二氧化硅纳米颗粒对肺和睾丸组织基因表达及 DNA 甲基化的影响

摘要

纳米技术飞速发展并广泛应用于前沿医疗治疗。然而，纳米颗粒 (NPs) 暴露可能诱发全身性疾病的担忧日益增加，因表观遗传机制与越来越多疾病相关。NP 表观基因组修饰在疾病病因中的作用至关重要。本研究旨在通过暴露 SiO₂ NPs 确定肺和睾丸细胞表观遗传损伤机制。采用雄性 C57BL/6 小鼠表征 SiO₂ NPs 对肺、睾丸细胞的损伤效应及印记 Dlk1/Dio3 域区甲基化状态。暴露 SiO₂ NPs 的 A549 细胞发生凋亡，暴露小鼠肺睾组织结构改变。Dlk1/Dio3 印记域内基因在两组织均发生改变：睾丸中 Dlk1、Rtl1、Dio3 上调，肺中 Dlk1 和 Dio3 也上调。成年雄性肺睾组织亚硫酸氢盐测序 PCR 显示大多为低甲基化，少数 CpG 位点高甲基化。结果表明纳米颗粒在印记基因 DNA 甲基化中扮演重要角色。

背景

二氧化硅是硅的氧化物，化学式 SiO₂，自然界常以石英形式存在。工程纳米颗粒随纳米技术在高新产业的快速发展而广泛应用。该纳米颗粒因其大比表面积、丰富活性位点、高表面能、不饱和化学键、强吸附能力、与金属和有机物强烈相互作用等理化特性，广泛用于电子、塑料、医药、化妆品、涂料等消费品，从而改变环境中污染物及其迁移。SiO₂ NPs 广泛存在于消费品中，增加了其释放到环境并接触人群的可能性。

既往实验表明，单次气管滴注或多次腹腔注射金属/金属氧化物纳米颗粒可从细胞至全身器官水平引起毒性效应。SiO₂ NPs 通过增加凋亡和降低细胞迁移抑制乳腺癌细胞株生长，并显著干扰表皮生长因子受体 (EGFR)。大鼠模型经三种尺寸 TiO₂ NPs 处理后，大团聚体 (>100 nm) 气溶胶诱导急性炎症反应，小团聚体 (<100 nm) 导致显著氧化应激损伤和细胞毒性。

纳米颗粒生殖毒性研究是新兴领域。有研究显示相同剂量下 Ni NPs 在 C. elegans 中诱导的生殖毒性高于 Ni 微粒 (MPs)，表现为产卵量减少、受精卵减少、精子激活受损。越来越多证据表明某些环境效应可通过父系途径不改变精子基因组而传给后代。父系信息不仅存在于基因组，还存在于特定表观遗传标记、mRNA 含量和非编码 RNA 中。

氧化应激是纳米颗粒毒性的重要机制，可触发 DNA 损伤、炎症、蛋白变性和脂质过氧化。这些生物效应受纳米颗粒理化性质影响，包括尺寸、表面积、形状、表面化学、官能化和溶解度。越来越多证据明确表明，即使在低、非细胞毒性剂量下，纳米颗粒暴露也可能触发组织和细胞的表观遗传改变。表观遗传学研究不涉及 DNA 序列改变的可遗传基因功能变化，包括 DNA 甲基化、基因印记、组蛋白修饰和非编码 RNA 调控。此类表观遗传改变与多种病理状态和疾病的发生发展相关。因此，表观遗传效应是细胞层面患者风险评估筛选的关键部分。

Dlk1/Dio3 印记域包含三个已知的差异甲基化区域 (DMRs)，均为父源甲基化：基因间 DMR (IG-DMR)、母源表达 3-DMR (Gtl2-DMR) 和 Dlk1-DMR。既往研究提示 IG-DMR 决定 Gtl2 启动子 DMR 的等位基因甲基化状态，进而控制整个簇的基因表达。小鼠基因组在 12 号染色体远端 Dlk1/Dio3 域包含大量印记基因。位于 Dlk1 和 Gtl2 之间的 IG-DMR 在雄性生殖系特异性甲基化，调控印记基因区的亲本等位基因特异性表达。IG-DMR 甲基化状态在出生前建立，并在雄性一生中于雄性生殖细胞分化过程中维持，即在成熟睾丸的精原细胞和精母细胞中维持 IG-DMR 甲基化。

我们旨在寻找精子发生过程中雄性生殖系基因表达变化，以解释环境变化通过父系影响后代的机制。环境因素可修饰精子转录修饰，导致后代发育改变。为此，我们用细胞系和小鼠模型筛选 SiO₂ NPs 毒性效应。据我们所知，这是首个证明纳米颗粒在肺和睾丸组织中通过 Dlk1/Dio3 印记区表观遗传机制致损伤的研究。

方法

实验动物

动物操作遵循《实验动物照料和使用指南》，经南京医科大学动物使用方案批准。小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物饲养于 23 °C、12 小时光照周期。小鼠自由饮用灭菌水和啮齿类饲料。每日监测小鼠活动和行为。2 周后，小鼠注射纳米级 SiO₂ 12.5 mg/kg。

化学试剂

纳米级 SiO₂ (99.5% 痕量金属基础, 粒径 10–20 nm) 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。纳米颗粒悬浮于 RPMI 1640 培养基制备储存液，超声分散 20 分钟，稀释至适当浓度，再超声分散 20 分钟。

SiO₂ NPs 特性

用 Malvern Zetasizer Nano ZSP 记录粒径和 zeta 电位。

RNA 提取与 qRT-PCR

肺和睾丸样品液氮速冻，约 4 小时后置 -80 °C 保存。提取前解冻。用 1 mL TRIzol 试剂 (Invitrogen) 分离总 RNA。混合物 80% 功率超声 5 分钟，加 0.2 mL 氯仿，4 °C 下 12,000g 离心 15 分钟。随后三步酚/氯仿纯化去除蛋白。用 UV 吸光度在 260 和 280 nm 测定 RNA 浓度和质量。mRNA 引物序列见附件文件 1: Table S1 和 S2。qRT-PCR 按厂家说明书进行。实时 PCR 用 SYBR Green (Vazyme)。PCR 循环：95 °C 预变性 30 秒，40 循环 (95 °C 15 秒, 60 °C 15 秒, 72 °C 30 秒)。以 β-actin 为内参，用 2^-ΔCt 法分析目标基因量。

DNA 提取、亚硫酸氢盐处理与亚硫酸氢盐测序 PCR

用 DNA 提取试剂盒 (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen) 从睾丸和肺组织分离 DNA。500 ng 基因组 DNA 用亚硫酸氢盐转化试剂盒 (EpiTect® Bisulfite kit; Qiagen) 进行亚硫酸氢盐转化。用 Methyl Primer Express v1.0 软件设计不同 CpG 甲基化引物。PCR 扩增条件：94 °C 激活聚合酶 10 分钟，40 循环 (94 °C 30 秒, 58 °C 30 秒, 72 °C 1 分钟)，最后 72 °C 延伸 10 分钟。

细胞培养与处理

A549 细胞购自 ATCC (Manassas, VA, USA)，在含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI 1640 中培养，37 °C、5% CO₂、饱和湿度。细胞接种于 96 孔板，用不同浓度 SiO₂ NPs (62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000 μg/ml) 孵育 24 小时。

细胞活力测定

用 CCK-8 增殖测定评估细胞活力。细胞接种密度 1.5×10⁴/孔，过夜孵育。暴露不同浓度 SiO₂ NPs 后，每孔加 100 μl CCK-8，37 °C 孵育 30 分钟代谢。最后在 450 nm 测吸光度。用 SPSS 15.0 计算抑制率并转化为 IC₅₀。

统计分析

所有计算用 SPSS 15.0。组间比较用不相关 t 检验和 Pearson 卡方检验 (BSP)。数据呈现为均值 ± SD。p < 0.05 为统计学显著。

结果

SiO₂ NPs 表征

实验条件下表征 SiO₂ NPs。培养基中 SiO₂ NPs 平均流体动力学半径 371.77 ± 18.46 nm，zeta 电位 18.83 ± 2.12 mV (图 1)。

SiO₂ NPs 对 A549 细胞系的影响

通过 A549 细胞增殖测试确定 SiO₂ NPs 毒性及 IC₅₀。如图 1c 所示，SiO₂ NPs 以浓度依赖方式降低 A549 活力。>62.5 μg/ml 时活力显著下降 (p < 0.001)。SiO₂ NPs 的 IC₅₀ 24 h 为 4942 μg/ml。

SiO₂ NPs 对小鼠肺和睾丸的影响

考察 12.5 mg/kg 剂量 SiO₂ NPs 是否导致小鼠肺膜损伤甚至睾丸损伤。组织学切片显示 SiO₂ NPs 暴露导致肺片层小体破坏 (图 2a,b) 和睾丸线粒体嵴损伤 (图 2c,d)。进而研究 SiO₂ NPs 对肺睾组织 Dlk1/Dio3 印记区激活的影响。

小鼠肺睾印记基因表达

检测 24 个印记基因：Dio3, Ddc, Dlk1, Gpr1, Gtl2, H19, Igf2, Igf2as, Igf2r, Inpp5f, Magel2, Magi2, Mest, Mir296, Mir298, Ndn, Nnat, Peg10, Plagl1, Pwcr1, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn, Snurf。其中 13 个在肺睾均表达：Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn (图 3a,b)。重点关注 Dlk1/Dio3 印记区的 Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3。

Dlk1/Dio3 印记区表达

Dlk1/Dio3 区含四个蛋白编码基因 (Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3) 位于遗传等位基因上 (图 4c)。为阐明该区在肺睾对 SiO₂ NPs 响应中的作用，分析 DMR 甲基化模式与对照比较。肺睾中不同基因被甲基化靶向。Dlk1 和 Dio3 在肺睾均上调，Rtl1 仅在睾丸上调 (图 4a,b)。

Dlk1/Dio3 DMR 区甲基化

为探究基因表达变化是否响应 DNA 甲基化，检测小鼠肺睾该区甲基化状态。DNA 甲基化分析测定三段 CpG 岛序列。睾丸中整体低甲基化，但 CpG 岛 1 显著高甲基化 (图 5)。肺中整体甲基化模式与睾丸相似，但 CpG 岛 2 显示高甲基化 (图 6)。

讨论

纳米材料使用增加引发对人类健康和环境潜在影响的担忧。既往研究表明 SiO₂ NPs 可致肺和心血管损伤，如老年大鼠肺炎和心肌缺血损伤。纳米颗粒可能影响生殖系，因生殖细胞对 Ag NPs 毒性更敏感，低剂量即显示不良效应。Ag NPs 暴露增加大鼠精子细胞异常数，降低顶体和质膜完整性及线粒体活性。本研究属于利用实验平台评估纳米颗粒靶向雄性生物体甚至其未暴露后代潜力的系列研究之一。

我们先前体外研究报道，短期暴露某些纳米颗粒导致 TM-4 塞托利细胞凋亡和印记基因异常表达，提示印记基因异常表达可能是纳米颗粒诱导生殖毒性的潜在机制。先前体内研究显示内分泌干扰物等环境因素不仅在暴露个体中促进表型或疾病状态，还在后续几代后代中传递。生殖系中的表观突变若永久编程，可允许表观遗传跨代表型传递。本研究旨在探究 SiO₂ NPs 处理在小鼠模型中对表观遗传状态的改变，为雄性跨代效应奠定机制基础。

表观遗传状态定义为基因组内不改变 DNA 序列的化学修饰。包括 DNA 甲基化、印记基因、组蛋白修饰、非编码 RNA 表达在内的表观遗传机制可在外源环境中影响基因组功能。据我们所知，本研究首次在表观遗传水平上探究 SiO₂ NPs 诱导的肺睾毒性。

我们首先在人肺上皮细胞系 A549 中考察 SiO₂ NPs 急性毒性。但实验小鼠显示，环境浓度 SiO₂ NPs 接触后导致肺 II 型上皮细胞层板损伤和睾丸线粒体嵴损伤。为更好理解肺睾病理机制，我们表达印记基因。基因组印记指配子中依赖亲本来源沉默一个亲本等位基因，通过 DNA 甲基化和/或组蛋白修饰等表观遗传过程发生。既往研究显示 Dlk1/Dio3 域印记基因表达对胎儿生长、人类青春期时机、代谢病易感性至关重要。研究提示 IG-DMR 决定 Gtl2 启动子 DMR 等位基因甲基化状态，进而控制整个 Dlk1/Dio3 区基因表达。该印记控制区主要功能是将生殖细胞驱动的 DNA 甲基化作为配子信号遗传，后在体细胞中维持后续等位基因特异性 DNA 甲基化模式。本研究证实 SiO₂ NPs 诱导肺睾组织 Dlk1/Dio3 区表达改变。该区父源表达基因 (Dlk1, Rtl1, Dio3) 在 NP 处理后与对照相比尤为异常。亚硫酸氢盐测序显示肺睾不同程度低甲基化。处理组 IG-DMR 甲基化状态普遍较低，这种低甲基化可能代表印记基因差异表达的机制。

结论

综上，SiO₂ NPs 暴露可能诱导重要 DNA 甲基化改变进而触发细胞损伤，这些改变对 Dlk1/Dio3 印记基因簇表达高度重要。重要的是，DNA 甲基化变化同时影响肺和睾丸组织。这些结果为未来研究暴露模型后代遗传的表观基因组效应及阐明介导此类表观遗传改变的分子机制奠定重要作用。

缩略语

BALF:

支气管肺泡灌洗液

CCK-8:

细胞计数试剂盒-8

DMRs:

差异甲基化区域

EGFR:

表皮生长因子受体

IG-DMR:

基因间 DMR

MPs:

微粒

NPs:

纳米颗粒