氧化碳纳米管功能化多柔比星与荧光素的毒性与治疗潜力：体外与体内研究

摘要

本研究考察氧化多壁碳纳米管 (CNTox)、多柔比星功能化碳纳米管 (CNT-Dox) 和荧光素功能化碳纳米管 (CNT-FITC) 对 HT29 结肠腺癌细胞和 BALB/c 小鼠的细胞毒性。证明多柔比星可通过肽键共价锚定于 CNTs，显著降低其即时细胞毒性。胰蛋白酶酶解释放多柔比星，恢复其效力，且 CNT-Dox 与胰蛋白酶联用产生协同效应。体内实显示 CNT-Dox 系统毒性低于游离多柔比星，仅轻度升高肝酶和血细胞参数，而 CNTox 基本无毒。结果支持利用 CNTs 作为强效抗癌药物的可控释放载体。

研究背景

碳纳米管 (CNTs) 具高比表面积、优异细胞摄取和穿透生物膜能力，是药物递送、基因治疗和成像应用的理想载体。亲水基团官能化改善溶解性和生物相容性，治疗分子共价连接可实现靶向可控释放。多柔比星 (Dox) 为广泛使用的化疗药但系统毒性大；连接至 CNTs 可减少脱靶效应并增强肿瘤特异性。前人研究表明低剂量 CNTs 安全，但高浓度或表面化学不当可诱导氧化应激、炎症和器官富集。本研究在此基础上评估 CNT-Dox 和 CNT-FITC 的体内外安全性。

实验方法

HT29 结肠腺癌细胞以 2D 单层和 3D 球状体培养。CNTs 经化学气相沉积合成，70% HNO₃ 氧化，再经碳二亚胺化学偶联多柔比星或荧光素。悬液经超声、灭菌，用 SEM、Zeta 电位、FTIR 表征。MTT 和克隆面积法评价细胞毒性。为研究可控释放，加入胰蛋白酶 (0.05–70%) 评估多柔比星释放。体内实验：BALB/c 小鼠腹腔注射 CNTox (1.5 mg kg⁻¹)、CNT-Dox (1.5 mg kg⁻¹) 或游离 Dox (20 mg kg⁻¹)，每 3 天一次，共 4 周。治疗期结束后测定血清生化指标 (ALT, AST, ALP, 总蛋白, 白蛋白) 和血液学参数 (RBC, WBC, 血小板, 血红蛋白)。

结果与讨论

纳米颗粒表征

SEM 确认多壁 CNTs 直径 10–60 nm、长度 20–500 µm，官能化未改变形貌。Zeta 电位显示 CNT-Dox (-28 mV)、CNT-FITC (-32 mV)、CNTox (-36 mV)，胶体稳定性良好。FTIR 呈现特征酰胺 I、II 带，确证多柔比星和荧光素共价结合于 CNTs。

体外细胞毒性

MTT 实验揭示剂量依赖性细胞毒性：CNTox IC₅₀ ≈ 100 µg mL⁻¹，CNT-FITC IC₅₀ ≈ 50 µg mL⁻¹。无蛋白酶时 CNT-Dox 细胞毒性极低 (IC₅₀ > 200 µg mL⁻¹)，反映多柔比星被隔离。加入 0.05% 胰蛋白酶后，CNT-Dox 释放游离多柔比星，IC₅₀ 降至 ≈5 µg mL⁻¹，细胞活力协同降至 ≤10% 对照水平。克隆面积实验证实 CNT-FITC 显著抑制克隆形成，而 CNT-Dox 无蛋白酶时效应微弱。3D 球状体培养中，CNTox 剂量依赖性增加球体体积，CNT-FITC 减小球体，CNT-Dox 无显著效应除非蛋白酶介导释放。

体内毒性

血清分析显示 CNTox 单独使用不改变 ALT、AST、ALP 水平。CNT-Dox 和游离 Dox 均升高 AST (最高 126%) 和 ALP (最高 148%)，但 CNT-Dox 升幅较温和。总蛋白各组均轻度升高。血液学显示游离 Dox 导致贫血、血小板减少和中性粒细胞减少，CNT-Dox 引起类似但较轻变化，CNTox 对血细胞计数影响可忽略。提示 CNT-Dox 在保持抗肿瘤效力的同时减轻了系统毒性。

结论

氧化 CNTs 经肽键功能化多柔比星构建了安全、可控释放纳米载体，较游离药物降低系统毒性。体外实验中 CNT-Dox 惰性维持至蛋白酶切割释放药物后，细胞毒性媲美游离多柔比星。体内 CNT-Dox 肝酶升高和血液学毒性均低于游离 Dox，而 CNTox 基本无毒。结果支持进一步开发基于 CNTs 的递送系统用于高效抗癌药物，特别是胃肠道恶性肿瘤中可利用蛋白酶活性触发靶向释放。

缩略语

Al

白蛋白

ALP

碱性磷酸酶

ALT

丙氨酸氨基转移酶

AST

天冬氨酸氨基转移酶

CNT-Dox

多柔比星功能化碳纳米管

CNT-FITC

荧光素功能化碳纳米管

CNTox

氧化碳纳米管

CNTs

碳纳米管

Dox

多柔比星

FTIR

傅里叶变换红外光谱

MTS

多细胞肿瘤球体

MWCNTs

多壁碳纳米管

PTX

紫杉醇

Tp

总蛋白