料引起了人们对对人类健康和环境影响的潜在影响的担忧。先前的研究表明，SiO2 NPs 可引起肺和心血管损伤，如老年大鼠的肺部炎症和心肌缺血损伤 [21]。此外，纳米粒子可能对生殖系有影响，因为这些细胞似乎对银纳米粒子的毒性作用更敏感，并在暴露于较低剂量后表现出不利影响。 Ag NP 暴露增加了在大鼠精细胞中观察到的异常数量，并降低了顶体和质膜的完整性，同时降低了线粒体活性 [22]。我们的调查是一系列研究的一部分，该研究使用实验平台来评估纳米颗粒针对雄性生物甚至未暴露后代的潜力。

在我们之前的体外研究中，我们报道了短期暴露于某些纳米颗粒会导致细胞凋亡和 TM-4 Sertoli 细胞中印迹基因的异常表达。这些发现表明，印迹基因的异常表达可能是纳米颗粒诱导繁殖毒性的潜在机制 [23]。此外，在我们之前的体内研究中，一些环境因素，例如内分泌干扰物，不仅在暴露的个体中而且在后代的连续世代中也促进表型或疾病状态。种系中永久编程的表观突变可以允许表观遗传跨代表型的传递 [19]。本研究旨在探讨SiO2 NP处理对小鼠模型表观遗传状态的影响，为雄性跨代效应奠定机制基础。

表观遗传状态是一个术语，用于定义基因组内发生的化学修饰，但不改变 DNA 序列 [24]。表观遗传机制，包括 DNA 甲基化、印记基因、组蛋白修饰和非编码 RNA 表达，可以影响外源环境中的基因组功能 [25]。据我们所知，我们的研究是第一个在表观遗传水平上研究SiO2 NPs诱导肺和睾丸毒性的研究。

我们首先检查了 SiO2 NPs 在人肺上皮细胞系 A549 细胞中的急性毒性。然而，我们在实验小鼠中的发现表明，在与环境浓度的 SiO2 NPs 接触后，II 型层状肺上皮细胞和睾丸线粒体嵴损伤 [26]。为了更好地了解肺和睾丸病理的机制，我们表达了印迹基因。基因组印记是指根据起源的亲本，在配子的受精卵中沉默一个亲本等位基因；这种沉默是通过表观遗传过程发生的，例如 DNA 甲基化和/或组蛋白修饰 [27]。先前的研究表明，Dlk1/Dio3 域的印迹基因表达对胎儿生长 [28]、人类青春期的时间 ​​[29] 和对代谢疾病的易感性 [30] 很重要。研究表明，IG-DMR 决定了 Gtl2 启动子 DMR 的等位基因甲基化状态，然后控制整个 Dlk1/Dio3 区域的基因表达 [17]。这个印记控制区的主要功能是继承生殖细胞驱动的 DNA 甲基化作为配子信号，然后在体细胞内维持随后的等位基因特异性 DNA 甲基化模式 [31]。我们的研究表明，SiO2 NPs 诱导肺和睾丸组织中 Dlk1/Dio3 区域的表达发生变化。在 Dlk1/Dio3 区域，父本表达基因（Dlk1 , Rtl1 , 和 Dio3 ) 与 NP 治疗后的对照相比特别异常。亚硫酸氢盐测序结果显示肺和睾丸中的低甲基化水平不同。处理后的组织中IG-DMR的甲基化状态普遍较低，这种低甲基化可能代表了印迹基因差异表达的机制。

结论

总之，我们的结果表明，SiO2 NP 暴露可能会引起重要的 DNA 甲基化变化，从而引发细胞损伤，并且这些变化对 Dlk1/Dio3 印记基因簇的表达非常重要。重要的是，DNA 甲基化的变化会影响肺和睾丸组织。这些结果对我们未来研究暴露模型后代遗传的纳米粒子的表观基因组效应以及阐明介导此类表观遗传改变的分子机制具有重要作用。

缩写

BALF：

支气管肺泡灌洗液

CCK-8：

细胞计数试剂盒-8

DMR：

差异甲基化区域

EGFR：

表皮生长因子受体

IG-DMR：

基因间DMR

议员：

微粒

NP：

纳米粒子