M1巨噬细胞来源外泌体miR-326通过调控NF-κB信号抑制肝细胞癌进展

摘要

越来越多证据表明，M1巨噬细胞来源外泌体衍生的微小RNA（miR）可调控肝细胞癌（HCC）进展。但M1巨噬细胞外泌体来源的miR-326对HCC的影响尚未报道。本研究旨在探讨M1巨噬细胞外泌体miR-326调控HCC细胞进展的机制。RT-qPCR检测HCC细胞系miR-326表达；通过转染改变miR-326表达，检测其对CD206、NF-κB表达、细胞增殖、克隆形成、迁移、凋亡和侵袭的影响。随后分离M1巨噬细胞外泌体，RT-qPCR鉴定外泌体miR-326表达，并通过转染改变外泌体miR-326表达。将M1巨噬细胞外泌体与HCC细胞共培养，观察其对HCC细胞生物学行为的影响。最后通过体内实验验证体外结果。结果显示：miR-326在HCC细胞中低表达，在M1巨噬细胞外泌体中富集。上调miR-326抑制HCC细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及CD206、NF-κB表达，促进凋亡，体内抑制HCC肿瘤生长；下调miR-326效果相反。M1巨噬细胞外泌体抑制HCC细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及CD206、NF-κB表达，增强凋亡；miR-326过表达增强外泌体对HCC细胞的抑制作用。研究揭示：M1巨噬细胞外泌体miR-326通过下调NF-κB表达，抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球第五常见癌症和最常见原发性肝癌。中国国家癌症登记资料显示，原发性肝癌死亡率居第三位，发病率居常见恶性肿瘤第四位。HCC主要危险因素包括丙肝/乙肝病毒慢性感染、黄曲霉毒素污染食品、肥胖、吸烟、大量饮酒和2型糖尿病。经导管动脉化疗栓塞术（TACE）是中晚期HCC公认治疗手段，可改善大多数中晚期患者生存。目前HCC诊断主要依赖血清生物标志物和影像学技术。HCC相关5年生存率仅约60%，且发病率逐年上升。因此，寻找精准治疗靶点是HCC治疗当务之急。

巨噬细胞是免疫系统效应细胞和主要调节者，在组织重塑修复和体内几乎所有组织的代谢功能协调中发挥巨大作用。有研究显示M1巨噬细胞促进肿瘤并增强HCC细胞运动性。外泌体是直径40–150 nm的盘状囊泡。据Xu等报道，外泌体微小RNA（miRNAs）通过调控靶细胞基因表达，影响HCC增殖、侵袭、转移和耐药。研究表明含miR-326外泌体可能是多发性硬化症的潜在临床靶点。miRNAs可作为癌基因或抑癌基因，通过mRNA降解和翻译阻断以特定序列调控大量蛋白编码基因表达。有研究讨论miR-326通过干扰细胞周期进程、促进凋亡抑制HCC细胞生长，并通过减少上皮-间质转化表型抑制细胞侵袭。另一研究报道miR-326可能是HCC患者治疗的潜在靶点。因此，本研究探讨外泌体miR-326调控HCC细胞侵袭迁移的机制。

材料与方法

伦理声明

所有动物实验符合国际委员会《实验动物护理和使用指南》。方案经吉林大学第三医院机构动物护理使用委员会批准。

巨噬细胞诱导与鉴定

人单核细胞系THP-1（中国科学院昆明动物研究所）用含10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基培养。THP-1细胞用150 ng/mL 马尿酸（PMA）处理，RPMI培养基中孵育24 h获得M0巨噬细胞。用Wright染色观察诱导前后细胞形态。THP-1细胞和诱导巨噬细胞重悬于5 μL PBS，滴加载玻片，Wright染液与缓冲液1:2混合，染色10 min，流水冲洗，显微镜观察。此外，RT-qPCR检测M0巨噬细胞标志物（CD68和CD206）。随后用20 ng/mL 干扰素（IFN）-γ 和 10 pg/mL LPS 孵育18 h诱导M1巨噬细胞。RT-qPCR检测M1巨噬细胞标志物（IDO1和IL-12 p35）。

外泌体提取

使用外泌体分离试剂盒（ExoEasy Maxi Kit，Qiagen，德国）。无菌条件下将巨噬细胞上清收集至15 mL离心管，0.8 μm滤膜过滤。各组上清加入XBP缓冲液（1:1），500g离心。加10 mL XWP缓冲液，3000–5000g离心。用400 μL XE洗脱缓冲液孵育外泌体亲和离心柱，500g离心。洗脱液转移至外泌体亲和离心柱，500g离心。洗脱液4 °C放置24 h后鉴定，其余-80 °C保存。

透射电镜（TEM）观察与纳米颗粒追踪分析（NTA）

获取的外泌体滴加碳膜铜网，加2%磷钨酸，TEM观察并收集最佳图像分析。用0.22 μm微孔滤器除去PBS中杂质颗粒。根据外泌体颗粒密度稀释过滤后PBS至适当浓度，用Nanosight NS300纳米颗粒检测仪（Malvern，美国）检测。鉴定后，转染miR-326抑制子及阴性对照（NC）、miR-326模拟物及NC的巨噬细胞外泌体用外泌体分离试剂盒（Invitrogen）提取。

RT-qPCR

Trizol试剂（Thermo Fisher）提取总RNA，SYBR-Green PCR Master Mix（Roche）和ABI 7500实时PCR系统（Life Technologies）进行实时PCR。引物序列见Table 1。采用2⁻ΔΔCt法定量分析。

Western Blot分析

提取细胞和外泌体总蛋白。BCA试剂盒（Boster，武汉）测定蛋白浓度。加样品缓冲液，95 °C煮沸，每孔上样30 μg。10% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭。一抗：CD63（1:1000，Developmental Studies Hybridoma Bank），CD181（1:1000，R&D Systems），GAPDH（1:2000，Jackson ImmunoResearch）；二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔/抗鼠抗体（1:500，Jackson ImmunoResearch）。Odyssey双色红外荧光扫描成像系统获取图像，Quantity One软件分析灰度值。

细胞培养与筛选

正常肝细胞系HL-7702和人HCC细胞系BEL-7404、HepG2、SMMC-7721、QGY-7703用含10% FBS、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 mg/mL）的Gibco RPMI 1640培养。RT-qPCR检测miR-326表达，筛选合适细胞系。

外泌体标记与摄取

外泌体用250 μL稀释液C重悬，轻柔吹打避免损伤膜。PKH67染料（1 μL，Sigma-Aldrich）加入250 μL稀释液C至500 μL，孵育。加500 μL 1% BSA，37 °C孵育1 min。120,000g，4 °C离心2 h获取外泌体。PKH67标记外泌体同样离心获取。外泌体用6 mL RPMI-1640培养基避光重悬。标记外泌体与HCC细胞共培养12 h。移除培养基，PBS洗涤3次，每次5 min，彻底洗去未被HCC细胞内化的荧光外泌体。4%多聚甲醛固定，4′-6-二脒基-2-苯基吲哚染色。封片后激光共聚焦显微镜观察荧光分布。

细胞分组与处理

HepG2和SMMC-7721细胞接种于12孔板，密度0.5–1×10⁶ cells/well。50–60%融合度时用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染。HepG2分为miR-326模拟物组（转染miR-326模拟物）和NC模拟物组（转染miR-326模拟物NC）。SMMC-7721分为miR-326抑制子组（转染miR-326抑制子）和NC抑制子组（转染miR-326抑制子NC）。miR-326模拟物、抑制子及其NC与Lipofectamine 2000混合转染。未处理HepG2和SMMC-7721设为空白组。miR-326模拟物、抑制子及NC由广州瑞博生物有限公司设计合成（Table 1）。

M1巨噬细胞外泌体与HCC细胞共培养

BCA法测定M1巨噬细胞外泌体悬液蛋白浓度，计算含50 μg蛋白的外泌体悬液体积。HepG2和SMMC-7721接种于12孔板，1×10⁵ cells/mL/well。HepG2分4组：对照组（不共培养外泌体）、外泌体组（共培养M1巨噬细胞外泌体）、外泌体-miR-326模拟物组（共培养转染miR-326模拟物的M1巨噬细胞外泌体）、外泌体-NC模拟物组（共培养转染miR-326模拟物NC的M1巨噬细胞外泌体）。SMMC-7721同样分4组：空白组、外泌体组、外泌体-miR-326抑制子组、外泌体-NC抑制子组。

MTT实验

胰蛋白酶消化细胞，96孔板接种4×10⁴ cells/well。分别培养12、24、36、48、60 h后弃培养基。加500 μL 0.5 g/L MTT溶液孵育，加200 μL DMSO吹打溶解。酶标仪测OD₄₉₀值。

克隆形成实验

培养24 h，胰酶消化，35 mm小皿接种300 cells/皿。每3天换液。培养10 d后，40 g/L多聚甲醛固定，1 g/L结晶紫染色干燥。显微镜下计数克隆数（>50 cells）。

Transwell实验

1×10⁵ cells用200 μL无血清培养基重悬。按Transwell小室（Corning）说明操作（侵袭实验需铺Matrigel，迁移实验不需）。下室加600 μL 10% FBS RPMI 1640。上下室以Matrigel预包被的Transwell膜分隔（BD Biosciences）。培养24 h，95%酒精固定，结晶紫染色，显微镜下5个视野观察计数。

流式细胞术

细胞周期：胰酶消化，1×10⁶ cells用0.5 mL PBS重悬成单细胞悬液。混合4.5 mL预冷70%乙醇冰上放置，3000g离心，5 mL PBS洗涤，再3000g离心。重悬于1 mL PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100，含0.2 mg RnaseA）。流式检测细胞周期。
细胞凋亡：胰酶消化，1×10⁶ cells用1 mL PBS重悬吹打，3000g离心。依次用孵育缓冲液（10 mmol/L Hepes/NaOH，pH 7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl₂）洗涤，3000g离心。加100 μL标记液（FITC-Annexin V和PI加入孵育缓冲液至1 μg/mL），3000g离心，孵育缓冲液洗涤1次，荧光（SA-FLOUS）液孵育。流式检测凋亡。波长488 nm，FITC荧光515 nm带通滤波器检测，PI>560 nm。计算机自动分析结果。

裸鼠成瘤实验

40只4–6周龄小鼠（吉林大学动物科学学院）随机分8组，每组5只。SPF级动物房饲养1周，及时更换饲料、垫料、水瓶，每日观察健康状况。1周后制备HCC细胞悬液，颈背皮下注射0.1 mL细胞悬液（1×10⁶）。3–5 d后观察肿瘤生长。每4天称重、测量肿瘤体积。注射20 d后处死小鼠。

统计分析

SPSS 17.0软件分析。测量资料表达为均数±标准差。两组比较用t检验，多组比较用单因素方差分析（ANOVA）。P < 0.05为统计学显著差异。

结果

M1巨噬细胞与外泌体鉴定

Wright染色观察PMA诱导THP-1细胞形态。诱导前THP-1细胞体积小、核浆比高；诱导后形态不规则、体积增大、核浆比降低、胞浆丰富呈淡蓝色、颗粒丰富、少量空泡、核紫红色常偏向一侧，呈现巨噬细胞典型形态特征（图1a）。

RT-qPCR检测CD68、CD206表达验证巨噬细胞诱导成功。PMA诱导后CD68、CD206表达升高，表明THP-1成功诱导为M0巨噬细胞（图1b）。随后用LPS和IFN-γ极化M0为M1巨噬细胞。观察形态并检测M1标志物IDO1、IL-12 p35表达。M0巨噬细胞呈多种不规则贴壁形态（圆、椭圆、梭形）；IFN-γ刺激后M1巨噬细胞伪足和突起增多、呈纺锤形（图1c）。RT-qPCR显示（图1d）LPS+IFN-γ处理后M1标志物（IDO1、IL-12p35）上调。

TEM观察巨噬细胞来源外泌体：外泌体丰富、圆形或椭圆形、膜结构完整、大小均一、杂质少（图1e）。NTA显示外泌体MODE曲线峰值集中、线性平滑，直径分布集中、杂质少（图1f）。Western blot显示：相比巨噬细胞，外泌体特异性标志蛋白CD63、CD181表达升高（图1g）。结果表明成功诱导单核细胞分化为巨噬细胞并极化为M1巨噬细胞。

M1巨噬细胞外泌体递送miR-326至HCC细胞并影响其表达

验证M1巨噬细胞外泌体是否转运miR-326至HCC细胞，HepG2和SMMC-7721与外泌体共培养。荧光显微镜下可见大量外泌体于4 h后被HepG2和SMMC-7721摄取（图2a、b）。

随后将miR-326模拟物/抑制子转染巨噬细胞，检测转染前后外泌体miR-326表达。相比M0巨噬细胞外泌体，M1巨噬细胞外泌体miR-326表达升高。miR-326模拟物处理的M1外泌体miR-326表达进一步升高；miR-326抑制子处理的M1外泌体miR-326表达降低（图2c）。

检测HCC细胞系miR-326表达。相比HL-7702，BEL-7404、HepG2、SMMC-7721、QGY-7703中miR-326表达均下调，HepG2表达最低，SMMC-7721最高（图2d）。

将miR-326模拟物和抑制子分别转染HepG2和SMMC-7721，检测对miR-326表达影响。miR-326模拟物上调HepG2中miR-326表达；miR-326抑制子下调SMMC-7721中miR-326表达（图2e、f）。

将转染miR-326模拟物和抑制子的M1巨噬细胞外泌体分别与HepG2和SMMC-7721共培养。共培养外泌体增加HCC细胞miR-326表达；miR-326模拟物转染外泌体进一步升高HepG2中miR-326表达；miR-326抑制子转染外泌体降低SMMC-7721中miR-326表达（图2g、h）。提示M1巨噬细胞外泌体递送miR-326至HCC细胞并影响其表达。

M1巨噬细胞外泌体miR-326降低HCC细胞增殖与克隆形成能力

MTT和克隆形成实验考察外泌体miR-326对HCC细胞增殖影响。HepG2中miR-326恢复损伤增殖和克隆形成能力（图3a、e、f）。M1外泌体阻碍HepG2增殖和克隆形成；miR-326模拟物转染外泌体进一步损伤增殖和克隆形成（图3c、i、j）。

SMMC-7721中miR-326敲低增强增殖和克隆形成能力（图3b、g、h）。M1外泌体处理SMMC-7721降低增殖和克隆形成；miR-326抑制子转染外泌体进一步促进增殖和克隆形成（图3d、k、l）。提示M1巨噬细胞外泌体来源miR-326阻碍HCC细胞增殖。

M1巨噬细胞外泌体miR-326抑制HCC细胞迁移与侵袭

Transwell实验考察外泌体miR-326对HCC细胞侵袭迁移影响。HepG2中miR-326恢复抑制侵袭迁移（图4a–c）。M1外泌体干扰HepG2侵袭迁移；miR-326模拟物转染外泌体共培养进一步降低侵袭迁移（图4g–i）。

miR-326敲低增强SMMC-7721侵袭迁移（图4d–f）。M1外泌体处理降低SMMC-7721侵袭迁移；但miR-326抑制子转染外泌体共培养增强侵袭迁移（图4j–l）。暗示M1巨噬细胞外泌体来源miR-326阻碍HCC细胞侵袭迁移。

M1巨噬细胞外泌体miR-326促进HCC细胞凋亡

PI单染和Annexin V-FITC/PI双染考察外泌体miR-326对HCC细胞周期和凋亡影响。HepG2中miR-326过表达增加G0/G1期细胞比例，减少S和G2/M期比例，升高凋亡（图5a–d）。M1外泌体共培养增加HepG2 G0/G1期比例，减少S和G2/M期比例，升高凋亡；miR-326模拟物转染外泌体共培养进一步增强这些效应（图5i–l）。

SMMC-7721中miR-326下调减少G0/G1期比例，增加S和G2/M期比例，降低凋亡（图5e–h）。未转染M1外泌体增加G0/G1期比例，减少S和G2/M期比例，升高凋亡；miR-326抑制子转染外泌体降低G0/G1期比例，增加S和G2/M期比例，降低凋亡（图5m–p）。综上，M1巨噬细胞外泌体miR-326使HCC细胞G0/G1期阻滞并诱导凋亡。

M1巨噬细胞外泌体miR-326下调HCC细胞CD206和NF-κB表达

探究M1巨噬细胞外泌体miR-326在HCC细胞生物学行为中的潜在机制。NF-κB是炎症与癌症关键环节，许多调节蛋白和miRNAs可抑制过度激活的NF-κB信号抑癌。这种有益效应可能包括M2巨噬细胞向M1极化。RT-qPCR检测HepG2和SMMC-7721中CD206和NF-κB表达。miR-326恢复降低HepG2中CD206和NF-κB表达；miR-326敲低升高SMMC-7721中CD206和NF-κB表达（图6a、b）。此外，M1外泌体共培养显著降低HepG2中CD206和NF-κB表达；miR-326过表达外泌体共培养进一步降低表达。未转染M1外泌体降低SMMC-7721中CD206和NF-κB表达；miR-326抑制子转染外泌体共培养升高SMMC-7721中CD206和NF-κB表达（图6c、d）。结论：M1巨噬细胞外泌体miR-326通过抑制NF-κB在HCC细胞中发挥抑癌作用。

M1巨噬细胞外泌体miR-326体内抑制HCC肿瘤生长

肿瘤异种移植验证体内结果。miR-326过表达降低HepG2移植瘤体积和重量（图7a–c）。HepG2共培养外泌体的小鼠中，M1外泌体显著降低肿瘤体积重量；miR-326过表达外泌体进一步降低（图7g–i）。

SMMC-7721中miR-326抑制增加肿瘤体积重量（图7d–f）。未转染M1外泌体阻碍SMMC-7721肿瘤生长；miR-326抑制子转染外泌体共培养SMMC-7721注射小鼠增加肿瘤体积重量（图7j–l）。总之，M1巨噬细胞外泌体miR-326体内抑制HCC肿瘤生长。

讨论

HCC是高发病率、高死亡率、早期诊断困难、预后差、5年生存率低的常见癌症。近期研究强调低表达lncRNA cox-2降低M1巨噬细胞抑制HCC生长、侵袭、血管生成、迁移和促进凋亡能力。Hu等指出miR-326在HCC组织和细胞系明显下调，下调miR-326与HCC患者TNM分期、淋巴结转移、分化相关。公认HCC细胞来源外泌体形成有利微环境促进HCC生长、侵袭、转移及耐药。本研究旨在探讨外泌体miR-326调控HCC侵袭迁移机制。

结果显示miR-326在HCC细胞中低表达、外泌体中高表达。近期研究指出miR-326在HCC组织下调；另一研究显示miR-326在HCC细胞系和组织显著降低，下调预示预后差；报道miR-326作为抑癌因子在HCC中大幅下调。这些证据与本研究一致。有研究称复发缓解型多发性硬化患者Tconv来源外泌体中miR-326表达升高。

高表达外泌体miR-326体外抑制HCC细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭，促进凋亡，体内减少肿瘤体积重量。此前研究提示miR-326过表达抑制HCC生长，上调miR-326显著减弱HCC迁移侵袭能力；上调miR-326抑制HCC生长侵袭并促进凋亡；过表达miR-326体内抑制肿瘤生长；异位表达miR-326显著减弱非小细胞肺癌细胞系生长、迁移、侵袭；miR-326下调MMP-9等促纤维化基因，暗示抑制癌细胞增殖；miR-326抑制Bcl-2、上调Bax影响凋亡。类似地，一些miRNAs与外泌体相互作用参与HCC发展。高表达外泌体miR-638可抑制HCC增殖，涉及致癌潜在影响；HCC来源外泌体miR-451a通过破坏内皮细胞凋亡、管形成、迁移、通透性抑制肿瘤血管生成；过表达miR-744外泌体显著抑制HCC增殖。

结论

简言之，本研究证实M1巨噬细胞外泌体miR-326抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡，为HCC靶向治疗提供新见解。受限于样本量和现有研究，miR-326确切机制尚未完全阐明，需进一步大规模研究揭示潜在机制。

缩写

HCC:

肝细胞癌

miRNAs:

微小RNA

FBS:

胎牛血清

M/CSF:

巨噬细胞集落刺激因子

PBS:

磷酸盐缓冲液

DMEM:

杜尔贝cco改良鹰培养基

PPAR:

过氧化物酶体增殖物激活受体

TEM:

透射电镜

NTA:

纳米颗粒追踪分析

NC:

阴性对照

RT-qPCR:

逆转录定量聚合酶链反应

BCA:

双氰胺酸

BSA:

牛血清白蛋白

Exo:

外泌体

ANOVA:

单因素方差分析